Summary
מצעים עם נוקשות ב קילו פסקל-הטווח שימושיות ללמוד תגובת התאים נוקשות סביבת מיקרו רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. שימוש רק מיקרוסקופ זריחה widefield, האלסטיות של ג'ל סיליקון רך יכול להיקבע באמצעות ההזחה עם כדור מתאים.
Abstract
בדרך כלל, רקמות רכות בגוף האדם יש נוקשות בטווח קילו פסקל (kPa). בהתאם לכך, סיליקון, הידרוג סובסטרטים גמיש הוכחו להיות סובסטרטים שימושי עבור culturing בתאים microenvironment הפיזי המחקה חלקית תנאים ויוו . כאן, אנו מציגים פרוטוקול פשוט עבור אפיון מודולים של הצעירים של איזוטרופיות סובסטרטים אלסטי ליניארי משמש בדרך כלל עבור מחקרים mechanobiology. הפרוטוקול מורכב הכנת מצע סיליקון רך על צלחת פטרי או סיליקון נוקשה, ציפוי המשטח העליון של המצע סיליקון עם חרוזים פלורסנט, באמצעות כדור בקנה מידה מילימטר להכנסת המשטח העליון (על-ידי כוח הכבידה), הדמיה של פלורסנט חרוזים על משטח סיליקון עם כניסות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, וניתוח תוצאות תמונות כדי לחשב האלסטיות של המצע סיליקון. צימוד השטח העליון של המצע עם חלבון מטריצה חוץ-תאית מודולים (בנוסף החרוזים פלורסנט) מאפשר את המצע סיליקון לשמש בקלות יופיצ תא, מחקרים מאוחרים יותר באמצעות ניסויים מיקרוסקופ כוח המתיחה. השימוש סיליקון נוקשה, במקום צלחת פטרי, כבסיס של שהסיליקון רך, מאפשר את השימוש mechanobiology מחקרים שכללו מתח חיצוני. יתרון מסוים של פרוטוקול זה הוא מיקרוסקופ זריחה widefield, אשר זמין בדרך כלל במעבדות רבות, הציוד העיקרי הנדרש בהליך זה. נדגים לפרוטוקול זה על ידי מדידת האלסטיות של סובסטרטים סיליקון רך של מודולים שונים אלסטי.
Introduction
תאים ברקמות רכות לשכון בסביבת מיקרו-נוקשות של מי זה קילו פסקל טווח1, בניגוד מנות תרביות רקמה נוקשות של מי הוא במספר סדרי גודל גבוה יותר. הניסויים הראשונים עם תאים מצופים חלבון מצעים רכים מטריצה חוץ-תאית הראה כי הקשיחות המצע השפעות כמה תאים הלאה וכן לדבוק מטריצות מתחת2,3. למעשה, הקשיחות המצע משפיעה באופן מהותי את הפונקציה תא4 באופן דומה על אותות ביוכימיים נרחבת. ג'לים לזיהוי (מצופה עם מטריצה חוץ-תאית חלבונים) הם (המגובש מים) hydrogels כי שימשו בהרחבה כתא תרבות מצעים עבור mechanobiology מחקרים5. Polydimethylsiloxane (PDMS), שהסיליקון הנפוץ ביותר (ששינינו), כבר בשימוש נרחב כמו סיליקון נוקשה עם נוקשות מגה פסקל-טווח עבור ייצור בקנה מידה מיקרון6. יותר לאחרונה, סיליקון רך מצעים עם נוקשות בטווח קילו פסקל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית יש כבר מועסקים בשם דיאלקטריים תרבות תא mechanobiology מחקרים7,8.
מספר שיטות השתמשו כדי למדוד את הנוקשות של מצעים גמיש, כולל מיקרוסקופ כוח אטומי, דפורמציה מאקרוסקופית של כל הדגימות על מתיחות, rheology וכניסה באמצעות כדורים והודיע כדורית microindentors9 . בעוד כל טכניקה יש יתרונות וחסרונות משלה, כניסה עם כדור היא שיטה פשוטה במיוחד אך מדויק למדי כי רק מחייב הגישה אל המיקרוסקופ זריחה widefield. כניסה עם כדור מתכתי שימש כדי למדוד את הנוקשות של hydrogels9,3,מוקדמת עבודה10. עבודה מוקדמת הראו את החשיבות של קשיחות המצע תא לתנועה מנוצל שיטה זו כדי לקבוע הידרוג המצע נוקשות3. לאחרונה, מיקרוסקופיה קונפוקלית שימש גם אפיון אלגנטי10.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול צעד אחר צעד להכנת מצע סיליקון רך, צימוד חרוזים פלורסנט (וחלבון מטריצה חוץ-תאית כמו קולגן אני) רק כדי המשטח העליון, הדמיה של הספרה כניסות טקסט באמצעות משטח עליון שלב ו קרינה פלואורסצנטית הדמיה, בהתאמה, ולבסוף ניתוח התמונות כדי לחשב האלסטיות של המצע סיליקון. המצע סיליקון רך שהוכנו בצורה זו ניתן בקלות לניסויים מיקרוסקופ כוח המתיחה. השימוש של סיליקון נוקשה (במקום צלחת פטרי) כבסיס עבור שהסיליקון רך מאפשר גם מחקרים mechanobiology באמצעות רצועת חיצוניים. ובמידת הצורך להימנע סיבוכים אפשריים שיקולים מעשיים גם מצוינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור של מצע סיליקון רך
- שוקלים לצאת 1.75 גרם של רכיב ה-A ו- g 1.75 של רכיב ה-B (A:B = 1:1) אלסטומר סיליקון רך הערכה באמצעות (פוליסטירן) במשקל של מגשים.
- הוסף את הרכיב A אל רכיב B במגש במשקל ומערבבים אותם יחד במשך 5 דקות באמצעות מקל של המוליך המתאים.
- להוסיף את התערובת מעל 35 מ מ פטרי. לאפשר את התערובת נמרח על פני הפטרי לכמה דקות.
הערה: הבחירה של קוטר צלחת פטרי ואת מידת סיליקון רך יקבע את עובי סיליקון רך. . כאן, העובי יהיה בסביבות 3.5 mm; עוד על בחירת העובי elastomer במקטע דיון . - מקם את צלחת פטרי עם התערובת סיליקון, עם המכסה, תא ואקום למשך 15 דקות להסיר את כל בועות האוויר. במהלך תקופה זו, מראש בחום תנור ל 70 מעלות צלזיוס.
- ברגע הכיריים מגיע ל- 70 מעלות צלזיוס, במקום זכוכית על זה ולאחר מכן מקם את צלחת פטרי עם התערובת סיליקון בשקופית זכוכית. תן שהסיליקון התרופה ב 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. אין למקם את המנה פוליסטירן ישירות על הכיריים, כפי הפטרי עלול להמיס.
2. צימוד של פלורסנט. גרגרי כדי שהסיליקון רך
- מקום של סיליקון רך נרפא (בצלוחית הפטרי חשפו) תא UV עמוק (מארז עם מנורת UV עמוק של אורכי גל אור של 185 ו- 254 ננומטר). לחשוף את הדגימה סיליקון רך (~ 5-10 ס מ מן המנורה UV) עמוק אולטרא סגול במשך 5 דקות.
- בעוד שהסיליקון הוא נחשף לאור UV עמוק, להמשיך עם שלבים 2.2-2.6 להלן. לאחר החשיפה UV עמוק, דגה תא UV עמוק למשך לפחות 5 דקות לפני מאחזר את הדגימה.
- בינתיים, שוקל את 19 מ"ג של 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) צינור microcentrifuge 1.5 mL ולהוסיף 500 μL של מים מים יונים (די) זה. להמיס את EDC ע י ניעור בעדינות את הצינור.
- בשפופרת microcentrifuge mL 1.5 נפרדים, שוקל את 11 מ"ג של N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), להוסיף לו 500 μL DI מים, להמיס sulfo-בקופת חולים ע י ניעור בעדינות את הצינור. לאחר מכן, לשלב את הפתרונות EDC, sulfo-NHS צינור microcentrifuge יחיד.
- זה פתרון EDC/sulfo-NHS, להוסיף 30 μL של 0.44 μm קוטר אדום (או כל צבע פלורסצנטיות אחר המבוסס על קוביות המסנן זמין המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית) carboxylate שונה פלורסנט. גרגרי (עם ריכוז w/v 1% מניות).
- לתערובת EDC/sulfo-NHS/חרוז, להוסיף 0.02 נקודות מ ג של קולגן אני (מתוך זנב החולדה, ריכוז מניות של 4 מ ג/מ ל חומצה אצטית מ' 0.02 נקודות) בריכוז של-0.02 נקודות מ"ג/מ"ל.
- מערבולת EDC/NHS/חרוז/הקולגן אני תערובת בקצרה על מנת להבטיח כי החרוזים הם שווה הפזורים, לפני צימוד.
- פיפטה 1 מ"ל של EDC/NHS/חרוז/הקולגן אני תערובת על חתיכה של מצלמות-מיקרוסקופים הממוקמת מעל המכסה שטוח רדוד, אחרת (של קוטר קטן יותר). היפוך על צלחת פטרי עם סיליקון רך על תערובת זו כך משטח סיליקון רך יוצר קשר עם התערובת אך אינו נוגע ישירות השטח של המכסה פטרי קטן למטה. כדי להעלות את צלחת פטרי הפוכה, השתמש שקופיות זכוכית אחד או שניים מתחת צדי קפיציות פטרי הפוכה.
הערה: נא עיין באיור 1 כדי לראות איך מתבצע שלב 2.7. - מכסה את הדגימה ברדיד אלומיניום, דגירה זה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- הסר את צלחת פטרי עם סיליקון רך והנח אותו זקוף (סיליקון-צד למעלה).
- לשטוף את משטח סיליקון רך עם באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) על-ידי הוספת 2 מ"ל ל- PBS (pH 7.4) למנה. . תן לזה לנוח לכמה דקות. מחוק לגמרי טוב, מגניב ולשטוף שהסיליקון שוב עם 2 מ"ל ל- PBS. תן סיליקון תרופה נוספת ביום. מסיבה זו, מקום המדגם סיליקון רך PBS ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. מדידה של נוקשות סיליקון עם כדור כניסה באמצעות מיקרוסקופ זריחה Widefield
- אחזר את צלחת פטרי עם סיליקון רך וודא שהיא מכילה לפחות 1 מ"ל של PBS יש משטח סיליקון מספר מ מ מתחת לפני השטח נוזלי.
- באמצעות פינצטה מחודדת, ירידה חמש 1 מ"מ זירקוניום כדור indentors על שהסיליקון רך. לטבול את הכדורים לתוך המדיום הנוזלי ושחרר אותם, מן הקצוות של השכבה סיליקון, לפחות 5 קטרים indentor מן המיקום של indentors אחרים.
הערה: כאשר ירד מעל פני השטח נוזלי, הספירות עלולים להיכשל להזין את המדיום הנוזלי (float) עקב מתח הפנים של המדיום הנוזלי. - המקום של צלחת פטרי עם סיליקון רך על הבמה מיקרוסקופ כך אפשר תמונה דרך הפטרי הבסיס.
- באמצעות הדמיה שלב עם מטרה X 10 (כגון יבש 10 X אובייקטיבית של נה 0.30), אתר ולהביא indentor sphere להתמקד.
- תמונת שלב של חלק או את כל indentor ולשמור את התמונה הזו. השתמש סריקה אריח אם זמין. אם indentor יש פגמים גלויים, למחוק ולהחליף אותו עם indentor אחרת.
- תחת הדמיה שלב חיה, פאן עד לקצה של indentor כך הקצה השמאלי של המסגרת היא לפחות למרחק של ~1.5 R מהמרכז indentor. ודא כי מרכז indentor נשאר גלוי בצד ימין, קרוב לקצה הימני של המסגרת התמונה. קחו תמונת שלב ולשמור אותו.
- לעבור מקור האור מיקרוסקופ התאורה עבור הערוץ ניאון אדום. עם x- ו - y-המוקד קואורדינטות ללא שינוי (ה- x-y המיקום של המרכז indentor בתוך אבל סמוך לשוליים הימניים של המסגרת), למטה (ירידה Z) עד גרגרי ניאון אדום תחת המרכז של indentor כדור פשוט ללכת מחוץ לפוקוס.
- קח z-מחסנית עם תמונה עבור כל z קבועה של 0.5 מיקרומטר עד גרגרי בשכבה העליונה של שהסיליקון רחוק indentor (ליד הקצה השמאלי של מסגרת הדמיה) לצאת משליטה.
- חזור על שלבים 3.4-3.8 עם indentors אחרים על הדגימה.
4. חישוב הנוקשות של הסיליקון (מודול האלסטיות)
- פתחו את התמונה שלב של indentor באמצעות ImageJ, לחץ על הכלי קו, ומדידת הקוטר של indentor פיקסלים. לחץ והחזק בנקודה בקצה indentor, להזיז את הסמן על נקודת ההפוך לחלוטין על הקצה ורשום את האורך בפיקסלים המוצג בשורת המצב של החלון הראשי ImageJ לפני שחרור הסמן.
- להבטיח כי יחידת אורך מוגדר פיקסלים על ידי לחיצה נתח | לקבוע קנה מידה ובדיקת יחידת אורך.
- להמיר ברדיוס של indentor פיקסלים μm תוך התחשבות ההגדלה אובייקטיבית ואת גודל פיקסל מצלמה CCD (R ב μm = R בפיקסלים x גודל פיקסל מצלמה CCD μm / ההגדלה אובייקטיבית).
- לפתוח ערוץ אדום z-הערימה של תמונות microbead (אם גרגרי פלורסנט אדום) ב- ImageJ על ידי לחיצה על קובץ | ייבוא | תמונה רצף ובחר כל תמונה במחסנית ולחץ על אישור כדי לפתוח את המחסנית.
הערה: F1 הוא מספר מסגרת שבה גרגרי תחת המרכז indentor יש המוקד האפשרי הטוב ביותר, F2 הוא המספר מסגרת שבה גרגרי (ליד אזור ~1.5 R מהמרכז חרוז) ליד הקצה השמאלי של המסגרת הם בפוקוס האפשרי הטוב ביותר. Z-ההבדל בין שתי המסגרות אלפא עומק הכניסה.- שימוש בכלי קו ב- ImageJ, לצייר קו לרוחב microbead מוגדרים היטב בתמונה. לחץ על לנתח | מגרש פרופיל ולחץ על הכפתור Live כדי להשיג את עוצמת סריקת קו מעודכן על פני החרוז בעת בחירת מסגרות שונות. ניתן לבחור את המסגרת שנותן את הערך הגבוה ביותר של העוצמה המקסימלית כמסגרת בפוקוס.
- מאחר z-התוספת בין המסגרות במחסנית z 0.5 μm, לחשב את עומק כניסה μm כמו אלפא = (F2-F1) x 0.5.
- לחשב את הכוח שהופעל על הג'ל על ידי indentor עקב משקלו (מינוס מנוגדות קליל הכוח), כלומר, כניסת כוח F, כמו הנפח של indentor x (צפיפות indentor - הצפיפות של המדיום הנוזלי) x ההאצה בשל כוח המשיכה. השתמש המשוואה F = (4/3) x 3.142 x (R3) x (ρindentor - ρבינוני) x g כאשר R הוא רדיוס indentor, ρindentor היא הצפיפות של indentor, ρבינוני היא הצפיפות של המדיום הנוזלי, g זה כוח הכבידה (9.81 מ'/ש'2). מבטאים את כל הכמויות בצד ימין ביחידות SI לקבל F (N).
- לחשב האלסטיות (E) של שהסיליקון משתמש ששונה11 הרץ דגם12 המשוואה:
איפה:
c = גורם תיקון משנה הרץ דגם הביטוי הבא;
v = פואסון של הג'ל סיליקון (נלקח כ- 0.5 לגבי חומרים וחישובים7);
F = חיל כניסה;
R = רדיוס indentor; ו
אלפא = כניסה לעומק.
לבטא את כל הכמויות בצד ימין ביחידות SI לקבל E בהרשות הפלסטינית.- לחשב את תיקון גורם c כמפורט להלן3:
איפה:
; ו
.
יצוין, כי פקטור התיקון הזה הוא במיוחד כדי לשמש רק כאשר שהסיליקון רך לאנאפוליס טוב צלחת פטרי (או סיליקון נוקשה) מתחתיו (וזה המקרה כאן). - לחשב את גובה h של שכבת סיליקון רך המבוסס על הסכום של סיליקון הוסיף את קוטר צלחת פטרי. לחלופין, לקבל h ישירות על-ידי קביעת הקואורדינטה z של משטחים עליונים ותחתונים של שכבת סיליקון על ידי הדמיה שלב (זיהומים קלים באים להתמקד גם פני השטח). שימו לב כי עבור ה גדול (h2 > Rδ), פקטור התיקון c הוא קרוב ל- 1.
- לחשב את תיקון גורם c כמפורט להלן3:
- חזור על הצעדים 4.1-4.4 כל indentor. ממוצע מודול האלסטיות המתקבל בכל indentor כדי להשיג מתכוון האלסטיות עבור המדגם סיליקון.
; ו
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל, אנו מוכנים סיליקון רך ב- 35 מ מ פטרי, ריפא אותו ב- 70 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, בשילוב גרגרי פלורסנט (קולגן אני) על פני השטח העליון כמו סכמטי מתואר באיור 1. UV עמוק שימש בעבר עבור החלבון בסופו של דבר צימוד סובסטרטים13. שים לב (I) התנאים לריפוי המשמש כאן הם הספציפי הזה סיליקון רך, (II) המדידה כניסה מבוצעת ביום הבא כצפוי סיליקון רך כדי לרפא קצת בהמשך במהלך יום.
פרמטרים שונים המאפיינות את הכניסה כדורית של משטח סיליקון מוצגים באיור 2א. שלב ההדמיה משמשת ללכידת גם (אני) את התמונה כולה של indentor כפי שמוצג באיור 2B (באמצעות תפירת תמונות, אם יש צורך בכך) או (II) חלק של התמונה של הכדור. הפרמטר היחיד שאפשר להפיק תמונה של indentor הוא הקוטר שלה. לדוגמה, indentor שפעם עם סיליקון רך 1:1 ב פרוטוקול זה, היה indentors בודדים שונים מאותה קטרים זה נע בין 950 מיקרומטר 1,200 מיקרומטר עם ערך הממוצע של מיקרומטר 1,037 וסטיית תקן של 47 מיקרומטר (8 indentors). שימו לב כי הקוטר נמדד indentor מסוים (ולא את קוטר רשע indentors רבים) אמור להיות בשימוש עבור החישוב נוקשות עבור כניסה-induced indentor המסוים הזה.
פלורסנט תמונות של גרגרי השטח העליון של שהסיליקון נלקחים ב x-y מסגרת מיקום כך האזור מתחת indentor בחלק הימין הקיצוני של המסגרת. האזור בחלקו שמאל של המסגרת נבחר להיות האזור מן indentor כפי שמוצג באיור 3. Z-אוסף תמונות של האזורים תחת indentor את והרחק את indentor מוצגים באיור 3גם כן. עבור 1 מ מ קוטר זירקוניום indentor בשימוש עם סיליקון רך 1:1, ערכי-z שבה האזורים 2 נכנס מיקוד שונה על-ידי 20 מיקרומטר (אלפא). . זה הרבה יותר קטן מאשר עובי סיליקון רך, אשר היה בסביבות 3500 מיקרומטר. באמצעות הצפיפות (4.66 גרם/ס"מ3) indentor זירקוניום (העשוי למעשה תערובת של זירקוניום דו תחמוצת צורן דו-חמצני) וצפיפות הנוזל בינוני (עבור PBS: 1.01 גרם/ס"מ3), נטו הכוח המופעל על שהסיליקון יכול להיות מחושב. המקרה תחת שיקול, היה בטווח µN 20-25. האלסטיות שחושבו עבור סיליקון רך 1:1 היה 7.2 kPa ± 2.4 (ממיקומים 28 איחדו מדגימות עצמאית 6). טבלה 1מקבלים את התוצאות נציג עבור אחרים היחס A:B עבור אותו לסיליקון רך (מוגדר המלווה הטבלה של ריאגנטים ספציפיים). לבסוף, כדי לאמת את שיטת כניסה כדור המשתמשת מיקרוסקופ widefield כמתואר לנו פרוטוקול זה, אנחנו גם נמדדים מודולים של הצעירים של ג'ל לזיהוי אנחנו מאופיין עם rheometer יש האלסטיות של kPa ± 3 21. בשיטת הספירה כניסה של הפרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ widefield, ג'ל לזיהוי של הרכב אותו נמצאה האלסטיות של kPa ± 4.2 22.1, המציינת את הסכם טוב10. אזהרות לשים לב בזמן ביצוע מדידות אלה מטופלות במקטע דיון.
איור 1: תיאור סכמטי של ההליך עבור צימוד גרגרי פלורסנט השטח העליון של סיליקון רכה. (א) סיליקון רך זה נרפא חשופים עמוק UV אור עבור 5 דק (B) A תערובת של EDC, sulfo-NHS, חרוזים, קולגן אני במים הוא pipetted למטה על חתיכת מצלמות-מיקרוסקופים הממוקמת מעל מכסה של קוטר קטן. (C) סיליקון רך מדגם זה הפוך על תערובת זו כך שהוא במגע עם הנוזל אבל לא עם המשטח העליון של המכסה קטן מתחת. שתי שקופיות זכוכית משני הצדדים, מתחת לצלחת פטרי, לשמש מפרידי. (ד) לאחר נטילת הדגימה עם PBS, משטח סיליקון רך מצופה עם גרגרי פלורסנט יהיה מוכן עבור המידה הנוקשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: איור סכמטי של כדור הכניסה של משטח סיליקון רכה. (א) תיאור סכמטי זה מראה indentor כדורית על פני השטח של מדגם סיליקון רך. פרמטרים שונים של ריבית מסומנים. (B) לוח זה מראה תמונה של indentor 1 מ מ (על מדגם סיליקון רך) שהושג דרך שלב לדימות. סרגל קנה מידה מציינת 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: חרוז ייבוא תמונות והנחישות של התמונה בפוקוס. (א) תמונה זו קרינה פלואורסצנטית גרגרי מראה על המשטח העליון של המדגם סיליקון רך, את הרצוי x-y המיקום של המסגרת באופן יחסי indentor (קו מנוקד). סרגל קנה מידה מציין ש-150 מיקרומטר. B ו- C מראות תמונות פלורסצנטיות z-בערימה של אזורים במשטח סיליקון רך (B) תחת indentor ו- (ג) מרחק indentor (מסגרת אזורים בתמונה העליונה). של אינדיקטורים z1 z2 תואמים ערכי-z שבו האזור תחת indentor והסביבה בלבד indentor הם בפוקוס, בהתאמה. פסי סולם עולה 20 מיקרומטר. הראו תמונות בשחור-לבן הם אלה להשיג את הערוץ האדום מאז נומינלית גרגרי ורוד שימשו אשר עירור ופרופילי פליטה להתאים את הערוץ האדום. (D) לוח זה מציג בסריקה קו בעוצמה על פני חרוז-מיקרו (המוצג בתמונה שיבוץ עם קו צהוב לעבר זה) המוקד מגוונת, z-במרווחים של 0.5 מיקרומטר. המוקד (z-ערך) המתאים לתמונה בפוקוס אובייקטיבי טפשר בהתבסס על z-הערך התואם הסריקה קו עם העוצמה המרבית הגבוהה ביותר. מציין סרגל קנה מידה שיבוץ 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| סיליקון elastomer * A:B | של יאנג מודולוס * * (kPa) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * שצוין ב- המלווה טבלה של ריאגנטים/ציוד ספציפי * * כפי שנמדדה באמצעות שיטת הספירה כניסה באמצעות מיקרוסקופ widefield כמפורט בפרוטוקול זה |
|
טבלה 1. האלסטיות של סיליקון רך (עבור שהסיליקון מסוים שצוין ב- הטבלה של ריאגנטים/ציוד ספציפי) עבור קומפוזיציות שונות כפי שנמדדה באמצעות פרוטוקול מפורט כאן. הערכים עבור היחס של A:B רכיבים מעורבים שני (וגם את המספר המתאים של מדידות) הם 1:1 (28), 4:7 (13) ו- 1:2 (8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד השיטה כניסה פרנה קלה לביצוע, תשומת לב רבה ישולם הבחירה של indentor ואת העובי של המדגם סיליקון רך. המשוואה לחישוב מודול האלסטיות הוא חוקי תחת תנאים11, אלה הם בדרך כלל מרוצה כאשר העובי של המדגם סיליקון > 10% של הרדיוס indentor ו < ~ 13 x רדיוס indentor. מצאנו כי סיליקון עובי של 5-10 x רדיוס indentor היה בחירה טובה, שבה העובי מדגם אינה גבוהה מדי (כלומר, המרחק עבודה אובייקטיבית אינה הולמת מגבלה) ואת הקשיחות מחושב היה גם לא רגיש מדי הערך המדויק של עובי סיליקון. הבחירה של כדורי indentor צריך גם להיות כזה אלפא עומק כניסה הוא < 10% של עובי סיליקון, כמו גם < 10% של הרדיוס indentor. עם שיקולים אלה בחשבון, indentors של חומרים שונים וגם בקוטר יכול לשמש כדי למדוד את הנוקשות של סיליקון רך יותר, נוקשה. הקביעה של עומק כניסה היא השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה. השיטה המוצעת פרוטוקול זה כדי לזהות תמונות בפוקוס צריך לעזור לקבוע את עומק כניסה באופן אמין. יש גם לציין כי החישוב נוקשות המשמש את שיטת כניסה של כדור משתמשת תורת Hertzian, המניחה קשר חיכוך. . הנה, זה הנחה טובה עבור indentors של חספוס נמוכה. כאשר השתמשנו אלסטומר סיליקון רך ספציפיים (ברשימה המלווה הטבלה של ריאגנטים ספציפיים), קיטים elastomer אחרים סיליקון מסחרי יכול לשמש. שימו לב: שהסיליקון נוקשות בשימוש נרחב עבור מיקרו-מלאכותית אינה בחירה טובה עבור ביצוע מצעים עם נוקשות בטווח של kPa. עם זאת, סיליקון רך (כי יש לי נוקשות לקצה התחתון של הטווח kPa) יכול להיות מעורב עם אחוז קטן של סיליקון נוקשה כדי להפוך מצעים עם נוקשות לסוף הטווח kPa גבוה יותר. בהתאם אלסטומר, indentor עם גודל שונה או צפיפות יכולה להיבחר, כל עוד התנאים שהוזכרו קודם לכן ימולאו.
כמה שיקולים מרכזיים עבור המושבים של גרגרי פלורסנט למשטח העליון של סיליקון רך חשובים. קודם כל, בחרנו 0.44 מיקרומטר carboxylate חרוזים בגלל התוכן שלהם fluorophore ומכאן בהירות היה גדול מזה של חרוזים דומה של גודל קטן יותר. חרוז בגדלים קטנים יותר יכולים לשמש אם החרוזים מכילים fluorophores בהיר יותר, אך אנו ממליצים כי תת מיקרון carboxylate חרוזים צריך לשמש כדי לא להשפיע לרעה על הרזולוציה של השיטה. הדגירה של המשטח סיליקון עם התערובת EDC/sulfo-NHS/חרוז/col1 מבוצע עם משטח סיליקון בתצורה הפוך. הסיבה לכך היא, כאשר התערובת עם החרוזים מונחת על גבי משטח סיליקון, חרוז גושים להתיישב על גבי משטח סיליקון, שמוביל רזולוציה מרחבית עניים בזמן צילמו את גרגרי פלורסנט. אפילו עם פרוטוקול זה, חרוז גושים נצפו לעתים (אזורים בהירים בתמונה העליונה באיור3). עם זאת, הם אינם מספיק מקיף כדי להשפיע על הרזולוציה של השיטה. אפשרי גם להשתמש מפרידי תחת הקצוות של כל אחד צלחות פטרי איור 1C כדי לאפשר השטח סיליקון כדי ליצור קשר עם הנוזל אבל לא את משטח מוצק מתחתיו. המושבים של גרגרי השטח העליון של שהסיליקון רך יכול להתבצע גם ללא צעד עמוק של אור UV אם גרגרי עם ציפוי הידרופובי נבחרו. נוקשות המדידה יש לבצע על המצע הסופי (אחרי טיפול UV, צימוד חרוז, ו צימוד ECM) על אילו תאים יכול להיות מצופה. זה כדאי לזכור כי יש לבצע אפיון נוקשות לאחר השלבים (כגון טיפול UV) ואולי יכול לשנות את קשיחות המצע כך הקשיחות שנמדד הוא זה התאים יהיו חשופים.
במקום צלחת פטרי, נוקשות PDMS פרוסת יכול לשמש כבסיס סיליקון רך14. תצורה כזו יכול לשמש עבור החלת רצועת חיצוניים לתאים שבו שהסיליקון נוקשות מספק את המסגרת יכול להיות מתוח, ומספק שהסיליקון רכה תא מיקרו-סביבה של נוקשות זו יותר פיזיולוגית. 15,של מיקרוסקופ כוח המתיחה16יכול להתבצע גם עם תאי ציפוי על אלה7,ג'ל סיליקון רך8, ומאפשרת הנוכחות של פלורסנט. גרגרי בשכבה העליונה רק פתרון טוב עם רק widefield קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. קולגן שאני ב פרוטוקול זה הרבה עם חלבונים אחרים מטריצה חוץ-תאית. לעומת שיטות קצת יותר מעורב כמו מיקרוסקופ כוח אטומי, שיטת הספירה כניסה ניתן ליישם בקלות רבה יותר, באופן כללי. הסטייה ב הממוצע מודולים של יאנג שהושג באמצעות השיטה כניסה כדור לעומת זאת נקבע באמצעות rheometer בדרך כלל < 10%10. לפיכך, שיטת כניסה פרנה (באמצעות מיקרוסקופ זריחה widefield) מספק שיטה נגיש עבור הקשיחות כימות של סיליקון רך (או הידרוג) עבור יישומים ב- mechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים מרגרט גרדל בנדיבות להתרת השימוש rheometer. אנו להכיר תמיכה של NIH (1R15GM116082) שיאפשרו עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
