Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa
Summary
Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.
Abstract
Citocinas desempenham um papel crucial na patogênese de doenças auto-imunes. Daí, a medição dos níveis de citocina tem sido o foco de vários estudos na tentativa de compreender os mecanismos precisos que levam ao colapso da auto-tolerância e auto-imunidade subsequente. Abordagens, até agora tem sido baseadas no estudo de um aspecto específico do sistema imunológico (um único ou alguns tipos de células ou citocinas) e não oferecer uma avaliação global da doença auto-imune complexa. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas. Uma abordagem abrangente de célula única para avaliar a produção de citocinas em vários subconjuntos de células imunes, dentro do contexto de “intrínseco” plasma paciente específico, fatores, de circulação é descrita aqui. Esta abordagem permite a monitoração do paciente específico imune fenótipo (marcadores de superfície) e função (citocinas), quer na sua nativa “intrínseco patogénicos” doença estadual, ou na presença de agentes terapêuticos (em vivo ou ex vivo).
Introduction
As doenças auto-imunes são das principais causas de morbidade e mortalidade, afetando 3-8% da população. Nos Estados Unidos, desordens auto-imunes estão entre as principais causas de morte entre as mulheres jovens e de meia-idade (idades < 65 anos)1,2. Doenças auto-imunes são caracterizadas por apresentação clínica heterogênea e diversos processos imunológicos subjacentes. O espectro da heterogeneidade está bem representado através de diferentes transtornos, tais como a participação conjunta em artrite reumatoide (ar) e doença neurológica em esclerose múltipla (MS). No entanto, este nível de heterogeneidade também é exemplificado dentro de um único distúrbio, tais como Lúpus eritematoso sistémico (SLE): alguns pacientes podem apresentar com patologia renal, enquanto outros sofrem de envolvimento hematológicas ou comum3.
A imunopatogênese subjacente em desordens auto-imunes espelha a heterogeneidade clínica, envolvendo autoe hiperativação de vários subconjuntos de célula imune inata e adaptativa e desregulação concomitante produção de citocinas. Enquanto citocinas desempenham um papel crucial na patogênese da doença auto-imune, compreender o seu papel específico no mecanismo da doença tem provado para ser um desafio. Citocinas são caracterizadas por pleiotropia (uma citocina pode ter vários efeitos sobre diferentes tipos de células), redundância (várias citocinas podem ter o mesmo efeito), a dualidade (uma citocina pode ter efeitos pro ou anti angentes sob condições diferentes), e plasticidade (citocinas podem ser moldadas em um papel diferente do seu “original”, dependendo do ambiente)4,5,6. Consequentemente, métodos de nível populacional não consegue distinguir heterogêneas respostas celulares para a mesma “cytokine milieu”. Da mesma forma, os projetos de estudo que se concentram em um aspecto específico do sistema imunológico (um único tipo de células ou citocinas), não oferecem uma avaliação global de todos os elementos envolvidos na complexa doença auto-imune. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas.
Recentemente, desenvolvemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico “” plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. O fluxo de trabalho descrito aqui é caracterizado pelo uso de amostras de sangue periférico intacto, ao contrário de células mononucleares de sangue periférico isolado (PBMC). Sangue periférico representa o veículo fisiologicamente mais relevante para estudar a doença imune-mediada sistêmica, incluindo células de sangue 1) não-mononucleares frequentemente envolvidos em doenças autoimunes (isto é, neutrófilos, plaquetas) e 2) plasma circulantes de fatores, tais como ácidos nucleicos, complexos imunes e citocinas, que têm funções de ativação imunes. Para capturar o “intrínseco patogénicos” desregulação produção de citocinas, as amostras são processadas imediatamente após a recolha de sangue (T0, tempo zero) e após 6 horas de incubação a 37 ° C (temperatura do corpo fisiológico) com um transporte de proteína do sangue periférico inibidor na ausência de qualquer condição estimulante exógena (T6, tempo 6 h), para detectar a produção de citocinas (acumulação, T6-T0) que iria reflectir o estado de doença “intrínseco” (Figura 1). Para estudar os processos de desregulação que refletem sobre ou sob ativação da sinalização de caminhos envolvidos em respostas imunes pertinentes à doença, amostras de sangue periférico são tratados (incubação de 6 h a 37 ° C, com um inibidor de transporte de proteína) com uma exógena estimulando a condição que reflete a patogênese da doença, tais como agonistas do Receptor Toll-Like (TLR) no caso de SLE (T6 + R848, tempo 6 h com R848 de 1 µ g/mL), para detectar a produção de citocinas que refletisse uma resposta aos ácidos nucleicos (comparando T0 vs T6 vs T6 + R848, Figura 1). Para estudar os efeitos imunomoduladores de terapêutica disponível ex vivo, como dizem respeito aos processos de desregulação imune precisos para pacientes específicos, amostras de sangue periférico são tratadas com um inibidor JAK no relevantes terapêutico concentração (aqui, 5 hum ruxolitinib; T6 + 5R, tempo 6 h com 5 hum ruxolitinib), para detectar alterações no estado de doença “intrínseco” em resposta à droga (T0 vs T6 vs T6 + 5R, Figura 1). Um inibidor JAK foi escolhido para este estudo porque inibidores JAK foram mostrados para ser bem sucedido no tratamento de doenças auto-imunes como Rá
Para avaliar simultaneamente os processos de desregulação descritos acima em vários subconjuntos de células imunes, amostras de sangue periférico de SLE pacientes e controles saudáveis foram processados conforme descrito acima e analisadas por citometria de massa. Citometria de massa, também conhecido como citometria-tempo-de-voo, oferece análises de célula única de mais de 40 parâmetros sem problemas de espectral se sobrepõem7,8,9. Esta técnica utiliza isótopos metal de terra rara na forma de íons metálicos solúveis como tags vinculados aos anticorpos, ao invés de fluorophores10. Detalhes adicionais sobre a plataforma tecnológica de citometria em massa (ou seja, ajuste e calibração, aquisição de amostra) podem ser encontrados em Leipold et al e McCarthy et al 11 , 12 a alta-dimensionalidade da citometria de massa permite a medição simultânea de várias citocinas ao longo de subconjuntos de célula imune inata e adaptativa com granularidade de célula única (Tabela de materiais).
Parâmetros clínicos e laboratoriais convencionais atuais muitas vezes não são sensível ou específico o suficiente para a detecção de atividade da doença em curso ou a resposta de imunomoduladores específico13, refletindo a necessidade de melhor delinear o imunológico subjacente mudanças que impulsionam a flare-ups. Dada a abrangência do cytokine dysregulation na doença auto-imune, tem uma infinidade de abordagens de tratamento que usam anticorpos ou inibidores moleculares pequenos direcionamento citocinas ou sinalização de proteínas envolvidas na regulação da produção de citocinas recentemente surgiram. No seu formato básico, a abordagem analítica de sangue periférico, descrita aqui fornece uma plataforma para identificar subconjuntos de células específicas do paciente prejudicado e sua produção de citocina anormal na doença auto-imune com manifestações sistêmicas. Esta metodologia permite a personalização de opções terapêuticas como citocinas desregulação específicos podem ser identificadas, e tratamento específico, as opções podem ser testadas ex vivo para avaliar sua capacidade de immunomodulate a paciente doença específica processo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um romance, unicelulares, abordagem proteômica para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico “” plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. Este método emprega o sangue periférico como o veículo analítico e citometria de massa como a ferramenta para a avaliação de anormalidades fenotípicas e funcionais de celulares imunes. O método é prontamente aplicável a estudos de humanos e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual e comentários úteis Aimee Pugh-Bernard. Este trabalho foi apoiado pelo Boettcher Fundação Webb-Waring Biomedical Research Award e prêmio número K23-1K23AR070897 do NIH para Elena W.Y. Hsieh. Ela também foi apoiada pelo prêmio número K12-HD000850 de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano e a Lucile Packard Foundation para saúde infantil, Stanford CTSA UL1 TR001085 e pesquisa de saúde infantil Instituto da Stanford University.
Materials
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
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