Summary
Субстратов с жесткостью в диапазоне килопаскаль полезны для изучения реакции клеток физиологически соответствующей жесткости микро среды. Используя просто widefield флуоресцентным микроскопом, Юнга мягкие силиконовые гели могут быть определены с помощью отступов с подходящей сфере.
Abstract
Мягких тканей в организме человека, как правило, имеют жесткость в диапазоне килопаскаль (kPa). Соответственно силикона и гидрогелевые гибких подложках было доказано быть полезным субстратов для культивирования клеток в физической микроокружения, который частично имитирует условия в естественных условиях . Здесь мы представляем простой протокол для характеризующие модули Юнга изотропной линейной эластичной субстратов, обычно используется для mechanobiology исследования. Протокол состоит из подготовки субстрата мягкого силикона на Петри блюдо или жесткой силиконовые, покрытие верхней поверхности субстрата силикона с бусами Флюоресцентная, с помощью миллиметровой шкалы сферы для отступа верхней поверхности (по тяжести), визуализации люминесцентные Бусы на поверхности с отступом силикона с помощью микроскопа флуоресценции и анализ результирующего изображения для вычисления Юнга силиконовые подложки. Муфта верхней поверхности субстрата с белков внеклеточного матрикса модулей (кроме флуоресцентный бусины) позволяет силиконовые подложки легко использоваться для ячейки покрытия и последующие исследования, с помощью экспериментов микроскопии силы тяги. Использование жесткой силикона, вместо Петри блюдо, как основа мягкого силикона, позволяет использовать mechanobiology исследований с участием внешних стрейч. Конкретные преимуществом этого протокола является widefield флуоресцентным микроскопом, которая обычно доступна во многих лабораториях, основного оборудования, необходимого для выполнения этой процедуры. Мы демонстрируем это протокол путем измерения Юнга мягкого силикона субстратов различных упругих модулей.
Introduction
Клетки в мягких тканях находятся в микро среды, чьи жесткость находится в килопаскаль диапазона1, в отличие от культуры ткани блюда которого жесткость несколько порядков выше. Первые эксперименты с клетки на внеклеточная матрица белка покрытием мягкие субстраты показал, что жесткость субстрат влияет как клетки двигаться дальше, а также придерживаться внеклеточного матрикса под2,3. В самом деле субстрат жесткость принципиально влияет на функции клеток4 в аналогии с широко распространенной биохимических сигналы. Полиакриламидных гелей (покрытые белков внеклеточного матрикса) (вода проникая) гидрогели, широко использовались как клетки культуры субстратов для mechanobiology исследований5. Полидиметилсилоксан (PDMS), наиболее распространенных силиконовые (полисилоксан), широко используется как жесткая силикона с мегапаскаль диапазона жесткости для изготовления микрон шкала6. Совсем недавно, мягкого силикона, который субстратов с жесткостью в диапазоне более физиологически соответствующих килопаскаль были заняты в качестве подложки культуры клеток для mechanobiology исследования,78.
Некоторые методы были использованы для измерения жесткости гибких подложках, включая атомно-силовой микроскопии, макроскопической деформации всей образцов на растяжение, реологии и отступы с помощью сферы и сферически наконечником microindentors9 . Хотя каждая техника имеет свои преимущества и недостатки, отступы со сферой является особенно простой, но довольно точный метод, который требует только доступ к widefield флуоресцентным микроскопом. Отступы с металлический шар был использован для измерения жесткости гидрогели в предыдущие работы3,9,10. Ранние работы, которая продемонстрировала важность субстрат жесткость клеточного движения использовали этот метод для определения гидрогеля субстрата жесткость3. Совсем недавно конфокальная микроскопия используется также для элегантной характеристика10.
Здесь, мы представляем пошаговые протокол для подготовки субстрата мягкого силикона, муфты флуоресцентные бусины (и белков внеклеточного матрикса, таких как коллаген я) только к верхней поверхности, воображения отступов сферы и верхней поверхности с использованием фазы и флуоресценции изображений, соответственно и, наконец, анализ изображений для вычисления Юнга силиконовые подложки. Мягкие силиконовые подложки, подготовленных таким образом легко может использоваться для тяговой силы микроскопии экспериментов. Использование жесткой силиконовые (вместо чашку Петри) как база для мягкого силикона также позволяет mechanobiology исследования с использованием внешних стрейч. Где это уместно, также указаны практические соображения, необходимые для предотвращения возможных осложнений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление мягкого силикона субстрата
- Весят, 1,75 г компонента A и 1,75 г компонента B (: b = 1:1) из мягкого силикона эластомер комплекта с помощью (полистирол) весом поддонов.
- Добавьте компонент A B компонент в лотке весом и смешивать их вместе в течение 5 мин, используя соответствующие Аппликатор ручки.
- Добавьте выше смеси до 35 мм Петри. Разрешить смесь равномерно распределены по Петри за пару минут.
Примечание: Выбор Петри блюдо диаметр и количество мягкого силикона определит толщина мягкого силикона. Здесь толщина будет около 3,5 мм; Подробнее о выборе толщина эластомера в разделе обсуждения . - Место Петри с силиконовые смеси, с крышкой, в вакуумной камере за 15 минут, чтобы удалить все пузырьки воздуха. В это время подогрева горячей плите до 70 ° C.
- Как только поджарки достигает 70 ° C, место на стеклянное скольжение на него и затем поместите Петри с силиконовые смеси на стеклянное скольжение. Пусть силиконовые лечения при 70 ° C за 30 мин. Не размещайте полистирола блюдо непосредственно на горячей плите, как Петри может расплавить.
2. муфта флуоресцентные микрошарики для мягкого силикона
- Мягкая силиконовая (в открытые Петри) место в подземной камеры УФ (корпус с глубокой УФ-лампы света длиной волны 185 и 254 Нм). Мягкие силиконовые образца (~ 5-10 см от УФ-лампа) подвергайте глубокого Ультрафиолета на 5 мин.
- В то время как силикон подвергается глубокого ультрафиолета, приступайте шаги 2.2-2.6 ниже. После глубокого ультрафиолета Дега подземной камеры УФ для по крайней мере 5 минут до получения образца.
- В то же время весят из 19 мг Карбодиимиды (EDC) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) в пробки microcentrifuge 1,5 мл и добавьте 500 мкл воды деонизированной воды (DI). Растворите EDC, осторожно встряхивая трубки.
- В отдельном 1,5 мл microcentrifuge трубку весят из 11 мг N- hydroxysulfosuccinimide (сульфогруппу NHS), добавить 500 мкл воды ди к нему и распустить сульфогруппу NHS, осторожно встряхивая трубки. Затем объединить EDC и сульфогруппу NHS решения в одном microcentrifuge трубку.
- В этот раствор EDC/сульфогруппу NHS добавьте 30 мкл 0,44 красный Диаметр мкм (или любой другой цвет флуоресценции, основанный на фильтр Кубы, доступные в флуоресцентным микроскопом) карбоксилат изменение флуоресцентные микрошарики (с фондовых концентрации 1% w/v).
- EDC/сульфогруппу стоматология/шарик смесь, добавить 0,02 мг коллагена I (от крыс хвост, запасов концентрации 4 мг/мл в уксусной кислоты 0,02 М) для получения концентрации около 0,02 мг/мл.
- Вихревой EDC/стоматология/шарик/коллагена я смесь кратко обеспечить, что бисер равномерно рассеяны по всему, до сцепления.
- Пипетка 1 мл EDC/стоматология/шарик/коллагена я смесь на кусок парафина, укладывают поверх другой мелкой, плоская крышка (меньшего диаметра). Инвертируйте Петри с мягкого силикона на этой смеси, так что поверхности мягкие силиконовые контакты смесь, но непосредственно не прикасаться к поверхности меньше Петри крышку ниже. Чтобы поднять Перевернутый Петри, используйте один или два стеклянных скольжениях под обе стороны Перевернутый Петри распорки.
Примечание: Обратитесь к рис. 1 , чтобы увидеть, как выполняется шаг 2.7. - Обложка образца с алюминиевой фольгой и проинкубируйте его при комнатной температуре за 30 мин.
- Удаление Петри с мягкого силикона и установить вертикально (силикон стороной вверх).
- Мыть поверхности мягкого силикона с фосфат амортизированное saline (PBS), добавив 2 мл PBS (рН 7,4) на блюдо. Пусть это сидеть в течение нескольких минут. Аспирационная от PBS и мыть силикона снова с 2 мл ФСБ. Пусть силиконовые лечения далее примерно в день. По этой причине Поместите образец мягкого силикона в PBS при 37 ° C на ночь.
3. Измерение жесткость силикона с сфере отступа с помощью микроскопа флуоресценции Widefield
- Получить чашку Петри с мягкого силикона и убедитесь, что он содержит по крайней мере 1 мл PBS иметь силиконовая поверхность несколько мм ниже уровня жидкости.
- Используя острые щипчики, падение пять 1 мм циркония сфере наконечники на мягкого силикона. Погрузите сферы в жидкой среде и поместите их, от края слой силикона и по крайней мере 5 indentor диаметров от местоположения других наконечники.
Примечание: Когда сбросили над поверхностью жидкости, сферах может не вступить в жидкой среде (дробное) из-за жидкой среде поверхностного натяжения. - Поместите Петри с мягкого силикона на микроскопа, так что это возможно к изображению через Петри базы.
- Использование изображений фазы с 10 X цели (например сухой 10 X цель NA 0,30), найти и принести indentor сфере в фокус.
- Возьмите фазы изображение части или весь indentor и сохранить этот образ. Используйте проверку плитки, если таковые имеются. Если indentor имеет каких-либо видимых дефектов, отменить и заменить его на другой indentor.
- Под живой этап визуализации, Пан слева от края indentor так, что левого края фрейма по крайней мере на расстоянии ~1.5 R от центра indentor. Убедитесь, что центр indentor остается видимым на правой стороне, недалеко от правого края кадра. Фаза образ и сохранить его.
- Переключатель Микроскоп источник света для освещения для красных флуоресцентных канала. С x- и y-координаты без изменений ( x-y позицию центра indentor внутри, но у правого края фрейма), фокус вниз (уменьшение Z) до красной флуоресцентной микрошарики под сферу indentor центр как раз пойдите вне фокуса.
- Возьмите z стек с изображения для каждого z приращения 0,5 мкм до микрошарики в верхний слой силикона далеко от indentor (вблизи левого края изображения кадра) пойти вне фокуса.
- Повторите шаги 3.4-3.8 с другими наконечники на образце.
4. Расчет жесткости силиконовые (модуль Юнга)
- Откроем изображение фазы indentor, используя ImageJ, нажмите на инструмент «Линия» и измерить диаметр indentor в пикселях. Нажмите и удерживайте на точку на краю indentor, переместите курсор к диаметрально противоположной точке на краю и отмечаем длины в пикселях, отображается в строке состояния главного окна ImageJ перед выпуском курсор.
- Убедитесь, что единица длины в пиксели, нажав анализ | Задать масштаб и проверка единица длины.
- Преобразовать мкм indentor радиус в пикселах, принимая во внимание объективные увеличение и размер пикселя камеры CCD (R в мкм = R в точках x размер пикселей ПЗС камеры в мкм / цель увеличения).
- Откройте красного канала z стек microbead изображений (если микрошарики красная лампа дневного света) в ImageJ, нажав на файл | Импорт | Изображение последовательности и выберите любое изображение в стеке и нажмите кнопку ОК , чтобы открыть в стек.
Примечание: F1-номер кадра в котором микрошарики под центр indentor находятся в лучших возможных фокус и F2 номер кадра, на котором микрошарики (в регионе ~1.5 R от центра шарик) вблизи левого края фрейма находятся в лучших возможных фокус. Z-разница между двумя кадрами является глубина δ отступа.- Используя инструмент «линия» в ImageJ, нарисуйте линию через четко microbead в изображении. Нажмите кнопку на анализ | Участок профиля и нажмите на кнопку Live , чтобы получить обновленный линии сканирования интенсивности через шарик при выборе различных кадров. Кадр, который дает наибольшее значение максимальной интенсивности может быть выбран как кадр в фокусе.
- Так как z приращение между кадрами в стеке z 0,5 мкм, рассчитать глубину отступ в мкм как δ = (F2-F1) x 0.5.
- Вычислить силу оказываемого на гель, indentor из-за ее веса (минус сопротивляясь сила), то есть, отступы силы F, как объем indentor x (плотность indentor - плотность жидкой среды) x ускорение свободного падения. Использовать уравнения F = (4/3) x 3.142 x (R3) x (ρindentor - ρсреднего) x g , где R — радиус indentor,indentor ρ — плотность indentor, ρсреднего -плотность жидкой среды и g — ускорение свободного падения (9,812). Экспресс всех величин на правой стороне в единицах Си для получения F (в N).
- Вычислите Юнга (E) из силикона, с использованием модифицированных11 Герц модель12 уравнение:
Где:
c = поправочный коэффициент, который изменяет выражение модели Герц, следующим за ним;
v = коэффициент Пуассона силиконового геля (берется как 0,5 а несжимаемой материалы7);
F = усилие отступ;
R = радиус indentor; и
Δ = глубина отступа.
Экспресс всех величин на правой стороне в единицах Си для получения E в ПА.- Вычислите коэффициент коррекции c следующим3:
Где:
; и
.
Следует отметить, что данный поправочный коэффициент специально должно использоваться только тогда, когда мягкие силиконовые придерживается хорошо Петри (или жесткой силиконовые) под ним, (который в данном случае). - Рассчитайте высоту h слоя мягкого силикона, основанный на количестве силиконовые добавил и Петри диаметром. Кроме того, получить h непосредственно путем определения z координата верхней и нижней поверхностей слой силикона на этап визуализации (незначительные примеси вступают в фокус на любой поверхности). Обратите внимание, что для большой h (h2 > Rδ), коэффициент коррекции c близка к 1.
- Вычислите коэффициент коррекции c следующим3:
- Повторите шаги 4.1-4.4 для каждого indentor. Средняя Юнга, полученные от каждого indentor чтобы получить среднее Юнга для образца силикона.
; и
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя протокол, подробно говорилось выше, мы подготовили мягкого силикона в 35 мм Петри, вылечить при 70 ° C за 30 мин и сочетании флуоресцентные микрошарики (и коллаген я) к верхней поверхности как схематично изображены на рисунке 1. Глубокая УФ ранее использовались для возможного белка, муфты для субстратов13. Обратите внимание, что (I) лечения условия, используемые здесь являются специфическими для этого мягкого силикона и (II) измерения отступа производится на следующий день, как мягкого силикона, как ожидается, вылечить немного дальше в течение дня.
Различные параметры, которые характеризуют сферических отступ поверхности силикона показаны на рисунке 2A. Этап визуализации используется для захвата либо (I) все изображение indentor, как показано на рисунке 2B (сшивания изображений, при необходимости, с) или (II) часть изображения сферы. Единственный параметр быть производным от indentor изображения является его диаметр. Например для indentor, которые мы использовали с мягкого силикона 1:1 в настоящем Протоколе, различные индивидуальные наконечники из той же партии имел диаметров, которые варьировались от 950 мкм до 1200 мкм с среднее значение 1037 мкм и стандартное отклонение 47 мкм (8 наконечники). Обратите внимание, что диаметр измерения для конкретного indentor (вместо того, чтобы средний диаметр для многих наконечники) должны использоваться для расчета жесткость для отступа индуцированной этого конкретного indentor.
Флуоресцентного изображения микрошарики в верхней поверхности силикона принимаются на x-y положения кадра, так что региона под indentor находится в крайне правой части кадра. Региона в крайнем левом части кадра выбирается быть регион от indentor, как показано на рисунке 3. Z-стек изображений регионов под indentor и от indentor показано на рисунке 3также. Для indentor циркония диаметром 1 мм, используемый с мягкого силикона 1:1 z значения, в которых 2 регионов вступит в фокус отличались около 20 мкм (δ). Это намного меньше, чем толщина мягкого силикона, который был около 3500 мкм. Использование плотность (4.66 g/см3) цирконий indentor, (который на самом деле состоит из смеси диоксида циркония и кремния диоксид) и плотность жидкости Средний (для PBS: 1,01 г/см3), можно вычислить чистая сила на силикон. Для рассматриваемого дела он был в диапазоне 20-25 µN. Юнга, которую мы вычислить для мягкого силикона 1:1 был 7,2 ± 2,4 кПа (из 28 районов в пул из 6 независимых выборок). Представитель результаты для других: b соотношения для же мягкие силиконовые (указанный в сопроводительные Таблицы конкретных реагентов) приведены в таблице 1. Наконец, чтобы проверить метод отступы сферы, который использует widefield Микроскоп, как описано в настоящем Протоколе, мы также измеряется модули Юнга геля полиакриламида мы характеризуется Реометр иметь Юнга 21 ± 3 кПа. С помощью метода отступ сферы настоящего Протокола с помощью микроскопа widefield, гель полиакриламида того же состава было установлено Юнга 22.1 ± 4,2 кПа, указав на хорошее соглашение10. Предостережения обращать внимание при проведении этих измерений, рассматриваются в разделе обсуждения.
Рисунок 1: схематически процедуры для муфты флуоресцентные микрошарики на верхней поверхности мягкого силикона. (A) мягкого силикона, который был вылечен подвергается глубокой УФ света для EDC, сульфогруппу NHS, бусы, и коллаген смесь 5 мин (B) я в воде является накапаны вниз на кусок парафина, размещены на верхней крышкой меньшего диаметра. (C) мягкого силикона образец обращено на эту смесь так что это контакте жидкости, но не с верхней поверхности меньше крышку под. Два стеклянных скольжениях по обе стороны, под Петри, выступать в качестве распорки. (D) после мытья образца с PBS, мягкие силиконовые поверхности покрыты флуоресцентных микрошарики готова для измерения жесткости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схематическое изображение сфере отступа поверхности мягкого силикона. (A) это схематически показывает сферических indentor на поверхности образца мягкого силикона. Указаны различные параметры интерес. (B) Эта группа показывает изображение 1 мм indentor (на примере мягкого силикона), полученное через этап визуализации. Указывает, шкалы бар 250 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: шарик захвата изображений и решимость в фокус изображения. (A) это изображение флуоресценции микрошарики шоу на верхней поверхности образца мягкого силикона и желаемого x-y расположение кадра относительно indentor (пунктирная линия). Линейки шкалы указывает, что 150 µm. групп B и C Показать z стеке флуоресценции изображения регионов на поверхности мягкого силикона (B) под indentor и (C) от indentor (в штучной упаковке регионов в верхнем изображении). Индикаторы z1 и z2 соответствуют значения z, на которые региона под indentor и регион от indentor находятся в фокусе, соответственно. Шкала индикатора указывают 20 мкм. Монохромные изображения показаны являются полученные в красный канал, поскольку номинально розовый микрошарики использовались, чьи возбуждения и выбросов профили подходят красный канал. (D) группа показывает интенсивность линии сканирования через микро шарик (показано на рисунке врезные с желтой линией через его) как фокус изменяется z-с шагом 0,5 мкм. Фокус (z значение), соответствующие изображения в фокусе можно объективно выбираться на основе z значения, соответствующее линии сканирования с высоким максимальной интенсивности. Указывает, шкалы бар в вставку 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Силиконовые эластомера *: b | Модуль упругости Юнга ** (кПа) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * указанный в сопроводительные таблицы из конкретных реагенты/оборудование ** как измеренные с помощью метода отступ сфере с помощью микроскопа widefield как подробно говорится в настоящем Протоколе |
|
Таблицы 1. Модуль Юнга мягкого силикона (для конкретного силикона, указанные в таблице из конкретных реагенты/оборудование) для различных композиций как измеренные с помощью протокола подробную здесь. Значения соотношения двух смешанного компоненты: b (и соответствующее количество измерений) — 1:1 (28), 4:7 (13) и 1:2 (8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как сфера отступ метод прост в реализации, особое внимание должно уделяться выбор indentor и толщина мягкого силикона образца. Уравнение используется для вычисления Юнга действует под набор условий11и обычно они удовлетворены когда толщина образца силикона-> 10% от радиуса indentor и < ~ 13 x indentor радиус. Мы обнаружили, что силиконовые толщиной 5-10 x indentor радиус был хороший выбор, где толщина образца не слишком высока (т.е., объективные рабочее расстояние не стать ограничение) и рассчитанных жесткости также не слишком чувствительны к точное значение толщины силикона. Выбор сферических indentor также должно быть таким, чтобы отступы глубина δ < 10% толщины силикона, а также < 10% от радиуса indentor. С учетом этих соображений наконечники разных материала и диаметра может использоваться для измерения жесткости мягче и жестче силиконов. Определение глубины отступ является наиболее важным этапом этого протокола. Метод, предложил в этом протоколе для идентификации изображения в фокусе должно помочь достоверно определить глубину отступа. Следует также отметить, что жесткость расчет, используемый для метода отступ сфере использует Hertzian теория, которая предполагает трения контакт. Здесь это хорошая предпосылка наконечники низкой шероховатостью. Хотя мы использовали конкретные мягкого силиконового эластомера (перечислены в сопроводительные Таблицы конкретных реагентов), могут использоваться другие коммерческие силиконовые эластомера комплекты. Обратите внимание, что жесткие силиконовые широко используется для микротехнологий не является хорошим выбором для приготовления субстратов с жесткостью в диапазоне кПа. Однако мягкий силикон (которые имеют жесткость в нижнем конце диапазона кПа) могут быть смешаны с небольшой процент жесткие силиконовые сделать субстратов с жесткостью в высших конце диапазона кПа. В зависимости от эластомер indentor с другой размер или плотности может быть выбран, при условии, что выполнены условия, упомянутые ранее.
Важное значение имеют несколько ключевых соображений для сцепления флуоресцентные микрошарики для мягкого силикона верхней поверхности. Во-первых, мы выбрали 0,44 мкм карбоксилат бусы, потому что их содержание Флюорофор и поэтому яркость была больше, чем у аналогичных бусины меньшего размера. Меньшие размеры бисера может использоваться, если бисер содержат ярче флуорофоров, но мы рекомендуем, что субмикронных карбоксилат бусины должны использоваться так, чтобы не повлиять отрицательно на разрешение метода. Инкубационный поверхности силикона с EDC/сульфогруппу стоматология/шарик/col1 смеси осуществляется с силиконовой поверхностью в Перевернутый конфигурации. Причиной этого является то, что, когда смесь с бисером помещается на верхней поверхности силикона, шарик clumps оседают на поверхности силикона, приводит к плохой пространственным разрешением в то время как флуоресцентные микрошарики отражаются. Даже с настоящим Протоколом шарик clumps иногда наблюдались (яркие регионов на верхнем изображении на рис. 3). Однако они не являются достаточно обширными, чтобы влиять на разрешение метода. Это также можно использовать прокладки под края либо Петри в Рисунок 1 c позволяет поверхности силикона связаться жидкости, но не твердой поверхности под ним. Муфта микрошарики на верхней поверхности мягкого силикона может производиться даже без глубокой УФ света шаг, если выбираются микрошарики с гидрофобным покрытием. Жесткость измерение осуществляется на заключительном субстрата (после УФ лечение, шарик сцепления и ECM муфта) на котором клетки может быть покрытием. Следует учитывать, что жесткость характеристика должна быть выполнена после шагов (например, УФ лечение), которые могут возможно изменить жесткость субстрата, таким образом, что измерения жесткости является то, что клетки будут подвергаться.
Вместо того чтобы чашку Петри плиты из жесткой PDMS может использоваться как база для мягкого силикона14. Такая конфигурация может использоваться для применения внешних стрейч к клеткам которой жесткой силикона обеспечивает кадр, который может быть растянут и мягкого силикона обеспечивает клетки микро среды жесткости, что является более физиологических. 15,микроскопии16для тяговых сил также могут быть выполнены с покрытием на эти мягкие силиконовые гели7,8клеток, и присутствие флуоресцентные микрошарики в только верхний слой позволяет хорошее разрешение с просто widefield флуоресцентным микроскопом. Коллаген, который я в этот протокол может быть заменен с других белков внеклеточного матрикса. По сравнению с чуть более активно методы, такие как атомно-силовой микроскопии, сфере отступ метод может быть реализован более легко, в целом. Отклонение в среднем модули Юнга, получен с помощью метода индентирования сфере по сравнению с определяется с помощью Реометр обычно < 10%10. Таким образом метод отступ области (с помощью widefield флуоресцентным микроскопом) обеспечивает доступный метод для жесткости квантификация мягкий силикон (или Гидрогель) для применения в mechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Гардель Маргарет за щедро позволяет использовать Реометр. Мы признаем поддержку от НИЗ (1R15GM116082), что позволило этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
