מידה נוקשות של סובסטרטים סיליקון רך Mechanobiology מחקרים באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield
Summary
מצעים עם נוקשות ב קילו פסקל-הטווח שימושיות ללמוד תגובת התאים נוקשות סביבת מיקרו רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. שימוש רק מיקרוסקופ זריחה widefield, האלסטיות של ג’ל סיליקון רך יכול להיקבע באמצעות ההזחה עם כדור מתאים.
Abstract
בדרך כלל, רקמות רכות בגוף האדם יש נוקשות בטווח קילו פסקל (kPa). בהתאם לכך, סיליקון, הידרוג סובסטרטים גמיש הוכחו להיות סובסטרטים שימושי עבור culturing בתאים microenvironment הפיזי המחקה חלקית תנאים ויוו . כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט עבור אפיון מודולים של הצעירים של איזוטרופיות סובסטרטים אלסטי ליניארי משמש בדרך כלל עבור מחקרים mechanobiology. הפרוטוקול מורכב הכנת מצע סיליקון רך על צלחת פטרי או סיליקון נוקשה, ציפוי המשטח העליון של המצע סיליקון עם חרוזים פלורסנט, באמצעות כדור בקנה מידה מילימטר להכנסת המשטח העליון (על-ידי כוח הכבידה), הדמיה של פלורסנט חרוזים על משטח סיליקון עם כניסות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, וניתוח תוצאות תמונות כדי לחשב האלסטיות של המצע סיליקון. צימוד השטח העליון של המצע עם חלבון מטריצה חוץ-תאית מודולים (בנוסף החרוזים פלורסנט) מאפשר את המצע סיליקון לשמש בקלות יופיצ תא, מחקרים מאוחרים יותר באמצעות ניסויים מיקרוסקופ כוח המתיחה. השימוש סיליקון נוקשה, במקום צלחת פטרי, כבסיס של שהסיליקון רך, מאפשר את השימוש mechanobiology מחקרים שכללו מתח חיצוני. יתרון מסוים של פרוטוקול זה הוא מיקרוסקופ זריחה widefield, אשר זמין בדרך כלל במעבדות רבות, הציוד העיקרי הנדרש בהליך זה. נדגים לפרוטוקול זה על ידי מדידת האלסטיות של סובסטרטים סיליקון רך של מודולים שונים אלסטי.
Introduction
תאים ברקמות רכות לשכון בסביבת מיקרו-נוקשות של מי זה קילו פסקל טווח1, בניגוד מנות תרביות רקמה נוקשות של מי הוא במספר סדרי גודל גבוה יותר. הניסויים הראשונים עם תאים מצופים חלבון מצעים רכים מטריצה חוץ-תאית הראה כי הקשיחות המצע השפעות כמה תאים הלאה וכן לדבוק מטריצות מתחת2,3. למעשה, הקשיחות המצע משפיעה באופן מהותי את הפונקציה תא4 באופן דומה על אותות ביוכימיים נרחבת. ג’לים לזיהוי (מצופה עם מטריצה חוץ-תאית חלבונים) הם (המגובש מים) hydrogels כי שימשו בהרחבה כתא תרבות מצעים עבור mechanobiology מחקרים5. Polydimethylsiloxane (PDMS), שהסיליקון הנפוץ ביותר (ששינינו), כבר בשימוש נרחב כמו סיליקון נוקשה עם נוקשות מגה פסקל-טווח עבור ייצור בקנה מידה מיקרון6. יותר לאחרונה, סיליקון רך מצעים עם נוקשות בטווח קילו פסקל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית יש כבר מועסקים בשם דיאלקטריים תרבות תא mechanobiology מחקרים7,8.
מספר שיטות השתמשו כדי למדוד את הנוקשות של מצעים גמיש, כולל מיקרוסקופ כוח אטומי, דפורמציה מאקרוסקופית של כל הדגימות על מתיחות, rheology וכניסה באמצעות כדורים והודיע כדורית microindentors9 . בעוד כל טכניקה יש יתרונות וחסרונות משלה, כניסה עם כדור היא שיטה פשוטה במיוחד אך מדויק למדי כי רק מחייב הגישה אל המיקרוסקופ זריחה widefield. כניסה עם כדור מתכתי שימש כדי למדוד את הנוקשות של hydrogels9,3,מוקדמת עבודה10. עבודה מוקדמת הראו את החשיבות של קשיחות המצע תא לתנועה מנוצל שיטה זו כדי לקבוע הידרוג המצע נוקשות3. לאחרונה, מיקרוסקופיה קונפוקלית שימש גם אפיון אלגנטי10.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד להכנת מצע סיליקון רך, צימוד חרוזים פלורסנט (וחלבון מטריצה חוץ-תאית כמו קולגן אני) רק כדי המשטח העליון, הדמיה של הספרה כניסות טקסט באמצעות משטח עליון שלב ו קרינה פלואורסצנטית הדמיה, בהתאמה, ולבסוף ניתוח התמונות כדי לחשב האלסטיות של המצע סיליקון. המצע סיליקון רך שהוכנו בצורה זו ניתן בקלות לניסויים מיקרוסקופ כוח המתיחה. השימוש של סיליקון נוקשה (במקום צלחת פטרי) כבסיס עבור שהסיליקון רך מאפשר גם מחקרים mechanobiology באמצעות רצועת חיצוניים. ובמידת הצורך להימנע סיבוכים אפשריים שיקולים מעשיים גם מצוינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד השיטה כניסה פרנה קלה לביצוע, תשומת לב רבה ישולם הבחירה של indentor ואת העובי של המדגם סיליקון רך. המשוואה לחישוב מודול האלסטיות הוא חוקי תחת תנאים11, אלה הם בדרך כלל מרוצה כאשר העובי של המדגם סיליקון > 10% של הרדיוס indentor ו < ~ 13 x רדיוס indentor. מצאנו כי סיליקון עובי של 5-10 x רדיוס indentor הי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים מרגרט גרדל בנדיבות להתרת השימוש rheometer. אנו להכיר תמיכה של NIH (1R15GM116082) שיאפשרו עבודה זו.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M., Cassimeris, L., Tran, P. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. , 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
