Summary
Substrat med stelhet i kilopascal-spänna är användbara för att studera celler reagerar på fysiologiskt relevanta mikro-miljö stelhet. Med bara widefield fluorescens Mikroskop kan de Youngs modul av mjuk silikon geler bestämmas med en fördjupning med en lämplig sfär.
Abstract
Mjuka vävnader i den mänskliga kroppen har vanligtvis stelhet i intervallet kilopascal (kPa). Silikon och hydrogel flexibla substrat har således visat sig vara användbar substrat för odling av celler i en fysiska närmiljön som delvis efterliknar i vivo villkor. Här presenterar vi ett enkelt protokoll för karakterisera de Youngs moduli av isotropiskt linjära elastiska substrat används vanligtvis för Mekanobiologi studier. Protokollet består av förbereder ett mjukt silikon substrat på en petriskål eller stel silikon, beläggning ovansidan av silikon underlaget med fluorescerande pärlor, använda en millimeter-skala sfär för att strecksatsen övre yta (av tyngdkraften), imaging fluorescerande pärlor på indragna silikon ytan med fluorescens Mikroskop och analysera de resulterande bilderna för att beräkna de Youngs modul av silikon substratet. Koppling substratets övre yta med en moduli extracellulär matrix protein (förutom de fluorescerande pärlorna) tillåter silikon substratet till lätt användas för cell plätering och efterföljande studier med dragkraft force microscopy experiment. Användningen av stela silikon, i stället för en petriskål, som basen av mjuk silikon, möjliggör användning av Mekanobiologi studier med externa stretch. En särskild fördel i detta protokoll är att widefield fluorescens Mikroskop, som är allmänt tillgänglig i många laboratorier, är den större utrustningen som är nödvändig för detta förfarande. Vi visar detta protokoll genom att mäta de Youngs modul av mjuk silikon substrat av olika elastiska moduli.
Introduction
Celler i mjukdelar uppehåller sig i en mikro-miljö vars stelhet är i kilopascal urval1, i motsats till vävnadsodling rätter vars stelhet är flera tiopotenser högre. Tidiga experiment med celler på extracellulära matrix protein-coated mjuka underlag visade att substrat styvheten påverkar hur celler flytta samt följa den extracellular matrisen under2,3. I själva verket påverkar substrat styvheten fundamentalt cellen funktion4 på ett sätt som liknar genomträngande biokemiska signaler. Polyakrylamidgeler (belagda med extracellulära matrix proteiner) är (vatten-genomsyrar) hydrogels som har använts i stor utsträckning som cell kultur substrat för Mekanobiologi studier5. Polydimetylsiloxan (PDMS), det vanligaste silikonet (polysiloxane), har använts som en stel silikon med megapascal-range styvhet för micron-skala fabrication6. Mer nyligen, mjuk silikon substrat med stelhet i intervallet mer fysiologiskt relevanta kilopascal har varit anställd som cell kultur substrat för Mekanobiologi studier7,8.
Flera metoder har använts för att mäta styvheten i flexibla substrat, inklusive atomic force microscopy, makroskopiska deformation av hela prover vid stretching, reologi och indrag använder sfärer och sfäriskt tippade microindentors9 . Medan varje teknik har sina fördelar och nackdelar, är indrag med en sfär en särskilt enkla men ganska exakt metod som endast kräver tillgång till widefield fluorescens Mikroskop. Indrag med en metallisk sfär har använts för att mäta styvheten hos hydrogeler i tidigare arbete3,9,10. Tidiga verk som visat vikten av substrat stelhet till cell rörelse används denna metod för att bestämma hydrogel substrat stelhet3. Mer nyligen, konfokalmikroskopi har också använts för en elegant karakterisering10.
Här presenterar vi ett stegvisa protokoll för att förbereda ett mjukt silikon substrat, koppling fluorescerande pärlor (och en extracellulär matrix protein såsom kollagen jag) bara för att den övre ytan, imaging ett indraget sfär och den översta ytan med fas och fluorescens imaging, respektive, och slutligen analysera bilderna för att beräkna de Youngs modul av silikon substratet. Mjuk silikon substratet beredd på detta sätt kan lätt användas för dragkraft force microscopy experiment. Användning av stela silikon (i stället för en petriskål) som bas för mjuk silikon kan också Mekanobiologi studier med hjälp av en extern stretch. Om det är motiverat indikeras också praktiska överväganden behövs för att undvika möjliga komplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillverkning av mjuk silikon substrat
- Väg upp 1,75 g på en komponent och 1,75 g av komponenten B (a: b = 1:1) från mjuk silikon elastomer kit använder (polystyren) väger fack.
- Lägga till en komponent till komponenten B fackets vägning och blanda dem tillsammans för 5 min med en lämplig applikatorpinne.
- Lägga till ovanstående blandningen i en 35 mm petriskål. Låt blandningen jämnt fördelade över petriskål för ett par minuter.
Obs: Valet av petriskål diametern och mängden mjuk silikon avgör tjockleken mjuk silikon. Här, blir tjockleken cirka 3,5 mm; Mer om att välja elastomer tjockleken i diskussionsavsnittet . - Placera petriskål med silikon blandningen med locket av, i en vakuumkammare för 15 min till avlägsna eventuella luftbubblor. Under denna tid, Förvärm en värmeplatta till 70 ° C.
- När värmeplattan når 70 ° C, placera en glasskiva på det och sedan placera petriskål med silikon blandningen i glas-bilden. Låt silikonet botemedel vid 70 ° C i 30 min. Placera inte polystyren skålen direkt på den varma plattan, som petriskål kan smälta.
2. kopplingen av fluorescerande mikrokulor till mjuk silikon
- Placera det härdade mjuk silikonet (i den avtäckta petriskål) i en djup UV-kammare (en inhägnad med en djup UV-lampa av ljus våglängder av 185 och 254 nm). Utsätta mjuk silikon provet (~ 5-10 cm från UV-lampan) för djupa UV-ljus för 5 min.
- Medan silikonet utsätts för djupa UV-ljus, Fortsätt med steg 2.2-2.6 nedan. Efter den djupa UV-exponeringen, degas i djupa UV-kammaren för minst 5 min innan du hämtar provet.
- Under tiden väg ut 19 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och tillsätt 500 μl avjoniserat vatten (DI) vatten till den. Lös EDC genom att försiktigt skaka röret.
- I ett separat 1,5 mL mikrocentrifug rör, väga ut 11 mg av N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), tillsätt 500 μl DI vatten till det och lös sulfo-NHS genom att försiktigt skaka röret. Sedan kombinera EDC och sulfo-NHS lösningarna i ett enda mikrocentrifug rör.
- Till denna EDC/sulfo-NHS lösning, lägga 30 μL 0,44 μm diameter rött (eller någon annan fluorescens färg baserat på filtret kuber i mikroskopet fluorescens) bildas modified fluorescerande mikrokulor (med 1% w/v lager koncentration).
- EDC/sulfo-NHS/pärla blandningen, tillsätt 0,02 mg av kollagen I (från en råtta svans, lager koncentration på 4 mg/mL i 0,02 M ättiksyra) att få en koncentration på cirka 0,02 mg/mL.
- Vortex EDC/NHS/pärla/kollagen jag blandningen kort för att säkerställa att pärlorna är jämnt spridda över hela, före koppling.
- Pipettera 1 mL av EDC/NHS/pärla/kollagen jag blandningen på en bit av parafilm placeras ovanpå en annan grunt, platt lock (mindre diameter). Invertera petriskål med mjuk silikon på denna blandning så att ytan mjuk silikon kontakter blandningen men inte direkt berör ytan av mindre petriskål locket nedan. Att höja den inverterade petriskål, använda ett eller två glas glider under endera sidan av inverterad petriskål distanserna.
Obs: Se figur 1 för att se hur steg 2,7 utförs. - Täck över provet med aluminiumfolie och odla den i rumstemperatur i 30 min.
- Ta bort petriskål med mjuk silikon och ange det upprätt (silikon-sidan uppåt).
- Tvätta mjukt silikon ytan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att tillsätta 2 mL PBS (pH 7,4) i skålen. Låt det sitta i ett par minuter. Uppsugning av PBS och tvätta silikon igen med 2 mL PBS. Låt det silikon botemedlet ytterligare ungefär en dag. Därför placera mjuk silikon provet i PBS vid 37 ° C under natten.
3. mätning av silikon stelhet med Sphere indrag med Widefield fluorescens Mikroskop
- Hämta petriskål med mjuk silikon och se till att det innehåller minst 1 mL PBS att ha silikon ytan flera mm under vätskeytan.
- Med spetsiga pincetter, släppa fem 1 mm zirkonium sfär indentors mjuk silikon. Doppa kulorna i det flytande mediet och släppa dem, bort från kanterna av silikon lagret och minst 5 indentor diametrar från platsen för de andra indentors.
Obs: När sjönk ovanför vätskeytan, kulorna kan inte ange det flytande mediet (float) på grund av det flytande mediet ytspänning. - Placera petriskål med mjuk silikon på Mikroskop scenen så att det är möjligt att avbildningen genom petriskål bas.
- Med hjälp av fas imaging med ett 10 X-objektiv (till exempel en torr 10 X objektiva na 0,30), leta upp och ta en sfär-indentor i fokus.
- Ta en fas bilden av en del av eller hela indentor och spara bilden. Använd en kakel genomsökning om tillgängligt. Om indentor har några synliga defekter, kasta och ersätta den med en annan indentor.
- Under levande fas imaging, panorera till vänster om den indentor kanten så att den vänstra kanten av ramen är åtminstone en distansera av ~1.5 R från stadens indentor. Säkerställa att centrera av indentor förblir synlig på höger sida, nära den högra kanten av bildram. Ta en fas bild och spara den.
- Växla Mikroskop ljuskällan för belysning för den röda fluorescerande kanalen. Med x- och y-koordinater oförändrad ( x-y -position av indentor centrerar inom men nära den högra kanten av ramen), fokus ner (minskning Z) tills den röda fluorescerande mikrokulor under den sfär indentor's center bara gå ur fokus.
- Ta en z-stack med en bild för varje z-ökning med 0,5 µm tills mikrokulor i det översta lagret av silikon långt från indentor (nära den vänstra kanten av ramen imaging) gå ur fokus.
- Upprepa steg 3,4-3,8 med de andra indentors på provet.
4. beräkning av Silikons stelhet (Youngs modul)
- Öppna fas bilden av den indentor som använder ImageJ, klicka på linjeverktyget, och mäta den indentor diameter i pixlar. Klicka och håll på en punkt på indentor kant, flytta markören till en diametralt motsatt punkt på kanten och notera längden i pixlar visas i statusfältet i ImageJ-fönstret innan du släpper markören.
- Kontrollera att enheten av längden är inställd till pixlar genom att klicka analysera | Ställa in skalan för och kontroll enhet av längden.
- Konvertera den indentor radius i pixlar till μm genom att ta hänsyn till objektiva förstoringen och CCD kamera pixelstorleken (R i μm = R i pixlar x CCD kamera pixelstorleken i μm / objektiva förstoringen).
- Öppna den röda kanal z-stacken microbead bilder (om mikrokulor röd fluorescerande) i ImageJ genom att klicka på fil | Importera | Bild sekvens Välj någon bild i stacken och klicka på OK att öppna stacken.
Obs: F1 är ramnummer som mikrokulor under stadens indentor är i bästa möjliga fokus och F2 är ramnummer som mikrokulor (på en region i ~1.5 R från stadens pärla) nära den vänstra kanten av ramen är i bästa möjliga fokus. Z-skillnaden mellan de två bildrutorna är det indrag djup δ.- Med linjeverktyget i ImageJ, dra en linje över en väldefinierad microbead i bilden. Klicka på analysera | Rita profil och klicka på knappen Live att få uppdaterade linje scan intensitet över pärla medan du markerar olika ramar. Den ram som ger det högsta värdet för den maximala intensiteten kan väljas som ramen i fokus.
- Eftersom z-ökningen mellan bildrutorna i z-stacken är 0,5 μm, beräkna indrag djupet i μm som δ = (F2-F1) x 0,5.
- Beräkna den kraft som utövas på gelen genom indentor på grund av dess vikt (minus den motsättande buoyant kraften), det vill säga, indraget kraft F, som volymen av indentor x (tätheten av indentor - tätheten av det flytande mediet) x acceleration beroende på tyngdkraften. Använd ekvationen F = (4/3) x 3,142 x (R3) x (ρindentor - ρmedium) x g där R är radien av indentor, ρindentor är tätheten av indentor, ρmedium är tätheten av det flytande mediet och g är acceleration beroende på tyngdkraften (9.81 m/s2). Uttrycka alla kvantiteter på höger sida i SI-enheter att få F (i N).
- Beräkna de Youngs modul (E) av silikon med en modifierad11 Hertz modell12 ekvation:
Var:
c = en korrektionsfaktor som modifierar uttrycket Hertz modell som följer det;
v = Poissons förhållandet av silikongel (tagit 0,5 när det gäller inkompressibel material7);
F = den indrag kraften;
R = indentor radie; och
Δ = indrag djupet.
Express alla kvantiteter på höger sida i SI-enheter för att få E i Pa.- Beräkna den korrigering faktor c enligt följande3:
Var:
; och
.
Det bör noteras att denna korrektionsfaktor är speciellt för att användas endast när det mjuk silikonet följer väl till petriskål (eller stel silikon) undertill (vilket är fallet här). - Beräkna höjden h av mjuk silikon lagret baserat på mängden silikon lagt till och petriskål diameter. Alternativt få h direkt genom att bestämma de z-koordinaten för övre och nedre ytbehandlar av silikon lagret av fas imaging (mindre orenheter kommer i fokus på antingen yta). Notera att för en stor h (h2 > Rδ), den korrigering faktor c är nära 1.
- Beräkna den korrigering faktor c enligt följande3:
- Upprepa steg 4.1-4.4 för varje indentor. Genomsnitt de Youngs modul erhålls från varje indentor att få den genomsnittliga Youngs modul för silikon provet.
; och
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av protokollet som anges ovan, vi förberett mjuk silikon i ett 35 mm petriskål, botade det vid 70 ° C i 30 min och tillsammans fluorescerande mikrokulor (och kollagen jag) till den övre ytan så schematiskt avbildas i figur 1. Djupa UV har tidigare använts för proteinet eventuell koppling till substrat13. Observera att (I) de bota villkor som används här är specifika för denna mjukt silikon och (II) indrag mätningen utförs på nästa dag som mjuk silikon är förväntat att bota lite längre under loppet av en dag.
Olika parametrar som kännetecknar sfäriska indrag på silikon ytan visas i figur 2A. Fas imaging används för att fånga antingen (I) hela bilden av indentor som visas i figur 2B (med bild sömmar, om nödvändigt) eller (II) en del av bilden av sfären. Den enda parametern som kan härledas från den indentor bilden är dess diameter. Till exempel, för de indentor vi använde med 1:1 mjuk silikon i detta protokoll, hade olika enskilda indentors från samma parti diametrar som varierade från 950 µm till 1 200 µm med ett medelvärde på 1 037 µm och en standardavvikelse på 47 µm (8 indentors). Observera att diametern mätt för en viss indentor (i stället för den genomsnittliga diametern för många indentors) bör användas för beräkningen av stelhet i indrag-inducerad av det särskilda indentor.
Fluorescerande bilder av mikrokulor i ovansidan av silikon är tagna vid ett x-y skanningsramens position så att regionen under indentor i den högerextrema delen av ramen. Regionen i den bortre vänstra delen av ramen väljs ska regionen från indentor som visas i figur 3. Z-stack bilder av Regionkommittén under indentor och bort från indentor visas i figur 3samt. För de 1 mm diameter zirkonium indentor används med 1:1 mjuk silikon, skilde sig z-värdena som de 2 regionerna komma i fokus genom ca 20 µm (δ). Detta är mycket mindre än tjockleken på mjuk silikon, som var runt 3 500 µm. med tätheten (4.66 g/cm3) av den zirkonium-indentor (som är faktiskt gjord av en blandning av zirkoniumdioxid och kiseldioxid) och tätheten av vätskan medium (för PBS: 1,01 g/cm3), den netto kraft som utövas på silikonet kan beräknas. För förevarande mål var i intervallet 20-25 µN. De Youngs modul vi beräknats för 1:1 mjuk silikon var 7,2 ± 2,4 kPa (från 28 platser poolats från 6 oberoende prover). De representativa resultat för andra a: b nyckeltal för samma mjuk silikon (anges i medföljande Tabell av särskilda reagenser) ges i tabell 1. Slutligen för att validera metoden sfär indrag som använder widefield Mikroskop som beskrivits i detta protokoll, Vi mätte även den Youngs moduli av en polyakrylamidgel vi kännetecknas med en reometer ha en Youngs modul 21 ± 3 kPa. Använder metoden sfär indrag i detta protokoll med widefield Mikroskop befanns Polyakrylamidgelen av samma sammansättning ha en Youngs modul 22,1 ± 4.2 kPa, vilket indikerar en bra avtal10. Varningar att uppmärksamma medan utför dessa mätningar behandlas i avsnittet diskussion.
Figur 1: Schematisk skildring av förfarandet för koppling fluorescerande mikrokulor till ovansidan av mjukt silikon. (A), mjuk silikon som har torkats utsätts för djupa UV ljus för 5 min. (B) A blandning av EDC, sulfo-NHS, pärlor och kollagen I i vatten är pipetteras ner på en bit parafilm placerad ovanpå ett lock av mindre diameter. (C), mjuk silikon prov är inverterad på denna blandning så att den är i kontakt med vätskan men inte med den övre ytan på det mindre locket under. Två glasskivor på vardera sidan, under petriskål, fungera som distanser. (D) efter tvätt provet med PBS, mjuk silikon ytan belagd med fluorescerande mikrokulor är redo för stelhet mätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk illustration av sfär indrag av mjuk silikon ytan. (A) denna schematiska skildring visar en sfärisk indentor på ytan av en mjuk silikon-provet. Olika parametrar av intresse indikeras. (B) denna panel visar en bild av en 1 mm indentor (på en mjuk silikon prov) erhålls via fas imaging. Skalstapeln anger 250 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Bead bild förvärv och bestämning av bilden i fokus. (A) denna fluorescens-bild visar mikrokulor på ovansidan av mjuk silikon provet och önskad x-y plats av dess stomme i förhållande till indentor (streckad linje). Skalstapeln anger 150 µm. paneler B och C visar z-stack fluorescens bilder av regioner på mjuk silikon ytan (B) under indentor och (C) från indentor (boxed regioner i den övre bilden). De indikatorer z1 och z2 motsvarar z-värdena som regionen under indentor och regionen från indentor är i fokus, respektive. Skala staplarna visar 20 µm. De monokroma bilder som visas är de som erhållits i den röda kanalen eftersom nominellt rosa mikrokulor användes vars excitation och utsläpp profiler passar den röda kanalen. (D) i denna panel visas en intensitet linjeavsökning över en mikro-pärla (visas i den infällda bilden med en gul linje tvärs det) som fokus är varierat i z-steg om 0,5 µm. Fokus (z-värde) motsvarar bilden i fokus kan objektivt väljas baserat på z-värdet motsvarar linjeavsökning med högsta maximal intensitet. Skalstapeln i infällt anger 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Silikon elastomer * a: b | Youngs Modulus ** (kPa) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * anges i den medföljande tabell av särskilda reagenser/utrustningen ** mätt med metoden sfär indrag med widefield Mikroskop som beskrivs i detta protokoll |
|
Tabell 1. Youngs modul av mjuk silikon (för den särskilda silikon som anges i den tabell för särskilda reagenser/utrustningen) för olika kompositioner som uppmätt med hjälp av protokollet detaljerad här. Värden för förhållandet mellan de två blandade komponenter a: b (och motsvarande antal mätningar) är 1:1 (28), 4:7 (13) och 1:2 (8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Även metoden sfär indrag är lätt att genomföra, måste noggrann uppmärksamhet betalas till valet av indentor och tjockleken av mjuk silikon provet. Den ekvation som används för att beräkna de Youngs modul är giltig under en uppsättning villkor11och dessa är normalt uppfyllda när tjockleken på silikon provet är > 10% av indentor radie och < ~ 13 x indentor radie. Vi fann att en silikon tjocklek av 5-10 x indentor radien var ett bra val, vari prov tjockleken inte är för hög (dvsobjektiva arbetsavståndet blir inte en begränsning) och beräknade styvheten var också inte alltför känsliga för den exakta värdet av silikon tjocklek. Valet av sfäriska indentor skall också vara sådan att den indrag djup δ är < 10% av tjockleken silikon samt < 10% av indentor radie. Med dessa i åtanke, kan indentors av både olika material och diameter användas för att mäta styvheten i mjukare och hårdare silikoner. Bestämning av indrag djupet är det mest kritiska steget i detta protokoll. Den metod som föreslås i detta protokoll för att identifiera i fokus bilderna bör bidra till att bestämma indrag djupet på ett tillförlitligt sätt. Det bör också noteras att stelhet beräkningen används för metoden sfär indrag använder Hertzian teori, som förutsätter friktionsfri kontakt. Här, är detta en bra antagande för indentors av låg strävhet. Medan vi har använt en viss mjuk silikonelastomer (anges i medföljande Tabell av särskilda reagenser), kan andra kommersiella silikon elastomer kit användas. Observera att det stela silikonet används för mikrofabrikation är inte ett bra val för att göra substrat med stelhet i intervallet kPa. Mjuk silikon (som har stelhet i den nedre änden av intervallet kPa) kan dock blandas med en liten andel av stela silikon att göra substrat med stelhet i den högre änden av intervallet kPa. Beroende på elastomer, kan en indentor med en annan storlek eller densitet väljas, så länge de villkor som nämnts tidigare är uppfyllda.
Några viktiga överväganden för kopplingen av fluorescerande mikrokulor till mjuk silikons övre yta är viktigt. Först av allt, vi valde 0,44 µm bildas pärlor eftersom deras fluorophore innehåll och därmed ljusstyrka var större än för liknande pärlor av mindre storlek. Mindre pärla storlekar kan användas om pärlorna innehåller ljusare fluorophores, men vi föreslår att sub micron bildas pärlor bör användas så att inte negativt påverka upplösningen av metoden. Inkubering av silikon ytan med EDC/sulfo-NHS/pärla/Kol1 blandningen utförs med silikon ytan i en inverterad konfiguration. Anledningen till detta är att när blandningen med pärlor är placerad ovanpå silikon ytan, kvitta pärla klumpar på silikon ytan, vilket leder till en dålig rumslig upplösning medan de fluorescerande mikrokulor är som avbildas. Även med detta protokoll observerades ibland pärla klumpar (ljusa regioner i den översta bilden i figur 3). De är dock inte tillräckligt omfattande för att påverka metodens upplösning. Det är också möjligt att använda distanser under kanterna på något av Petriskålarna i figur 1 c för att tillåta silikon ytan att kontakta vätskan men inte solid ytan under den. Kopplingen av mikrokulor till ovansidan av mjuk silikon kan utföras även utan en djup UV ljus steg om mikrokulor med en hydrofoba beläggning är valt. Stelhet mätningen utförs på slutliga substratet (efter UV-behandling, pärla koppling och ECM koppling) på vilka celler kan beläggas. Det bör bäras i åtanke att en stelhet karakterisering bör utföras efter steg (till exempel UV behandling) som eventuellt kan förändra substrat styvheten så att den uppmätta stelhet är den som cellerna kommer att utsättas för.
I stället för en petriskål, kan en platta av hård PDMS användas som bas för mjuk silikon14. En sådan konfiguration kan användas för att tillämpa en extern sträcka till celler vari det stela silikonet ger den ram som kan sträckas och mjuk silikon ger en cell mikro-miljö av stelhet som är mer fysiologiska. Dragkraft force microscopy15,16kan även utföras med celler pläterade på dessa mjuka silikon geler7,8, och förekomsten av fluorescerande mikrokulor i bara det översta lagret möjliggör en bra upplösning med bara ett widefield fluorescens Mikroskop. Kollagen I detta protokoll kan ersättas med andra extracellulära matrix proteiner. Jämfört med något mer engagerade metoder såsom atomic force microscopy, kan metoden sfär indrag genomföras lättare, i allmänhet. Avvikelse i medelvärdet Youngs moduli erhållits med sphere indrag metod jämfört med bestäms med hjälp av en reometer är vanligtvis < 10%10. Metoden sfär indrag (med widefield fluorescens Mikroskop) föreskrivs således en tillgänglig metod för kvantifiering av mjuk silikon (eller hydrogel) styvhet för applikationer i Mekanobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Margaret Gardel för generöst medger användning av reometer. Vi erkänner stöd från NIH (1R15GM116082) som gjort detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
