Summary

Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa

Published: June 26, 2018
doi:

Summary

Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.

Abstract

Citocinas desempenham um papel crucial na patogênese de doenças auto-imunes. Daí, a medição dos níveis de citocina tem sido o foco de vários estudos na tentativa de compreender os mecanismos precisos que levam ao colapso da auto-tolerância e auto-imunidade subsequente. Abordagens, até agora tem sido baseadas no estudo de um aspecto específico do sistema imunológico (um único ou alguns tipos de células ou citocinas) e não oferecer uma avaliação global da doença auto-imune complexa. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas. Uma abordagem abrangente de célula única para avaliar a produção de citocinas em vários subconjuntos de células imunes, dentro do contexto de “intrínseco” plasma paciente específico, fatores, de circulação é descrita aqui. Esta abordagem permite a monitoração do paciente específico imune fenótipo (marcadores de superfície) e função (citocinas), quer na sua nativa “intrínseco patogénicos” doença estadual, ou na presença de agentes terapêuticos (em vivo ou ex vivo).

Introduction

As doenças auto-imunes são das principais causas de morbidade e mortalidade, afetando 3-8% da população. Nos Estados Unidos, desordens auto-imunes estão entre as principais causas de morte entre as mulheres jovens e de meia-idade (idades < 65 anos)1,2. Doenças auto-imunes são caracterizadas por apresentação clínica heterogênea e diversos processos imunológicos subjacentes. O espectro da heterogeneidade está bem representado através de diferentes transtornos, tais como a participação conjunta em artrite reumatoide (ar) e doença neurológica em esclerose múltipla (MS). No entanto, este nível de heterogeneidade também é exemplificado dentro de um único distúrbio, tais como Lúpus eritematoso sistémico (SLE): alguns pacientes podem apresentar com patologia renal, enquanto outros sofrem de envolvimento hematológicas ou comum3.

A imunopatogênese subjacente em desordens auto-imunes espelha a heterogeneidade clínica, envolvendo autoe hiperativação de vários subconjuntos de célula imune inata e adaptativa e desregulação concomitante produção de citocinas. Enquanto citocinas desempenham um papel crucial na patogênese da doença auto-imune, compreender o seu papel específico no mecanismo da doença tem provado para ser um desafio. Citocinas são caracterizadas por pleiotropia (uma citocina pode ter vários efeitos sobre diferentes tipos de células), redundância (várias citocinas podem ter o mesmo efeito), a dualidade (uma citocina pode ter efeitos pro ou anti angentes sob condições diferentes), e plasticidade (citocinas podem ser moldadas em um papel diferente do seu “original”, dependendo do ambiente)4,5,6. Consequentemente, métodos de nível populacional não consegue distinguir heterogêneas respostas celulares para a mesma “cytokine milieu”. Da mesma forma, os projetos de estudo que se concentram em um aspecto específico do sistema imunológico (um único tipo de células ou citocinas), não oferecem uma avaliação global de todos os elementos envolvidos na complexa doença auto-imune. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas.

Recentemente, desenvolvemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico “” plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. O fluxo de trabalho descrito aqui é caracterizado pelo uso de amostras de sangue periférico intacto, ao contrário de células mononucleares de sangue periférico isolado (PBMC). Sangue periférico representa o veículo fisiologicamente mais relevante para estudar a doença imune-mediada sistêmica, incluindo células de sangue 1) não-mononucleares frequentemente envolvidos em doenças autoimunes (isto é, neutrófilos, plaquetas) e 2) plasma circulantes de fatores, tais como ácidos nucleicos, complexos imunes e citocinas, que têm funções de ativação imunes. Para capturar o “intrínseco patogénicos” desregulação produção de citocinas, as amostras são processadas imediatamente após a recolha de sangue (T0, tempo zero) e após 6 horas de incubação a 37 ° C (temperatura do corpo fisiológico) com um transporte de proteína do sangue periférico inibidor na ausência de qualquer condição estimulante exógena (T6, tempo 6 h), para detectar a produção de citocinas (acumulação, T6-T0) que iria reflectir o estado de doença “intrínseco” (Figura 1). Para estudar os processos de desregulação que refletem sobre ou sob ativação da sinalização de caminhos envolvidos em respostas imunes pertinentes à doença, amostras de sangue periférico são tratados (incubação de 6 h a 37 ° C, com um inibidor de transporte de proteína) com uma exógena estimulando a condição que reflete a patogênese da doença, tais como agonistas do Receptor Toll-Like (TLR) no caso de SLE (T6 + R848, tempo 6 h com R848 de 1 µ g/mL), para detectar a produção de citocinas que refletisse uma resposta aos ácidos nucleicos (comparando T0 vs T6 vs T6 + R848, Figura 1). Para estudar os efeitos imunomoduladores de terapêutica disponível ex vivo, como dizem respeito aos processos de desregulação imune precisos para pacientes específicos, amostras de sangue periférico são tratadas com um inibidor JAK no relevantes terapêutico concentração (aqui, 5 hum ruxolitinib; T6 + 5R, tempo 6 h com 5 hum ruxolitinib), para detectar alterações no estado de doença “intrínseco” em resposta à droga (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figura 1). Um inibidor JAK foi escolhido para este estudo porque inibidores JAK foram mostrados para ser bem sucedido no tratamento de doenças auto-imunes como Rá

Para avaliar simultaneamente os processos de desregulação descritos acima em vários subconjuntos de células imunes, amostras de sangue periférico de SLE pacientes e controles saudáveis foram processados conforme descrito acima e analisadas por citometria de massa. Citometria de massa, também conhecido como citometria-tempo-de-voo, oferece análises de célula única de mais de 40 parâmetros sem problemas de espectral se sobrepõem7,8,9. Esta técnica utiliza isótopos metal de terra rara na forma de íons metálicos solúveis como tags vinculados aos anticorpos, ao invés de fluorophores10. Detalhes adicionais sobre a plataforma tecnológica de citometria em massa (ou seja, ajuste e calibração, aquisição de amostra) podem ser encontrados em Leipold et al e McCarthy et al 11 , 12 a alta-dimensionalidade da citometria de massa permite a medição simultânea de várias citocinas ao longo de subconjuntos de célula imune inata e adaptativa com granularidade de célula única (Tabela de materiais).

Parâmetros clínicos e laboratoriais convencionais atuais muitas vezes não são sensível ou específico o suficiente para a detecção de atividade da doença em curso ou a resposta de imunomoduladores específico13, refletindo a necessidade de melhor delinear o imunológico subjacente mudanças que impulsionam a flare-ups. Dada a abrangência do cytokine dysregulation na doença auto-imune, tem uma infinidade de abordagens de tratamento que usam anticorpos ou inibidores moleculares pequenos direcionamento citocinas ou sinalização de proteínas envolvidas na regulação da produção de citocinas recentemente surgiram. No seu formato básico, a abordagem analítica de sangue periférico, descrita aqui fornece uma plataforma para identificar subconjuntos de células específicas do paciente prejudicado e sua produção de citocina anormal na doença auto-imune com manifestações sistêmicas. Esta metodologia permite a personalização de opções terapêuticas como citocinas desregulação específicos podem ser identificadas, e tratamento específico, as opções podem ser testadas ex vivo para avaliar sua capacidade de immunomodulate a paciente doença específica processo.

Protocol

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por o Colorado múltiplos institucional Review Board (COMIRB) da Universidade do Colorado. Todos os procedimentos descritos abaixo devem ser executados em uma capa de cultura de tecidos estéreis, salvo indicação em contrário, com pontas de pipetas filtrada, e todos os reagentes filtrada. 1. preparação dos reagentes para o processamento de sangue periférico Prepare ruxolitinib estoque alíquotas (10 – 15 μL/frasco para uso ind…

Representative Results

A Figura 1 demonstra o fluxo de trabalho para a estimulação e processamento das amostras de sangue periférico, incluindo a alocação das alíquotas de amostra de sangue, sincronismo da adição de agentes de estimulação, proteína de transporte inibidor cocktail e incubação vezes até o lysis da pilha de sangue vermelha (RBC) e fixação. A escolha dos agentes estimulantes dependerá as vias de sinalização e citocinas que são direcionadas para a av…

Discussion

Aqui descrevemos um romance, unicelulares, abordagem proteômica para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico “” plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. Este método emprega o sangue periférico como o veículo analítico e citometria de massa como a ferramenta para a avaliação de anormalidades fenotípicas e funcionais de celulares imunes. O método é prontamente aplicável a estudos de humanos e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual e comentários úteis Aimee Pugh-Bernard. Este trabalho foi apoiado pelo Boettcher Fundação Webb-Waring Biomedical Research Award e prêmio número K23-1K23AR070897 do NIH para Elena W.Y. Hsieh. Ela também foi apoiada pelo prêmio número K12-HD000850 de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano e a Lucile Packard Foundation para saúde infantil, Stanford CTSA UL1 TR001085 e pesquisa de saúde infantil Instituto da Stanford University.

Materials

Ruxolitinib Santa Cruz SC-364729A Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM
R848 Invivogen tlrl-r848-5 Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL
LPS-EK Invivogen tlrl-eklps Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL
Sterile PBS Lonza 17-516F
Lyse/Fix Buffer BD biosciences 558049 Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)
 BD Phosflow perm/wash buffer I BD biosciences 557885 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)
RPMI Gibco 21870-076
Sodium Azide (NaN3) Sigma-Aldrich S-8032 Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
Protein Transport Inhibitor (PTI) eBiosciences 00-4980-93 Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X
DNA Intercalator Fluidigm 201192B Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM
Cell Staining Media (CSM) PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Barcode Perm Buffer Fluidigm 201057 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-plex Pd Barcode Set Fluidigm S0014 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
EQ TM Four Element Calibration Beads Fluidigm 201078 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
16% MeOH-free Formaldehyde Solution Thermo 28908 Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
Sterile round bottom polystyrene tubes VWR 60818-496 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Polypropylene cluster tubes Light Labs A-9001 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF instrument Fluidigm Helios All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies used for Mass Cytometry
Surface markers
CD1c Biolegend L161 Mass: 161
CD3 BD UCHT1 Mass: 144
CD4 Biolegend SK3 Mass: 174
CD7 BD M-T701 Mass: 149
CD8 Biolegend SK1 Mass: 142
CD11b Fluidigm ICRF44 Mass: 209
CD11c BD B-ly6 Mass: 152
CD15 BD HI98 Mass: 115
CD14 Biolegend M5E2 Mass: 154
CD16 eBioscience/Thermo B73.1 Mass: 165
CD19 Santa Cruz SJ25C1 Mass: 163
CD21 Biolegend Bu32 Mass: 141
CD27 BD L128 Mass: 155
CD38 Fluidigm HIT2 Mass: 172
CD45 total Biolegend HI30 Mass: 89
CD45RA Biolegend HI100 Mass: 153
CD56 Miltenyi REA196 Mass: 168
CD66 BD B1.1/CD66 Mass: 113
CD86 Fluidigm IT2.2 Mass: 150
CD123 Fluidigm 6H6 Mass: 143
CD278/ICOS Biolegend C398.4A Mass: 156
CD179/PD1 Biolegend EH12.2H7 Mass: 162
IgD Biolegend IA6-2 Mass: 146
IgM Biolegend MHM-88 Mass: 151
CXCR5 BD RF8B2 Mass: 173
HLADR Biolegend L243 Mass: 167
Cytokines
IL-1α Biolegend 364-3B3-14 Mass: 147
IL-1β Biolegend  H1b-98 Mass: 169
IL-1RA Santa Cruz  AS17 Mass: 157
IL-6 Biolegend MQ2-13A5 Mass: 164
IL-8 BD E8N1 Mass: 160
IL-12/IL-23p40 Biolegend  C8.6 Mass: 171
IL-17A Biolegend  BL168 Mass: 148
IL23p19 eBioscience/Thermo 23dcdp Mass: 176
MIP1β BD D21-1351 Mass: 158
MCP1 BD 5D3-F7 Mass: 170
IFNα Miltenyi  LT27:295 Mass: 175
IFNγ Biolegend 4S.B3 Mass: 165
PTEN BD A2B1 Mass: 159
TNFα Biolegend Mab11 Mass: 166
Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling  Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. 

References

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Baxter, R. M., Kong, D. S., Garcia-Perez, J. E., O’Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry. J. Vis. Exp. (136), e57780, doi:10.3791/57780 (2018).

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