Summary
Sustratos con rigidez en la gama de kilopascal son útiles para estudiar la respuesta de las células a rigidez de microambiente fisiológicamente relevante. Con sólo un microscopio de fluorescencia de campo amplio, módulo de Young de geles de silicona blanda puede ser determinado mediante una muesca con un ámbito adecuado.
Abstract
Los tejidos blandos en el cuerpo humano normalmente tienen rigidez en la gama de kilopascal (kPa). Por consiguiente, sustratos flexibles de silicona e hidrogel han demostrado para ser sustratos útiles para el cultivo de células en un microambiente físico que imita parcialmente en vivo condiciones. Aquí, presentamos un protocolo simple para la caracterización de módulos de Young de sustratos elástico lineales isotrópicos utilizados normalmente para estudios mecanobiología. El protocolo consiste en preparar un sustrato de suave silicona en una placa de Petri o silicona rígida, cubriendo la superficie del substrato de silicona con perlas fluorescentes, través de una escala milimétrica para aplicar sangría a la superficie (por gravedad), el fluorescente de la proyección de imagen granos en la superficie de la silicona con sangría utilizando un microscopio de fluorescencia y análisis de las imágenes resultantes para calcular el módulo de Young del sustrato de silicona. Superficie superior del sustrato de acoplamiento con una proteína de matriz extracelular de moduli (además de los granos fluorescentes) permite que el sustrato de silicona fácilmente ser utilizado para la galjanoplastia de la célula y estudios subsecuentes usando experimentos de microscopia de fuerza de tracción. El uso de silicona rígida, en lugar de un plato de Petri, como la base de la silicona blanda, permite el uso de estudios mecanobiología estiramiento externo. Una ventaja específica de este protocolo es un microscopio de fluorescencia de campo amplio, que está comúnmente disponible en muchos laboratorios, el equipo pesado necesario para este procedimiento. Demostramos este protocolo midiendo el módulo de Young de sustratos de silicona de diferentes módulos elásticos.
Introduction
Las células en los tejidos blandos residen en un entorno micro cuya rigidez es en el kilopascal rango1, en contraste con los platos de cultivo de tejidos cuya rigidez es varios órdenes de magnitud mayor. Primeros experimentos con las células en los substratos suaves recubiertos por proteínas de matriz extracelular demostraron que la rigidez de sustrato influye en cómo las células pasan como se adhieren a la matriz extracelular por debajo de2,3. De hecho, la rigidez del substrato influye fundamentalmente la célula función4 en una manera similar a las señales bioquímicas penetrantes. Geles de poliacrilamida (recubiertos de proteínas de matriz extracelular) son (impregnación por el agua) hidrogeles que han sido ampliamente utilizados como sustratos de cultivo de células para la mecanobiología estudia5. Polydimethylsiloxane (PDMS), la silicona más común (polisiloxano), ha sido ampliamente utilizado como una silicona rígida con rigidez megapascal-gama para la escala del micrón fabricación6. Más recientemente, de silicona suave sustratos con rigidez en la gama de kilopascal más fisiológico relevantes han sido utilizados como sustratos de cultivo de célula mecanobiología estudios7,8.
Varios métodos se han utilizado para medir la rigidez de sustratos flexibles, incluyendo la microscopía de fuerza atómica, deformación macroscópica de las muestras todo sobre estiramiento, reología y sangría con esferas y con punta esférica de microindentors9 . Mientras que cada técnica tiene sus propias ventajas y desventajas, marca con una esfera es un método especialmente sencillo y bastante preciso que sólo requiere el acceso a un microscopio de fluorescencia de campo amplio. Marca con una esfera metálica se ha utilizado para medir la rigidez de los hidrogeles en trabajos previos3,9,10. Primeros trabajos que demostraron la importancia de la rigidez del sustrato al movimiento celular utilizan este método para determinar hidrogel sustrato rigidez3. Más recientemente, también ha utilizado la microscopia confocal para una caracterización elegante10.
Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para preparar un sustrato suave del silicón, acoplamiento perlas fluorescentes (y una proteína de matriz extracelular como colágeno I) a la superficie, la proyección de imagen una esfera de sangría y la superior con superficie fase y fluorescencia de la proyección de imagen, respectivamente y, finalmente, analizar las imágenes para calcular el módulo de Young del sustrato de silicona. El sustrato de silicón suave preparado de esta manera se puede usar para experimentos de microscopia de fuerza de tracción. El uso de silicona rígido (en vez de una placa de Petri) como la base para la silicona suave también permite estudios mecanobiología utilizando un tramo de la externo. Cuando se justifique, también se indican consideraciones prácticas necesarias para evitar posibles complicaciones.
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Protocol
1. fabricación de sustrato de silicona blanda
- Pesar 1,75 g de un componente y 1,75 g de componente B (a: b = 1:1) desde el kit de elastómero de silicona blanda (poliestireno) peso de bandejas.
- Añadir un componente a componente B en la bandeja de pesaje y mezcla juntos durante 5 minutos usando un aplicador apropiado.
- Añadir la mezcla anterior a una caja de Petri de 35 mm. Deje que la mezcla se Esparza uniformemente en toda la caja Petri durante un par de minutos.
Nota: La elección del diámetro de la placa de Petri y la cantidad de silicona blanda determinará el espesor de silicona blanda. Aquí, el espesor será de alrededor de 3,5 mm; más sobre escoger el espesor del elastómero en la sección de discusión . - Coloque el plato Petri con la mezcla de silicona, con la tapa, en una cámara de vacío durante 15 min eliminar cualquier burbuja de aire. Durante este tiempo, precalentar un plato caliente a 70 ° C.
- Una vez que la placa alcance 70 ° C, coloque un portaobjetos de cristal sobre ella y luego coloque el plato Petri con la mezcla de la silicona en el portaobjetos de cristal. Dejar que la silicona de cura a 70 ° C durante 30 minutos. No coloque el plato poliestireno directamente sobre la placa, como se puede derretir la placa Petri.
2. acoplamiento de microesferas fluorescentes a la silicona suave
- Coloque el curado silicón suave (en la placa Petri al descubierto) en una cámara de UV profunda (una caja con una lámpara Ultravioleta profunda de ondas de luz de 185 y 254 nm). Exponer la muestra suave del silicón (~ 5-10 cm de distancia de la lámpara UV) a profunda Ultravioleta luz durante 5 minutos.
- Mientras que la silicona es exponerse a la luz UV profunda, proceder con pasos 2.2-2.6. Después de la exposición UV profunda, degas la profunda cámara de UV durante al menos 5 minutos antes de recuperar la muestra.
- Mientras tanto, pesar 19 mg de 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y agregar 500 μL de agua desionizada (DI) a él. Disolver la EDC agitando suavemente el tubo.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL separadas, pesar 11 mg de N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), agregue 500 μL de agua desionizada y disolver el sulfo-NHS agitando suavemente el tubo. A continuación, combinar las soluciones EDC y sulfo-NHS en un tubo de microcentrífuga sola.
- A esta solución EDC/sulfo-NHS, Añadir 30 μL de 0.44 μm diámetro rojo (o cualquier otro color de fluorescencia basada en los cubos de filtro disponibles en el microscopio de fluorescencia) carboxilato modificado microesferas fluorescentes (con una concentración stock de 1% w/v).
- A la mezcla EDC/sulfo-NHS/grano, Añadir 0,02 mg de colágeno I (de una cola de rata, stock concentración de 4 mg/mL en ácido acético de 0,02 M) para obtener una concentración de 0,02 mg/mL, aproximadamente.
- Vórtice el EDC NHS/grano/colágeno mezcla brevemente para asegurar que los granos se dispersan uniformemente en todas partes, antes de acoplamiento.
- Pipeta de 1 mL del EDC NHS/grano/colágeno I mezcla sobre un trozo de parafilm colocado encima otra tapa plana, poco profunda (de menor diámetro). Invierta la caja Petri con silicona blanda en esta mezcla para que la superficie de silicona suave en contacto con la mezcla pero no toque directamente la superficie de la tapa de Petri más pequeñas abajo. Para elevar el plato de Petri invertida, utilice una o dos laminas de vidrio en ambos lados de los espaciadores de Petri invertida.
Nota: Ver figura 1 para ver cómo se realiza paso 2.7. - Cubrir la muestra con papel de aluminio e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Retire la placa de Petri con silicona suave y ajuste vertical (silicona-hacia arriba).
- Lave la superficie suave de silicona con solución salina tamponada con fosfato (PBS) Añadir 2 mL de PBS (pH 7.4) al plato. Dejar reposar un par de minutos. Aspirar del PBS y lavar la silicona nuevo con 2 mL de PBS. Que la cura de silicona más para un día. Por ello, poner la silicona suave muestra en PBS a 37 ° C durante la noche.
3. medición de la rigidez de silicona con esfera indentación utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio
- Recuperar la placa de Petri con silicona suave y asegúrese de que contenga al menos 1 mL de PBS que la superficie de silicón varios mm por debajo de la superficie del líquido.
- Con unas pinzas puntiagudas, soltar cinco indentors de esfera de circonio de 1 mm de silicona suave. Sumerja las esferas en el medio líquido y colocarlas fuera de los bordes de la capa de silicona y al menos 5 diámetros de penetrador de la ubicación de los otros indentors.
Nota: Cuando se deja caer sobre la superficie del líquido, las esferas pueden no entrar en el medio líquido (flotador) debido a la tensión de superficie del medio líquido. - Coloque el plato Petri con silicona blanda sobre la platina del microscopio para que sea posible a la imagen a través de la base del plato de Petri.
- Usando proyección de imagen de fase con el objetivo 10 X (como una seca 10 X objetivo de NA 0.30), localizar y traer un penetrador de esfera en foco.
- Tomar una imagen de fase de una parte o la totalidad del indentor y guardar esta imagen. Utilizar una exploración azulejo si está disponible. Si el penetrador tiene defectos visibles, descartar y reemplazar con otro penetrador.
- Bajo la proyección de imagen en fase, pan a la izquierda del borde del indentor para que el borde izquierdo del marco es por lo menos una distancia de ~1.5 R del centro del penetrador. Asegúrese de que el centro del indentor permanece visible en el lado derecho, cerca del borde derecho del cuadro de imagen. Tomar una imagen de fase y guárdelo.
- Cambiar la fuente de luz del microscopio para la iluminación para el canal rojo fluorescente. Con el x- y y-sin cambios de coordenadas ( x-y posición del centro indentor dentro pero cerca del borde derecho del cuadro), enfoque hacia abajo (disminuir Z) hasta el rojo microesferas fluorescentes bajo centro del penetrador de esfera solo salir de foco.
- Tomar una pila de z con una imagen para cada incremento de z de 0.5 μm hasta los microbeads en la capa superior de la silicona lejos el penetrador (cerca del borde izquierdo del marco imagen) ir fuera de foco.
- Repita los pasos 3.4-3.8 con los otros indentors en la muestra.
4. cálculo de rigidez de la silicona (módulo de Young)
- Abra la imagen de la fase del penetrador con ImageJ, haga clic en la herramienta de línea y medir el diámetro del penetrador en píxeles. Haga clic y mantenga en un punto en el borde del penetrador, mueve el cursor a un punto diametralmente opuesto en el borde y anote la longitud en píxeles mostrados en la barra de estado de la ventana principal de ImageJ antes de soltar el cursor.
- Asegúrese que la unidad de longitud es píxeles haciendo clic analizar | Establecer la escala y control de la unidad de longitud.
- Convertir radio del indentor en píxeles a μm teniendo en cuenta el aumento del objetivo y el tamaño de píxel de cámara CCD (R en μm = R en píxeles x el tamaño del pixel CCD cámara en μm / Ampliación objetiva).
- Abra el canal rojo z-pila del microbead imágenes (si las microesferas son rojo fluorescente) en ImageJ haciendo clic en archivo | Importación | Secuencia de imágenes y seleccione cualquier imagen en la pila y haga clic en Aceptar para abrir la pila.
Nota: F1 es el número de marco en el cual las microesferas debajo del centro del penetrador en el mejor enfoque posible y F2 es el número de marco en el cual las microesferas (en una región de ~1.5 R desde el centro del grano) cerca del borde izquierdo del marco están en el mejor enfoque posible. El z-diferencia entre los dos marcos es la δ de la profundidad de indentación.- Con la herramienta de línea de ImageJ, trace una línea a través de un bien definido microbead en la imagen. Haga clic en analizar | Trazar el perfil y haga clic en el botón de Live para obtener la intensidad de exploración actualizada de la línea a través de la cuenta al seleccionar diferentes marcos. El marco que da el mayor valor de la intensidad máxima puede ser elegido como el marco de enfoque.
- Puesto que el incremento de z entre los marcos de la pila de z es de 0,5 μm, calcular la profundidad de la indentación en μm como δ = (F2-F1) x 0,5.
- Calcular la fuerza ejercida en el gel por el penetrador debido a su peso (menos la oposición fuerza de flotación), es decir, la sangría de la fuerza F, como el volumen del indentor x (densidad del indentor - la densidad del medio líquido) x la aceleración debido a la gravedad. Utilice la ecuación F = (4/3) x 3.142 x (R3) x (ρindentor - ρmedio) x g donde R es el radio del penetrador,penetrador ρ es la densidad del penetrador, ρmedio es la densidad del medio líquido y g es la aceleración debido a la gravedad (9.81 m/s2). Expresar todas las cantidades a la derecha en unidades de SI para obtener F (en N).
- Calcular el módulo de Young (E) de la silicona mediante un modificado11 ecuación de Hertz modelo12 :
Donde:
c = factor de corrección que modifica la expresión del modelo de Hertz que sigue;
v = relación de Poisson del gel del silicón (tomado como 0.5 en cuanto a materiales incompresibles7);
F = la fuerza de la sangría;
R = el radio del indentor; y
Δ = la profundidad de la indentación.
Expresar todas las cantidades a la derecha en unidades de SI para obtener E en PA.- Calcular el factor de corrección c de la siguiente manera3:
Donde:
; y
.
Cabe señalar que este factor de corrección es específicamente para ser utilizado sólo cuando la suave silicona se adhiere bien a la placa de Petri (o silicona rígida) por debajo de ella (que es el caso aquí). - Calcular la altura h de la capa de silicona suave basada en la cantidad de agregado de silicona y el diámetro de la placa de Petri. También puede obtener h directamente mediante la determinación de la coordenada z de las superficies superior e inferior de la capa de silicona por proyección de imagen de fase (impurezas menores entran en foco en cualquier superficie). Tenga en cuenta que para una gran h (h2 > Rδ), el factor de corrección c es cerca de 1.
- Calcular el factor de corrección c de la siguiente manera3:
- Repita los pasos 4.1-4.4 para cada penetrador. Promedio del módulo de Young obtenido cada penetrador para obtener el módulo de Young promedio para la muestra de silicona.
; y
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Representative Results
Usando el protocolo detallado arriba, preparamos suave silicona en una placa de Petri de 35 mm, curado a 70 ° C por 30 min y juntado microesferas fluorescentes (colágeno I) a la superficie como esquemáticamente representada en la figura 1. UV profundo se ha utilizado previamente para la proteína eventual acoplamiento a sustratos13. Tenga en cuenta que (I) las condiciones de curado utilizadas aquí son específicas de esta silicona suave y (II) la medición de la indentación se realiza al día siguiente como la suave silicona se espera curar un poco más sobre el curso de un día.
Diversos parámetros que caracterizan la muesca esférica de la superficie de la silicona se muestran en la figura 2A. Proyección de imagen de fase se utiliza para capturar ya sea (I) la imagen del penetrador como se muestra en la figura 2B (con costura de la imagen, si es necesario) o (II) parte de la imagen de la esfera. El único parámetro de imagen del indentor es su diámetro. Por ejemplo, para el penetrador que se utilizó con la silicona suave de 1:1 en el presente Protocolo, indentors individuales diferentes de un mismo lote tuvieron diámetros que oscilan entre 950 μm μm 1.200 con un valor medio de 1.037 μm y una desviación estándar de 47 μm (8 indentors). Tenga en cuenta que el diámetro medido para un indentor particular (más que el diámetro medio para muchos indentors) debe utilizarse para el cálculo de la rigidez para la sangría inducida por eso indentor particular.
Imágenes fluorescentes de microesferas en la superficie de la silicona se toman en un x- posición del marcoy para que la región bajo el indentor es en la parte derecha del marco. La región en la parte izquierda del marco es elegida para ser la región del penetrador como se muestra en la figura 3. Imágenes Z-stack de las regiones bajo el indentor y lejos el penetrador se muestran en la figura 3también. Para el 1 mm diámetro circonio penetrador con la silicona suave de 1:1, los valores de z en la cual las 2 regiones entran en foco diferenciaron por cerca de 20 μm (δ). Esto es mucho menor que el grueso de la suave silicona, que era alrededor de 3.500 μm. utilizando la densidad (4,66 g/cm3) del indentor de zirconio (que está formada de una mezcla de dióxido de circonio y dióxido de silicio) y la densidad del líquido de medio (de PBS: 1,01 g/cm3), la fuerza neta ejercida sobre la silicona puede ser computada. Para el caso bajo examen, es en la gama µN de 20-25. Módulo de Young que calcula para la silicona suave de 1:1 fue 7,2 ± 2.4 kPa (desde 28 ubicaciones de 6 muestras independientes). Resultados representativos para otros cocientes a: b para la misma silicona suave (especificado en la Tabla de reactivos específicosde acompañamiento) se dan en la tabla 1. Por último, para validar el método de indentación de la esfera que utiliza un microscopio de campo amplio como descrito en el presente Protocolo, también medimos los módulos de Young de un gel de poliacrilamida caracteriza con un reómetro que módulo de Young de 21 ± 3 kPa. Utilizando el método de indentación de esfera de este protocolo utilizando un microscopio de campo amplio, gel de poliacrilamida de la misma composición fue encontrado para tener el módulo de Young de 22,1 ± 4.2 kPa, lo que indica un buen acuerdo10. ADVERTENCIAS atención para llevar a cabo estas medidas se abordan en la sección de discusión.
Figura 1: representación esquemática del procedimiento de acoplamiento microbeads fluorescente a la superficie superior de suave silicona de. (A) la silicona suave que se ha curado se expone a UV profundo de 5 minutos (B) una mezcla de EDC, sulfo-NHS, granos y colágeno en agua se pipetea hacia abajo sobre un trozo de parafilm colocado encima de una tapa de menor diámetro. Muestra (C) la silicona suave se invierte en esta mezcla por lo que está en contacto con el líquido pero no con la superficie superior de la tapa más pequeña debajo. Dos portaobjetos a ambos lados, debajo de la caja Petri, actúan como espaciadores. (D) después de lavar la muestra con PBS, la superficie de silicona suave con microesferas fluorescentes está listo para la medición de la rigidez. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: ilustración esquemática de la muesca de la esfera de la superficie de silicona suave. (A) esta representación esquemática muestra un penetrador esférico en la superficie de una muestra de silicona blanda. Diversos parámetros de interés son los indicados. (B) este panel muestra una imagen de un penetrador de 1 mm (en una muestra de silicona blanda) obtenida por proyección de imagen de fase. La barra de escala indica 250 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: grano de adquisición de la imagen y la determinación de la imagen en foco. (A) esta imagen de fluorescencia muestra microesferas en la superficie de la muestra de silicón suave y la deseada x-y del su marco en relación con el penetrador (línea punteada). La barra de escala indica que 150 μm. paneles B y C muestran imágenes de fluorescencia de z-stack de regiones en la superficie de silicona suave (B) bajo el indentor y (C) del penetrador (en las regiones en la imagen superior). Los indicadores z1 y z2 corresponden a los valores de z en la cual la región bajo el penetrador y la región del penetrador están en foco, respectivamente. Las barras de escala indican 20 μm. Las imágenes monocromas muestras son los obtenidos en el canal rojo, puesto que nominalmente microbeads Rosa fueron utilizados cuyos perfiles de excitación y emisión de ajustar el canal rojo. (D) este panel muestra una exploración de línea de intensidad a través de un cordón de micro (se muestra en la imagen del recuadro con una línea amarilla a través de él) como el foco es variado en z-incrementos de 0,5 μm. El foco (valor z) correspondiente a la imagen en foco puede ser objetivamente elegido basado en el valor de z correspondiente a la línea de exploración con la intensidad máxima más alta. La barra de escala en el margen indica 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Elastómero de silicona * a: b | Módulo ** de Young (kPa) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * especificado en la adjunta tabla de reactivos/equipamiento específico ** medida con el método de indentación de esfera usando un microscopio de campo amplio como se detalla en el presente Protocolo |
|
Tabla 1. Módulo de Young de silicona suave (para la silicona especial especificada en la tabla de reactivos/equipamiento específico) para diferentes composiciones como medida utilizando el protocolo detallado aquí. Valores para el cociente de los dos a: de componentes mixtos b (y el número correspondiente de medidas) son 1:1 (28), 4:7 (13) y 1:2 (8).
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Discussion
Mientras que el método de indentación de esfera es fácil de implementar, debe prestarse atención cuidadosa a la elección de penetrador y el espesor de la muestra de silicona blanda. La ecuación utilizada para calcular el módulo de Young es válida bajo un conjunto de condiciones11y estos normalmente se satisfacen cuando el grueso de la muestra de silicona es > 10% del radio indentor y < ~ 13 x el radio del penetrador. Se encontró que un grueso de silicona de 5-10 x el radio del indentor fue una buena elección, en donde el grueso de la muestra no es demasiado alto (es decir, la distancia objetiva no es una limitación) y la rigidez calculada también no fue demasiado sensible a la valor exacto del espesor de silicona. La elección del penetrador esférico también debe ser tal que la δ de la profundidad de indentación es < 10% del espesor de silicona así como < 10% indentor del radio de la. Con estas consideraciones en mente, indentors de diferente material y diámetro pueden utilizarse para medir la rigidez de siliconas más suaves y más rígidos. La determinación de la profundidad de la indentación es el paso más crítico de este protocolo. El método propuesto en este protocolo para identificar imágenes en enfoque debería ayudar a determinar la profundidad de la indentación confiablemente. Cabe señalar que el cálculo de rigidez utilizado para el método de indentación de esfera utiliza teoría hertziana, que supone el contacto sin fricción. Aquí, se trata de una asunción buena para indentors de baja rugosidad. Aunque hemos utilizado un elastómero de silicón suave específico (listado en la Tabla de reactivos específicosde acompañamiento), otros kits de elastómero de silicona comercial pueden ser utilizados. Tenga en cuenta que la silicona rígida ampliamente utilizada para la microfabricación no es una buena opción para la fabricación de sustratos con rigidez en la gama de kPa. Sin embargo, siliconas suaves (que presenta rigidez en el extremo inferior de la gama kPa) se pueden mezclar con un pequeño porcentaje de silicona dura para hacer sustratos con rigidez en el extremo superior de la gama kPa. Según el elastómero, puede elegirse un penetrador con un diverso tamaño o densidad, siempre y cuando se cumplan las condiciones mencionadas anteriormente.
Algunas consideraciones claves para el acoplamiento de microesferas fluorescentes a la superficie de silicona suave son importantes. En primer lugar, elegimos 0,44 μm de carboxilatos debido a su contenido de fluoróforo y por lo tanto brillo era mayor que la de granos similares de menor tamaño. Tamaños de grano más pequeños se pueden utilizar si los granos contienen fluoróforos más brillante, pero sugerimos que deben usarse cuentas de carboxilato de sub-micron para no afectar negativamente a la resolución del método. La incubación de la superficie de la silicona con la mezcla EDC/sulfo-NHS/grano/col1 se realiza con la superficie de la silicona en una configuración invertida. La razón de esto es que, cuando la mezcla con los granos se coloca encima de la superficie de silicona, montones de grano se instalan sobre la superficie de la silicona, conducen a una pobre resolución espacial mientras que las microesferas fluorescentes son se va a examinar. Incluso con este protocolo, montones de grano fueron observadas de vez en cuando (regiones brillantes en la imagen superior en la figura 3). Sin embargo, no son suficientemente extensas para afectar la resolución del método. También es posible utilizar a espaciadores debajo de los bordes de cualquiera de las cajas Petri en la figura 1 para permitir que la superficie de la silicona en contacto con el líquido pero no la superficie sólida debajo de él. El acoplamiento de las microesferas a la superficie de la silicona blanda se puede realizar incluso sin un profundo paso de luz UV si microesferas con una capa hidrofóbica son elegidos. La medida de la rigidez se realiza en el sustrato final (después del tratamiento UV, acoplamiento del grano y acoplador de la ECM) en que las células pueden ser plateado. Debe tenerse en cuenta que se debe realizar una caracterización de la rigidez después de pasos (como el tratamiento UV) que pueden alterar posiblemente la rigidez del sustrato para que la medida de la rigidez es la que las células se expondrán a.
En lugar de un plato de Petri, una losa de PDMS rígido puede utilizarse como base para la silicona blanda14. Esta configuración puede utilizarse para la aplicación de un tramo de la externo a las células donde la silicona rígida proporciona el marco que se puede estirar, y la silicona suave proporciona un microambiente celular de rigidez que es más fisiológico. Tracción fuerza microscopía15,16también se puede realizar con las células plateadas en estos geles de silicona blanda7,8, y la presencia de microesferas fluorescentes en sólo la capa superior permite una buena resolución con sólo un microscopio de fluorescencia de campo amplio. En este protocolo se puedo sustituir con otras proteínas de matriz extracelular de colágeno. Comparado con métodos un poco más involucrados tales como microscopia de fuerza atómica, el método de indentación de esfera puede ser implementado más fácilmente, en general. La desviación en el medio de módulos de Young obtenidos mediante el método de indentación de la esfera respecto a determinado utilizando un reómetro es típicamente < 10%10. Así, el método de indentación de esfera (usando un microscopio de fluorescencia de campo amplio) proporciona un método accesible para la rigidez de la cuantificación de silicona blanda (o hidrogel) para aplicaciones en mecanobiología.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Margaret Gardel generosamente, lo que permite el uso del reómetro para. Reconocemos el apoyo de los NIH (1R15GM116082) que permitió a este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
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