Summary
Underlag med stivhet i kilopascal-området er nyttig å studere svaret celleområde fysiologisk relevante mikro-miljø stivhet. Bruker bare widefield fluorescens mikroskop, kan den unge modulus myk silikon gelé bestemmes et innrykk med en egnet sfære.
Abstract
Myke vev i kroppen har vanligvis stivhet i fjellkjeden kilopascal (kPa). Følgelig, silikon og hydrogel fleksibel underlag er påvist for å være nyttig substrater for dyrking celler i en fysisk microenvironment som etterligner delvis i vivo forhold. Her presenterer vi en enkel protokoll for å karakterisere den unge moduli av isotropic lineære elastiske underlag brukes vanligvis for mechanobiology studier. Protokollen består av forbereder en myk silikon substrat på en Petriskål eller stiv silikon belegg overflaten av silikon underlaget med fluorescerende perler, bruker en millimeter skala kule rykke inn overflaten (av tyngdekraften), imaging den selvlysende fargen perler på innrykket silikon overflaten bruker fluorescens mikroskop, og analysere resulterende bildene til å beregne den unge modulus av silikon underlaget. Kopling underlagets overflaten med en moduli ekstracellulær matrix proteiner (i tillegg til fluorescerende perler) kan silikon underlaget kan lett brukes til celle plating og etterfølgende studier med trekkraft force mikroskopi eksperimenter. Bruk av stive silikon, i stedet for en Petriskål, som grunnlag for myk silikon, muliggjør bruk av mechanobiology studier som involverer eksterne strekningen. En bestemt fordel av denne protokollen er at en widefield fluorescens mikroskop, som er allment tilgjengelig i mange laboratorier, store utstyret som er nødvendig for denne prosedyren. Ved å måle den unge modulus av myk silikon underlag av ulike elastiske moduli viser vi denne protokollen.
Introduction
Celler i bløtvev ligge i en mikro-miljø som stivhet i kilopascal område1, i motsetning til vev kultur retter som stivhet er flere størrelsesordener høyere. Tidlige eksperimenter med celler i ekstracellulær matrix proteiner-belagt mykt underlag viste at substrat stivheten påvirker hvordan flytte på tillegg overholder den ekstracellulære matrisen under2,3. Faktisk påvirker substrat stivheten fundamentalt celle funksjon4 på samme måte som til gjennomgripende biokjemiske signaler. Polyakrylamid gels (belagt med ekstracellulær matrix proteiner) er (vann-gjennomsyre) hydrogels som er mye brukt som celle kultur underlag for mechanobiology studier5. Polydimethylsiloxane (PDMS), den vanligste silikon (polysiloxane), har vært mye brukt som en stiv silikon med megapascal rekkevidde stivhet i mikro-skala fabrikasjon6. Mer nylig myk silikon underlag med stivhet i området mer fysiologisk relevante kilopascal har vært ansatt som celle kultur substrater for mechanobiology studier7,8.
Flere metoder har blitt brukt til å måle stivhet av fleksible underlag, inkludert atomic force mikroskopi, makroskopisk deformasjon av hele prøver på stretching, Reologi og innrykk med kuler og sfærisk tippet microindentors9 . Mens hver teknikk har sine egne fordeler og ulemper, er innrykk med en kule en spesielt enkel, men ganske nøyaktig metode som bare krever tilgang til widefield fluorescens mikroskop. Innrykk med en metallisk kule har blitt brukt til å måle stivhet av hydrogels i tidligere arbeid3,9,10. Tidlig arbeid som vist betydningen av underlaget stivhet celle bevegelse utnyttet denne metoden for å bestemme hydrogel substrat stivhet3. Flere nylig, AC confocal mikroskopi er også brukt for en elegant karakterisering10.
Her presenterer vi en trinnvis protokoll for å forberede en myk silikon underlaget, kopling fluorescerende perler (og en ekstracellulær matrix proteiner som kollagen jeg) bare til toppen overflaten, tenkelig et innrykk sfære og topp overflate ved hjelp fase og fluorescens tenkelig, henholdsvis, og til slutt analysere bildene til å beregne den unge modulus av silikon underlaget. Myk silikon underlaget forberedt på denne måten kan lett brukes for trekkraft force mikroskopi eksperimenter. Bruk av stive silikon (i stedet for en Petriskål) som base for myk silikon kan også mechanobiology studier med en ekstern stretch. Hvor berettiget, angis også praktiske hensyn nødvendig for å unngå mulige komplikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikasjon av myk silikon substrat
- Veie ut 1,75 g av en component og 1,75 g av B-komponenten (A:B = 1:1) i myk silikon-elastomer Kit bruke (polystyren) veier skuffer.
- Legge til en component B-komponenten i veiing skuffen og bland dem sammen i 5 minutter ved hjelp av en passende applikatoren pinne.
- Legge til ovennevnte blanding 35 mm Petriskål. La blandingen til spredt jevnt utover Petriskål for et par minutter.
Merk: Valg av Petriskål diameter og mengden av myk silikon avgjør myk silikon tykkelsen. Her vil tykkelsen være rundt 3,5 mm; mer om å velge elastomer tykkelsen under diskusjon . - Plass Petriskål med silikon blandingen, med lokk, i et vakuum kammer i 15 min fjerne eventuelle luftbobler. Samtidig Forvarm en varm plate til 70 ° C.
- Når kokeplate når 70 ° C, Plasser et objektglass på det og deretter plassere Petriskål med silikon blandingen på av objektglass. La silikon cure på 70 ° C i 30 min. Ikke plass polystyren parabolen direkte på kokeplate, som Petriskål kan smelte.
2. koblingen av fluorescerende Microbeads til myk silikon
- Plass kurert myk silikon (i avdekket Petriskål) i en dyp UV kammer (en boks med en dyp UV-lampe av lys bølgelengder av 185 og 254 nm). Utsett myk silikon prøven (~ 5-10 cm fra UV-lampen) for dyp UV-lys for 5 min.
- Mens silikon utsettes for dyp UV lys, fortsetter du med trinnene 2.2-2.6 nedenfor. Etter dype UV eksponering, degas dyp UV kammeret i minst 5 minutter før du henter prøven.
- I mellomtiden veie ut 19 mg av 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) i en 1,5 mL microcentrifuge rør og å legge 500 μL deionisert vann (DI) vann. Oppløse EDC av forsiktig risting røret.
- I en separat 1,5 mL microcentrifuge tube, veie ut 11 mg av N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), å legge 500 μL DI vann og oppløse sulfo-NHS av forsiktig risting røret. Deretter kombinere EDC og sulfo-NHS løsninger i et enkelt microcentrifuge rør.
- EDC/sulfo-NHS løsningen, legge 30 μL 0.44 μm diameter rød (eller noen annen fluorescens farge basert på filteret kuber i fluorescens mikroskopet) carboxylate endret fluorescerende microbeads (med en 1% w/v lager konsentrasjon).
- EDC/sulfo-NHS/perle blandingen, legge 0.02 mg av kollagen I (fra en rotte hale, lager konsentrasjon av 4 mg/mL i 0.02 M eddiksyre) å få en konsentrasjon av ca 0.02 mg/mL.
- Vortex EDC/NHS/bead/kollagen jeg blanding kort for å sikre at perlene er jevnt spredt over hele, før kopling.
- Pipetter 1 mL av EDC/NHS/bead/kollagen jeg blandingen på et stykke parafilm plasseres over en annen grunne, flat lokk (med mindre diameter). Invertere Petriskål med myk silikon på denne blandingen slik at myk silikon overflaten kontakter blanding men ikke direkte touch overflate mindre Petriskål lokket nedenfor. For å heve invertert Petriskål, kan du bruke ett eller to glass lysbilder under hver side av invertert Petriskål avstandsstykkene.
Merk: Se figur 1 for å se hvordan steg 2,7 utføres. - Dekker utvalget med aluminiumsfolie og ruge det ved romtemperatur for 30 min.
- Fjerne Petriskål med myk silikon og sette den oppreist (silikon-side opp).
- Vask myk silikon overflaten med fosfat-bufret saltvann (PBS) ved å legge til 2 mL PBS (pH 7.4) parabolen. La det sitte i noen minutter. Sug opp på PBS og vask silikon igjen med 2 mL PBS. La silikon kur videre for om en dag. Derfor plass myk silikon prøven i PBS 37 ° C over natten.
3. måling av silikon stivhet med kule innrykk med Widefield fluorescens mikroskop
- Hente Petriskål med myk silikon og kontrollere at den inneholder minst 1 mL av PBS har silikon overflaten flere mm under flytende overflaten.
- Bruke spisse pinsett, slipp fem 1 mm zirkonium kule indentors på myk silikon. Fordype kulene til flytende medium og slipp dem fra kantene av silikon laget og minst 5 indentor diameter fra plasseringen av de andre indentors.
Merk: Når falt over flytende overflaten, kulene mislykkes å gå inn i flytende medium (flyt) på grunn av den flytende medium overflatespenningen. - Plass Petriskål med myk silikon på scenen mikroskopet slik at det er mulig å bildet gjennom Petriskål base.
- Fase bildebehandling med en 10 X målsetting (som en tørr 10 X objektive av NA 0,30), finne og få en kule indentor i fokus.
- Ta en fase bildet av en del eller hele indentor og lagre dette bildet. Bruke en flis skanning hvis tilgjengelig. Hvis indentor har noen synlige feil, kast og erstatte den med en annen indentor.
- Under bor fase bildebehandling, Panorer til venstre for den indentor kant slik at den venstre kanten av rammen er minst en avstand på ~1.5 R fra indentor center. Påse at midten av indentor vises på høyre side, nær den høyre kanten av bilderammen. Ta en fase bilde og lagre den.
- Bytte mikroskop lyskilden til belysning for rød fluorescerende kanalen. Med x- og y-koordinater uendret ( x-y -posisjon i indentor center i men ved den høyre kanten av rammen), fokus ned (reduksjon Z) til den røde fluorescerende microbeads under den kule indentor center bare gå ute av fokus.
- Ta en z-stabel med et bilde for hver z-økning på 0,5 µm til microbeads i det øverste laget av silikon langt fra indentor (nær den venstre kanten av tenkelig rammen) går ute av fokus.
- Gjenta 3.4-3.8 med de andre indentors på prøven.
4. beregning av Silikons stivhet (Youngs modul)
- Åpne fase bildet av indentor bruker ImageJ, klikk på linjeverktøyet, og måle på indentor diameter i piksler. Klikk og hold på et punkt på indentor kanten, flytte markøren til et diametralt motsatt punkt på kanten og Merk lengde i piksler vises på statuslinjen i hovedvinduet ImageJ før du slipper markøren.
- Kontroller at enheten lengde er satt til piksler ved å klikke analyser | Angi skala og sjekke måleenhet.
- Konvertere den indentor radius i piksler til μm ved tar hensyn objektive forstørrelsen og CCD kamera pikselstørrelsen (R i μm = R i piksler x CCD kamera pikselstørrelsen i μm / objektiv forstørrelsen).
- Åpne den røde kanalen z stabelen microbead bilder (hvis microbeads røde fluorescerende) i ImageJ ved å klikke på filen | Importer | Bildet sekvens og velge et bilde i stakken, og klikk OK for å åpne stakken.
Merk: F1 er bildenummer som microbeads under indentor center har det best mulig fokuset og F2 er bildenummer som microbeads (i en region av ~1.5 R fra perle midten) nær den venstre kanten av rammen er i best mulig fokus. Z-forskjellen mellom de to rammene er innrykk dybde ses.- Bruker linjeverktøyet i ImageJ, tegne en linje over en veldefinert microbead i bildet. Klikk på analysere | Plot profil og klikk på knappen Live å få oppdatert linje skanning intensiteten over perlen mens du merker forskjellige rammer. Rammen som gir den høyeste verdien av den maksimale intensiteten kan velges som rammen i fokus.
- Siden z-intervall mellom i z-stakken er 0,5 μm, beregne innrykk dybden i μm som ses = (F2-F1) x 0,5.
- Beregne utøves på gel av indentor såpass (minus motstanderens spenstig kraft), som er innrykket tvinge F, volumet indentor x (tettheten av indentor - tettheten av flytende medium) x akselerasjon som skyldes gravitasjonen. Bruke ligningen F = (4/3) x 3.142 x (R3) x (ρindentor - ρmedium) x g der R er radius for indentor, ρindentor er indentor, ρMiddels tetthet g er akselerasjonen som skyldes gravitasjonen (9.81 m/s2) er tettheten av flytende medium. Uttrykke alle antall på høyre side i SI enheter hente F (i N).
- Beregn den unge modulus (E) av silikon med en modifisert11 Hertz modell12 ligningen:
Hvor:
c = en korreksjonsfaktor som endrer Hertz modell uttrykket som følger.
v = Poissons forholdet silikongel (tatt som 0,5 for incompressible materialer7);
F = innrykk force;
R = indentor radius; og
Ses = innrykk dybden.
Uttrykke alle antall på høyre side i SI enheter hente E i Pa.- Beregne korreksjon faktor c som følger3:
Hvor:
; og
.
Det bør bemerkes at denne korrigeringsfaktoren er spesielt skal brukes bare når myk silikon fester seg godt til Petriskål (eller stiv silikon) under den (som er tilfelle her). - Beregn høyden h myk silikon lag basert på mengden av silikon lagt og Petriskål diameter. Eventuelt få h direkte ved å fastsette z-koordinaten for øvre og nedre overflater av silikon laget av fase tenkelig (mindre urenheter kommer i fokus på enten overflaten). Merk at for en stor h (h2 > Rδ), korreksjon faktor c ligger 1.
- Beregne korreksjon faktor c som følger3:
- Gjenta trinn 4.1-4,4 for hver indentor. Gjennomsnittlig de unge modulus fra hver indentor å få de mener unge modulus for silikon prøven.
; og
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, vi forberedt myk silikon i 35 mm Petriskål, helbredet den på 70 ° C i 30 min og kombinert fluorescerende microbeads (og kollagen jeg) til toppen overflaten som skjematisk avbildet i figur 1. Dyp UV har brukt tidligere for eventuell protein kopling til underlag13. Merk at herding betingelsene her er spesifikke for dette myk silikon og (II) innrykk måling utføres på dagen som myk silikon forventes å kurere videre i løpet av en dag.
Ulike parametere som karakteriserer sfærisk innrykkingen av silikon overflaten er vist i figur 2A. Fase imaging brukes til å ta enten (I) hele bildet av indentor som vist i figur 2B (med bilde stitching, om nødvendig) eller (II) en del av bildet av sfæren. Parameterne for å være avledet fra den indentor bildet er diameter. For eksempel for indentor vi brukte med 1:1 myk silikon i denne protokollen, hadde ulike personlige indentors fra samme mye diameter som varierte fra 950 µm til 1200 µm betyr verdien 1,037 µm og et standardavvik på 47 µm (8 indentors). Merk at diameteren til en bestemt indentor (i stedet for gjennomsnittlig diameter for mange indentors) skal brukes for stivhet beregningen for innrykk-indusert av den spesielle indentor.
Fluorescerende bilder av microbeads på overflaten av silikon er tatt på en x-y ramme posisjon slik at regionen under indentor er i langt høyre del av rammen. Regionen i langt til venstre del av rammen er valgt å regionen fra indentor som vist i figur 3. Z-stakk bilder av regionene under indentor og fra indentor vises i figur 3også. For 1 mm diameter zirkonium indentor brukes med 1:1 myk silikon, z-verdiene som regionene 2 kommer i fokus skilte seg av 20 µm (ses). Dette er mye mindre enn tykkelsen på myk silikon, som var rundt 3500 µm. bruke tetthet (4.66 g/cm3) by indentor (som er faktisk laget av en blanding av zirkonium karbondioksid og silisium dioksid) og tetthet av væsken Middels (for PBS: 1.01 g/cm3), den netto kraften på silikon kan beregnes. Saken under vurdering var det i 20-25 µN området. Den unge modulus vi beregnet for 11: myk silikon var 7,2 ± 2.4 kPa (fra 28 steder samles fra 6 uavhengige utvalg). Representant resultatene for andre A:B forholdstall for samme myk silikon (angitt i tilhørende Tabell av bestemte reagenser) er gitt i tabell 1. Til slutt, for å validere sfære innrykk metoden bruker widefield mikroskop som vi beskrevet i denne protokollen, vi også målt den unge moduli av en polyakrylamid gel vi preget med en rheometer å ha en ung modulus av 21 ± 3 kPa. Med metoden sfære innrykk i denne protokollen bruker widefield mikroskop ble polyakrylamid gel av samme sammensetning funnet for å ha en ung modulus av 22,1 ± 4.2 kPa, som indikerer en god avtale10. Ting å ta hensyn til mens utfører disse målingene er adressert under diskusjon.
Figur 1: skjematisk fremstilling av fremgangsmåten for å koble fluorescerende microbeads til toppen overflaten av myk silikon. (A) myk silikon som har blitt kurert er utsatt for dyp UV lys for 5 min. (B) A blanding av EDC, sulfo-NHS, perler og kollagen I vann er pipetted ned på et stykke parafilm plasseres over lokk med mindre diameter. (C) myk silikon prøven er invertert på denne blandingen slik at det er i kontakt med væske, men ikke med overflaten av mindre lokket under. To glass lysbilder på hver side, under Petriskål, fungere som avstandsstykker. (D) etter vask prøven med PBS, myk silikon overflaten belagt med fluorescerende microbeads er klar for stivhet måling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk illustrasjon av kule innrykk av myk silikon overflaten. (A) denne skjematisk fremstilling viser en sfærisk indentor på overflaten av en myk silikon prøve. Ulike parametere av interesse vises. (B) dette panelet viser et bilde av en 1 mm indentor (på en myk silikon utvalg) innhentet via fase bildebehandling. Baren skala angir 250 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: perle bildeopptak og fastsetting av bildet i fokus. (A) fluorescens bildet viser microbeads på overflaten av myk silikon prøven og ønsket x-y plassering av rammen i forhold til indentor (stiplet linje). Baren skala angir 150 µm. paneler B og C viser z stabel fluorescens bilder av områder på myk silikon overflaten (B) under indentor og (C) fra indentor (eske regioner i øverste bildet). Indikatorer z1 og z2 tilsvarer z-verdiene som regionen under indentor og regionen fra indentor er i fokus, henholdsvis. Skala stolper angir 20 µm. Monokrombilder vises er de innhentet i den røde kanalen siden nominelt rosa microbeads ble brukt som eksitasjon og utslipp profiler passer den røde kanalen. (D) dette panelet viser en intensitet linje skanning over en mikro-perle (vist i rammemarg bildet med en gul linje over den) som fokus er variert i z-trinn på 0,5 µm. Fokus (z-verdi) tilsvarer i fokus bildet kan objektivt velges basert på z-verdien som tilsvarer linje Skann med den høyeste maksimale intensiteten. Baren skala i rammemargen angir 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Silikon-elastomer * A:B | Youngs Modulus ** (kPa) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * angitt i tilhørende tabell av bestemte reagenser/utstyr ** som målt med kule innrykk metoden bruker widefield mikroskop som beskrevet i denne protokollen |
|
Tabell 1. Youngs modulus myk silikon (for bestemt silikon angitt i tabell av bestemte reagenser/utstyr) for forskjellige komposisjoner som målte bruker protokollen detaljert her. Verdier for forholdet mellom de to blandet komponenter A:B (og tilsvarende antall mål) er 1:1 (28), 4:7 (13) og 1:2 (8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens metoden sfære innrykk er lett å implementere, må forsiktig oppmerksomhet betales til valg av indentor og tykkelsen på myk silikon prøven. Formelen brukes til å beregne den unge modulus er gyldig under en rekke forhold11og dette er vanligvis oppfylt når tykkelsen av silikon prøven er > 10% av indentor radius og < ~ 13 x indentor radius. Vi fant at silikon tykkelse på 5-10 x indentor radius var et godt valg, hvor eksempel tykkelsen ikke er for høyt (dvs.den objektive arbeidsavstand ikke blir en begrensning) og beregnede stivhet var heller ikke for følsom til den nøyaktige verdien av silikon tykkelsen. Valg av sfærisk indentor bør også være slik at innrykk dybde ses < 10% av silikon tykkelsen samt < 10% av indentor radius. Med disse betraktninger i tankene, kan indentors av både ulike materialer og diameter brukes til å måle stivhet av mykere og stivere silikoner. Fastsettelse av innrykk dybden er det mest kritiske trinnet av denne protokollen. Metoden foreslått i denne protokollen til å identifisere i fokus bilder bør bidra til å fastsette innrykk pålitelig. Det bør også bemerkes at stivhet beregningen som brukes for sfære innrykk metoden bruker Hertzian teori, som forutsetter friksjonsfritt kontakt. Her er dette en god forutsetning for indentors lav grovheten. Mens vi har brukt en bestemt myk silikon-elastomer (oppført i tilhørende Tabell av bestemte reagenser), kan andre kommersielle silikon-elastomer kits brukes. Merk at stiv silikon mye brukt for microfabrication er ikke et godt valg for å gjøre underlag med stivhet i området kPa. Men kan myk silikoner (som har stivhet i den nedre enden av fjellkjeden kPa) blandes med en liten prosentandel av stive silikon gjøre underlag med stivhet i høyere enden av fjellkjeden kPa. Avhengig av elastomer, kan en indentor med en annen størrelse eller tetthet velges, så lenge vilkårene nevnt tidligere er fornøyd.
Noen viktige hensyn for koblingen av fluorescerende microbeads myk silikons topp overflate er viktig. Først av alt, vi valgte 0.44 µm carboxylate perler fordi fluorophore innholdet og dermed lysstyrke var større enn lignende perler av mindre størrelse. Mindre bead størrelser kan brukes hvis perlene inneholder lysere fluorophores, men vi anbefaler at sub-mikron carboxylate perler bør brukes for ikke å påvirke oppløsningen for metoden. Inkubasjonstiden for silikon overflaten med EDC/sulfo-NHS/bead/Kol1 blandingen utføres med silikon overflaten i en invertert konfigurasjon. Grunnen til dette er at, når blandingen med perler plasseres oppå silikon overflaten, utligne perle klumper på silikon overflaten, fører til en dårlig romlig oppløsning mens fluorescerende microbeads er å bli fotografert. Selv med denne protokollen, var perle klumper tidvis observert (lyse områder i den øverste bildet i Figur 3). De er imidlertid ikke omfattende nok til å påvirke metodens oppløsning. Det er også mulig å bruke avstandsstykker under kantene på enten Petri retter i figur 1 c at silikon overflaten kontakte væsken men ikke solid overflaten under den. Koblingen av microbeads til toppen overflaten av myk silikon kan utføres selv uten en dyp UV lys trinn hvis microbeads med en hydrofobe coating er valgt. Stivhet måling utføres på det siste substratet (etter UV-behandling, perle kopling, og ECM kopling) på hvilke celler kan være belagt. Det skal bæres i bakhodet at stivhet karakteristikk skal utføres etter skritt (for eksempel UV-behandling) som kan muligens endre substrat stivhet slik at målt stivhet som cellene vil bli utsatt for.
I stedet for en Petriskål, kan en skive av stive PDMS brukes som grunnlag for myk silikon14. En slik konfigurasjon kan brukes for å anvende en ekstern stretch celler der stiv silikon gir rammen som kan strekkes, og myk silikon gir en celle mikro-miljø av stivhet som er mer fysiologiske. Trekkraft force mikroskopi15,16kan også utføres med celler belagt på disse myk silikon gels7,8, og tilstedeværelsen av fluorescerende microbeads i bare det øverste laget gjør en god oppløsning med bare widefield fluorescens mikroskop. Kollagen I denne protokollen kan erstattes med andre ekstracellulær matrix proteiner. Sammenlignet med litt mer involvert metoder som atomic force mikroskopi, kan kule innrykk metoden implementeres lettere, generelt. Avvik i gjennomsnittet Youngs moduli innhentet med metoden sfære innrykk sammenlignet bestemmes ved hjelp av en rheometer er vanligvis < 10%10. Dermed gir sfære innrykk metoden (med widefield fluorescens mikroskop) en tilgjengelig metode for kvantifisering av myk silikon (eller hydrogel) stivhet for programmer i mechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Margaret Gardel for sjenerøst tillater bruk av rheometer. Vi anerkjenner støtte fra NIH (1R15GM116082) aktivert dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
