Summary
Ondergronden met stijfheid in het kilopascal-bereik zijn nuttig zijn te onderzoeken van de reactie van cellen op fysiologisch relevante stijfheid van de micro-omgeving. Met behulp van slechts een widefield fluorescentie Microscoop, kan de Youngs modulus van zachte siliconen gel worden bepaald met behulp van een inkeping met een geschikt gebied.
Abstract
Zachte weefsels in het menselijk lichaam hebben meestal stijfheid in het bereik kilopascal (kPa). Dienovereenkomstig, siliconen en hydrogel flexibele substraten hebben bewezen nuttig substraten voor het kweken van cellen in een fysieke communicatie dat gedeeltelijk in vivo voorwaarden nabootst. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het karakteriseren van de Youngs moduli isotrope lineaire elastische ondergronden meestal gebruikt voor mechanobiology studies. Het protocol bestaat uit voorbereiding van een zacht siliconen substraat in een petrischaal of stijve siliconen coating van de oppervlaktelaag van de siliconen coating met fluorescerende kralen, met behulp van een millimeter-schaal bol laten inspringen van de oppervlaktelaag (door zwaartekracht), de TL imaging kralen op de ingesprongen siliconen oppervlak met behulp van een fluorescentie Microscoop, en het analyseren van de resulterende afbeeldingen als u wilt berekenen van de Youngs modulus van de siliconen coating. Koppeling van de oppervlaktelaag van het substraat met een moduli extracellulaire matrix eiwitten (naast de fluorescerende kralen) kan het siliconen substraat te gemakkelijk worden gebruikt voor de cel plating en latere studies met behulp van tractie kracht microscopie experimenten. Het gebruik van stijve silicone, in plaats van een petrischaaltje, als basis voor de zachte siliconen, maakt het gebruik van mechanobiology studies waarbij externe stretch. Een specifieke voordeel van dit protocol is dat een widefield fluorescentie Microscoop, die gewoonlijk beschikbaar in vele labs is, belangrijke uitrusting die nodig is voor deze procedure. We laten zien van dit protocol door het meten van de Youngs modulus van zachte siliconen substraten voor verschillende elastische moduli.
Introduction
Cellen in zachte weefsels bevinden zich in een micro-omgeving waarvan stijfheid is in kilopascal bereik1, in tegenstelling tot weefselkweek gerechten waarvan stijfheid verschillende ordes van grootte hoger is. Vroege experimenten met cellen in de extracellulaire matrix eiwitten-bedekt zachte ondergronden toonde aan dat de stijfheid van het substraat beïnvloedt hoe cellen verplaatsen op, alsmede voldoen aan de extracellulaire matrix onder2,3. In feite, beïnvloedt de stijfheid van het substraat fundamenteel de cel functie4 op een wijze vergelijkbaar met doordringende biochemische signalen. Polyacrylamide gels (bekleed met extracellulaire matrix eiwitten) zijn (water-doordringt) hydrogels die intensief zijn gebruikt als cel cultuur substraten voor mechanobiology5 bestudeert. Polydimethylsiloxaan (PDMS), de meest voorkomende silicone (polysiloxaan), wijd gebruikt als een stijve siliconen met megapascal gasgroep stijfheid voor micron-schaal fabricage6. Meer recentelijk, zachte siliconen substraten met stijfheid in het meer fysiologisch relevante kilopascal bereik hebben gewerkt als cel cultuur substraten voor mechanobiology studies7,8.
Verschillende methoden zijn gebruikt voor het meten van de stijfheid van flexibele substraten, met inbegrip van atomaire kracht microscopie, macroscopische vervorming van hele monsters op zich het uitrekken, reologie en inspringen met behulp van bollen en sferisch getipt microindentors9 . Terwijl elke techniek zijn eigen voor- en nadelen heeft, is inspringen met een bol een bijzonder eenvoudige nog vrij nauwkeurige methode waarvoor alleen de toegang tot een widefield fluorescentie Microscoop. Inspringen met een metalen bol is gebruikt voor het meten van de stijfheid van de hydrogels in eerder werk3,9,10. Vroege werk dat het belang van substraat stijfheid aan cel beweging aangetoond gebruikt deze methode om te bepalen van hydrogel substraat stijfheid3. Confocale microscopie is recenter, ook gebruikt voor een elegante karakterisering10.
Hier presenteren we een stapsgewijze protocol voor het voorbereiden van een zacht siliconen substraat, koppeling van fluorescerende kralen (en een extracellulaire matrix eiwitten zoals collageen ik) gewoon aan de bovenste oppervlakte, imaging een inspringen sfeer en de bovenste oppervlakte met behulp van fase en fluorescentie imaging, respectievelijk, en ten slotte analyseren van de beelden om te berekenen van de Youngs modulus van de siliconen coating. Het zachte silicone substraat voorbereid op deze wijze kan gemakkelijk worden gebruikt voor tractie kracht microscopie experimenten. Het gebruik van stijve siliconen (in plaats van een petrischaal) als basis voor de zachte siliconen kan ook mechanobiology studies met een externe stretch. Gerechtvaardigde klachten zijn ook praktische overwegingen nodig voor het vermijden van mogelijke complicaties aangegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabricage van zachte siliconen coating
- Weeg 1.75 g van de een-component en 1,75 g van de B-component (A:B = 1:1) uit de zachte silicone-elastomeer kit met behulp van (polystyreen) met een gewicht van trays.
- De een-component toevoegen aan de B-component in de wegen lade en meng ze samen voor 5 min met behulp van een passende applicator stick.
- Het bovenstaande mengsel toevoegen aan een 35 mm petrischaal. Laat het mengsel gelijkmatig verspreid over de petrischaal voor een paar minuten.
Opmerking: De keuze van de diameter van de petrischaal en de hoeveelheid zachte siliconen bepaalt de dikte van de siliconen. Hier zullen de dikte ongeveer 3,5 mm; meer over het kiezen van de elastomeer-dikte in de sectie discussie . - Plaats de petrischaal met de siliconen mengsel, met het deksel af, in een vacuuemcel gedurende 15 minuten luchtbellen te verwijderen. Gedurende deze tijd, Verwarm een warmhoudplaat tot 70 ° C.
- Zodra de verwarmingsplaat 70 ° C bereikt, plaats een glasplaatje op en plaats vervolgens de petrischaal met de siliconen mengsel op het glasplaatje. Laat het silicone uitharding bij 70 ° C gedurende 30 minuten. Plaats de polystyreen schotel niet rechtstreeks op de hete plaat, zoals de petrischaal kan smelten.
2. koppelen van fluorescerende Microbeads aan het zachte Silicone
- Plaats de uitgeharde siliconen (in de onbedekte petrischaal) in een diepe UV-zaal (een ruimte met een diepe UV-lamp van licht golflengten van 185 en 254 nm). Het zachte silicone monster (~ 5-10 cm afstand van de UV-lamp) bloot aan diepe UV licht voor 5 min.
- Terwijl het silicone is blootgesteld aan diepe UV-licht, gaat u verder met stappen 2.2-2.6 hieronder. Na de diepe UV-blootstelling, ontgas de diepe UV kamer gedurende ten minste 5 minuten voordat het monster worden opgehaald.
- In de tussentijd, weeg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) in een tube van 1,5 mL microcentrifuge 19 mg en 500 μL van gedeïoniseerd water (DI) water aan toevoegen. Los de EDC door zachtjes schudden van de buis.
- In een aparte 1,5 mL microcentrifuge buis, weeg 11 mg N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS), 500 μL van DI water aan toevoegen en de sulfo-NHS ontbinden door zachtjes schudden van de buis. Vervolgens, combineren de EDG en sulfo-NHS oplossingen in een enkele microcentrifuge buis.
- Toevoegen aan de oplossing van deze EDC/sulfo-NHS, 30 μL van 0,44 μm diameter rood (of een andere fluorescentie-kleur gebaseerd op de filter kubussen beschikbaar in de fluorescentie Microscoop) carboxylaat bewerkt fluorescerende microbeads (met een 1% w/v voorraad concentratie).
- Voeg aan het mengsel van EDC/sulfo-NHS/kraal, 0,02 mg collageen I (van een staart van de rat, voorraad concentratie van 4 mg/mL in 0,02 M azijnzuur) te verkrijgen van een concentratie van ongeveer 0,02 mg/mL.
- Vortex de EDC/NHS/kraal/collageen ik mengsel kort om ervoor te zorgen dat de kralen zijn gelijkmatig verspreid over, voordat de koppeling.
- Pipetteer 1 mL van de EDC/NHS/kraal/collageen ik mengsel op een stuk parafilm geplaatst bovenop een andere ondiep, plat deksel (van kleinere diameter). De petrischaal met zachte silicone op dit mengsel omkeren zodat het zachte siliconen oppervlak contact op met het mengsel, maar niet rechtstreeks het oppervlak van de kleinere petrischaal deksel hieronder raakt. Dia's onder aan weerszijden van de omgekeerde petrischaal spacers om te trekken de omgekeerde petrischaal, gebruiken één of twee glazen.
Opmerking: Raadpleeg Figuur 1 te zien hoe stap 2.7 wordt uitgevoerd. - Dekking van het monster met aluminiumfolie en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Verwijder de petrischaal met zachte siliconen en zet het rechtop (siliconen-kant naar boven).
- Wassen van de zachte siliconen oppervlak met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door toevoeging van 2 mL PBS (pH 7.4) aan de schotel. Laat het zitten voor een paar minuten. Gecombineerd uit de PBS en wassen het silicone weer met 2 mL PBS. Laat de silicone remedie verder voor ongeveer een dag. Om die reden leg het zachte silicone monster in PBS bij 37 ° C's nachts.
3. meting van de siliconen stijfheid met bol inspringen met behulp van een Widefield fluorescentie Microscoop
- Ophalen van de petrischaal met zachte siliconen en ervoor te zorgen dat er ten minste 1 mL PBS hebben het siliconen oppervlak verschillende mm onder het vloeistofoppervlak.
- Met puntige pincetten, vijf 1 mm zirkonium bol indentors op het zachte silicone neerzet. De bollen in de vloeistof te dompelen en laat vallen hen, uit de buurt van de randen van de siliconen laag en ten minste 5 diameters van de indentor uit de buurt van de locatie van de andere indentors.
Opmerking: Toen liet boven het vloeistofoppervlak, de bollen kunnen mislukken om de vloeistof (float) als gevolg van oppervlaktespanning van de vloeistof. - Plaats de petrischaal met zachte siliconen in het werkgebied van de Microscoop zodat is het mogelijk om beeld via de petrischaal basis.
- Fase imaging met een 10 X doelstelling (zoals een droge 10 X objectieve na 0,30), zoekt en brengen een indentor bol in beeld.
- Neem een beeld van de fase van een deel of het geheel van de indentor en deze afbeelding opslaan. Gebruik een tegel scan indien beschikbaar. De indentor heeft geen zichtbare gebreken, verwijderen en vervangen door een andere indentor.
- Onder levende fase imaging, pan links van de indentor de rand zodat de linkerrand van het frame ten minste een afstand van ~1.5 R vanuit het midden van de indentor is. Ervoor zorgen dat het midden van de indentor aan de rechterkant, dicht bij de rechterrand van het frame van de afbeelding zichtbaar blijft. Neem een fase afbeelding en opslaan.
- De Microscoop lichtbron naar de verlichting voor de rode fluorescerende kanaal schakelen Met de x- en y-coördinaten ongewijzigd (de x-y positie van het middelpunt van de indentor binnen, maar in de buurt van de rechterrand van het frame), focus omlaag (afname Z) tot het rode fluorescerende microbeads onder de bol indentor het center Ga enkel onscherp.
- Neem een z-stack met een afbeelding voor elke z-waarde van 0,5 µm tot de microbeads in de bovenste laag van het silicone ver van de indentor (in de buurt van de linkerrand van het imaging frame) Ga onscherp.
- Herhaal stap 3.4-3.8 met de andere indentors van de steekproef.
4. berekening van het Silicone stijfheid (Youngs Modulus)
- Open de afbeelding van de fase van de indentor met behulp van ImageJ, klik op het lijngereedschap, en meet de diameter van de indentor in pixels. Klik en houd op een punt op de rand van de indentor, verplaats de cursor naar een diametraal tegenovergestelde punt op de rand en noteer de lengte in pixels weergegeven op de statusbalk van het hoofdvenster ImageJ voor het vrijgeven van de cursor.
- Controleer of de lengte-eenheid is ingesteld op pixels door te klikken op analyseren | Stel schaal en controle van de eenheid van lengte.
- De indentor de straal in pixels omzetten in μm door rekening houdend met de objectieve vergroting en de pixelgrootte van de CCD-camera (R in micrometer = R in pixels x de CCD camera pixelgrootte in micrometer / de objectieve vergroting).
- Open de rode kanaal z-stack van microbead beelden (als de microbeads rood fluorescerende) in ImageJ door te klikken op bestand | Import | Beeld van de reeks en selecteer een afbeelding in de stack en klik op OK om te openen de stack.
Opmerking: F1 is het framenummer waartegen de microbeads onder het indentor center in de best mogelijke focus en F2 is het framenummer waartegen de microbeads (op een gebied van ~1.5 R van de kraal centrum) in de buurt van de linkerrand van het frame in de best mogelijke focus zijn. De z-verschil tussen de twee frames is de manier van inspringen diepte δ.- Met het lijngereedschap in ImageJ aanzuigen en een lijn een welomschreven microbead in de afbeelding. Klik op analyseren | Plot profiel en klik op de knop Live te verkrijgen van de intensiteit van de scan bijgewerkte lijn over de kraal terwijl het selecteren van de verschillende frames. Het frame de hoogste waarde van de maximale intensiteit geeft kan worden gekozen als het frame in focus.
- Omdat de z-toename tussen de frames in de z-stack 0,5 μm is, berekenen de diepte van de inspringing in μm als δ = (F2-F1) x 0,5.
- Bereken de kracht die uitgeoefend wordt op de gel door de indentor door zijn gewicht (minus de uitbundige tegenkracht), dat wil zeggen, de inspringing kracht F, als het volume van de indentor x (de dichtheid van de indentor - de dichtheid van de vloeistof) x de versnelling als gevolg van de zwaartekracht. Gebruik de vergelijking F = (4/3) x 3.142 x (R3) x (ρindentor - ρmedium) x g waar R de straal van de indentor is, ρindentor is de dichtheid van de indentor, ρmedium is de dichtheid van de vloeistof en g de versnelling als gevolg van de zwaartekracht (9.81 m/s2). Express alle hoeveelheden aan de rechterkant in SI-eenheden te verkrijgen van F (in N).
- Bereken de Youngs modulus (E) van het silicone met behulp van een gemodificeerde11 Hertz model12 vergelijking:
Waar:
c = een correctiefactor die wijzigt de Hertz model expressie die erop volgt;
v = Poisson de verhouding van de siliconen-gel (genomen als 0,5 wat betreft niet-samendrukbaar materiaal7);
F = de inspringing kracht;
R = de straal van de indentor; en
Δ = diepte van de inspringing.
Alle hoeveelheden Express aan de rechterkant in SI-eenheden te verkrijgen E in Pa.- Bereken de correctie factor c als volgt3:
Waar:
; en
.
Opgemerkt moet worden dat deze correctiefactor heeft specifiek betrekking op alleen worden gebruikt wanneer het zachte silicone ook aan de petrischaal (of stijve siliconen) eronder voldoet (dat is hier het geval). - Bereken de hoogte h van de zachte siliconen laag op basis van de hoeveelheid siliconen toegevoegd en de diameter van de petrischaal. Als alternatief, h direct verkrijgen bepalen van de z-coördinaat van de boven- en onderkant oppervlakken van de siliconen laag door fase imaging (kleine onzuiverheden komen in beeld aan beide oppervlak). Merk op dat voor een grote h (h2 > Rδ), de correctie factor c is dicht bij 1.
- Bereken de correctie factor c als volgt3:
- Herhaal stap 4.1-4.4 voor elke indentor. Het gemiddelde van de Youngs modulus elke indentor te verkrijgen van de gemiddelde Youngs modulus voor het silicone monster verkregen.
; en
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol die hierboven is uiteengezet, wij bereid siliconen in een 35 mm petrischaal, uitharden kan het oppervlak bij 70 ° C gedurende 30 minuten en combinatie van fluorescent microbeads (en collageen ik) naar de bovenste oppervlakte als schematisch afgebeeld in figuur 1. Diepe UV nog eerder is gebruikt voor de uiteindelijke proteïne koppelen aan substraten13. Opmerking (I) de uithardende voorwaarden die hier gebruikt zijn specifiek voor deze zachte siliconen en (II) de meting van de manier van inspringen wordt uitgevoerd op de volgende dag zoals het zachte silicone wordt verwacht om te genezen van een beetje verder in de loop van een dag.
Verschillende parameters die kenmerkend zijn voor de sferische inspringing van het siliconen oppervlak worden weergegeven in figuur 2. Fase beeldvorming wordt gebruikt om vast te leggen ofwel (I) de volledige afbeelding van de indentor zoals weergegeven in figuur 2B (met afbeelding stiksels, indien nodig) of (II) deel van het beeld van het gebied. De enige parameter te worden afgeleid van de indentor de afbeelding is de diameter. Bijvoorbeeld, voor de indentor die we met de 1:1 zachte siliconen in dit protocol gebruikt, had verschillende individuele indentors van eenzelfde partij diameters die van 950 µm tot 1.200 µm met een gemiddelde waarde van 1,037 µm en een standaarddeviatie van 47 µm (8 indentors varieerden). Merk op dat de diameter gemeten voor een bepaalde indentor (in plaats van de gemiddelde diameter voor vele indentors) moet worden gebruikt voor de berekening van de stijfheid voor de inspringing-geïnduceerde door dat bepaalde indentor.
Fluorescerende beelden van de microbeads in de oppervlaktelaag van de siliconen worden genomen op een x-y -positie is frame, zodat de regio onder de indentor in de extreem-rechtse deel van het frame is. De regio in het gedeelte uiterst links van het frame is gekozen om de regio uit de buurt van de indentor zoals afgebeeld in figuur 3. Z-stack beelden van de regio's onder de indentor en uit de buurt van de indentor staan in figuur 3ook. Voor de 1 mm diameter zirkonium indentor gebruikt in combinatie met het zachte silicone van 1:1, verschilden de z-waarden waartegen de 2 regio's in beeld komen door ongeveer 20 µm (δ). Dit is veel kleiner dan de dikte van het zachte silicone, die rond 3.500 µm was. met behulp van de dichtheid (4.66 g/cm3) van de zirkonium-indentor (die is eigenlijk gemaakt van een mengsel van zirkoniumdioxide en silicium dioxide) en de dichtheid van de vloeistof medium (voor PBS: 1.01 g/cm3), de netto kracht uitgeoefend op de siliconen kan worden berekend. Voor het geval was het in het bereik van 20-25 µN. De Youngs modulus die we berekend voor de 1:1 zachte siliconen was 2.4 kPa (vanaf 28 locaties gebundeld van 6 onafhankelijke steekproeven) 7,2. De representatieve resultaten voor de verhoudingen van andere A:B voor de dezelfde zachte siliconen (opgegeven in de bijbehorende Tabel van specifieke reagentia) zijn gegeven in tabel 1. Ten slotte, om te valideren de bol inspringing methode die met behulp van een Microscoop widefield als wij in dit protocol beschreven, we ook de Youngs moduli gemeten van een polyacrylamidegel we gekenmerkt met een rheometer dat een Youngs modulus van 21 ± 3 kPa. Met de methode inspringing bol van dit protocol, met behulp van een Microscoop widefield was polyacrylamidegel van dezelfde samenstelling gevonden te hebben een Youngs modulus van 22.1 4.2 kPa, die een goed akkoord10aangeeft. Voorbehoud aandacht te besteden aan terwijl het uitvoeren van deze metingen worden behandeld in de sectie discussie.
Figuur 1: schematische voorstelling van de procedure voor het koppelen van fluorescerende microbeads aan de oppervlaktelaag van zachte siliconen. (A) het zachte silicone dat is gedroogd wordt blootgesteld aan diepe UV licht voor 5 min. (B) A mengsel van EDC, sulfo-NHS, kralen en collageen ik in water is afgepipetteerde neer op een stuk van parafilm geplaatst op de top van een deksel van kleinere diameter. (C) het zachte silicone monster is omgekeerd op dit mengsel zodat er in contact met de vloeistof maar niet met de oppervlaktelaag van de kleinere deksel onder. Twee glas-dia's aan beide zijden, onder de petrischaal, fungeren als afstandhouders. (D) na wassen van het monster met PBS, de zachte siliconen oppervlak bedekt met fluorescerende microbeads klaar voor de meting van de stijfheid is. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Schematische afbeelding van bol inspringing van het zachte siliconen oppervlak. (A) deze schematische voorstelling toont een sferische indentor op het oppervlak van een steekproef van de siliconen. Verschillende parameters van belang zijn aangegeven. (B) dit paneel toont een afbeelding van een 1 mm indentor (van een steekproef van zachte siliconen) verkregen via fase imaging. Geeft de schaal balk 250 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Bead Beeldacquisitie en vastberadenheid van het beeld in-focus. (A) deze fluorescentie-afbeelding toont microbeads op de oppervlaktelaag van het zachte silicone monster en de gewenste x-y -locatie van het frame ten opzichte van de indentor (gestippelde lijn). De schaal-balk geeft dat 150 µm. panelen B en C tonen z-stack fluorescentie beelden van de regio's over de zachte siliconen oppervlak (B) onder de indentor en (C) uit de buurt van de indentor (boxed regio's in de bovenste afbeelding). De indicatoren z1 en z2 corresponderen met de z-waarden waartegen de regio onder de indentor en de regio uit de buurt van de indentor in focus, respectievelijk zijn. De schaal staven geven 20 µm. De monochrome afbeeldingen getoond zijn verkregen in het rode kanaal aangezien nominaal roze microbeads werden gebruikt waarvan excitatie en emissie profielen het rode kanaal passen. (D) dit paneel geeft een intensiteit lijn scan over een micro-kraal (Zie de afbeelding van de inzet met een gele lijn overheen) als de focus is gevarieerd in z-stappen van 0,5 µm. De focus (z-waarde) overeenkomt met het beeld in-focus kan objectief gekozen worden op basis van de z-waarde die overeenkomt met de lijn-scan met de hoogste maximale intensiteit. Geeft de schaal balk in verzonken vlak van de 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Silicone-elastomeer * A:B | Youngs Modulus ** (kPa) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * opgegeven in de bijbehorende tabel van specifieke reagentia/uitrusting ** Als gemeten met de bol inspringing methode met behulp van een Microscoop widefield zoals beschreven in dit protocol |
|
Tabel 1. Youngs modulus van zachte siliconen (voor het bijzonder silicone opgegeven in de tabel van specifieke reagentia/uitrusting) voor verschillende composities als gemeten met behulp van het protocol dat gedetailleerde hier. Waarden voor de verhouding tussen de twee gemengde onderdelen-A:B (en het bijbehorende aantal metingen) zijn 1:1 (28), 4:7 (13), en 1:2 (8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de bol inspringing methode eenvoudig is te implementeren, moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan de keuze van de indentor en de dikte van het monster van de siliconen. De vergelijking voor de berekening van de Youngs modulus is geldig onder een aantal voorwaarden11en deze meestal wordt voldaan wanneer de dikte van het monster silicone > 10% van de indentor-straal is en < ~ 13 x de straal van de indentor. We vonden dat een siliconen dikte van 5-10 x de straal van de indentor een goede keuze was, waarin de dikte van het monster niet te hoog is (dat wil zeggen, de objectieve afstand niet geworden een beperking) en de berekende stijfheid was ook niet te gevoelig voor de exacte waarde van de dikte van de siliconen. De keuze van de sferische indentor moeten ook zodanig zijn dat de manier van inspringen diepte δ < 10% van de dikte van de siliconen evenals < 10% van de indentor-straal. Met deze overwegingen in het achterhoofd, kunnen de indentors van zowel verschillende materiaal en diameter worden gebruikt voor het meten van de stijfheid van zachter en stijver siliconen. De bepaling van de diepte van de inspringing is de meest kritische stap van dit protocol. De methode voorgesteld in dit protocol te identificeren in-nadrukbeelden moet medebepalend zijn voor de manier van inspringen diepte betrouwbaar. Ook opgemerkt moet worden dat de berekening van de stijfheid die wordt gebruikt voor het gebied inspringen methode maakt gebruik van draadloos theorie, waarbij wordt uitgegaan van wrijvingsloos contact. Hier, is dit een goede veronderstelling voor indentors van lage ruwheid. Terwijl we een specifieke zachte silicone-elastomeer (opgenomen in de bijbehorende Tabel van specifieke reagentia) hebt gebruikt, kunnen de andere commerciële silicone-elastomeer kits worden gebruikt. Merk op dat het stijf silicone op grote schaal voor microfabrication gebruikt is niet een goede keuze voor het maken van substraten met stijfheid in het bereik kPa. Zachte siliconen (dat hebben de stijfheid in het lagere eind van de reeks kPa) kunnen echter worden gemengd met een klein percentage van stijve silicone om substraten met stijfheid in het hogere einde van het bereik kPa. Afhankelijk van de elastomeer, kan een indentor met een verschillende grootte of dichtheid worden gekozen, zolang de eerder genoemde voorwaarden is voldaan.
Een paar belangrijke overwegingen voor de koppeling van fluorescerende microbeads te het zachte silicone bovenvlak zijn belangrijk. Ten eerste, we kozen voor 0.44 µm carboxylaat kralen omdat de inhoud van hun fluorophore en vandaar de helderheid was groter dan die van soortgelijke kralen van kleinere omvang. Kleinere kraal kunnen worden gebruikt als de parels helderder fluorophores bevatten, maar wij stellen voor dat de sub micron carboxylaat kralen om niet nadelige gevolgen hebben voor de resolutie van de methode moeten worden gebruikt. De incubatie van de siliconen oppervlak met het EDC/sulfo-NHS/kraal/Kol1 mengsel wordt uitgevoerd met de siliconen oppervlak in een omgekeerde configuratie. De reden hiervoor is dat, wanneer het mengsel met de kralen wordt geplaatst op de top van de siliconen oppervlak, regelen kraal bosjes op de siliconen oppervlak, wat leidt tot een slechte ruimtelijke resolutie terwijl de fluorescerende microbeads zijn image wordt gemaakt. Zelfs met dit protocol, werden kraal bosjes af en toe waargenomen (heldere regio's in de bovenste afbeelding in Figuur 3). Nochtans, zijn zij niet uitgebreid genoeg om te beïnvloeden van de methode resolutie. Het is ook mogelijk om te gebruiken spacers onder de randen van een van de petrischaaltjes in Figuur 1 c zodat het siliconen oppervlak contact met de vloeistof maar niet de harde ondergrond eronder. De koppeling van de microbeads aan de bovenkant van het zachte silicone kan zelfs zonder een diepe UV licht stap worden uitgevoerd als microbeads met een hydrofobe coating worden gekozen. De meting van de stijfheid wordt uitgevoerd op het definitieve substraat (na de UV behandeling, kraal koppeling en ECM koppeling) op welke cellen kunnen worden bekleed. Het moet niet vergeten dat de karakterisering van een stijfheid na stappen (zoals de UV-behandeling) die eventueel de stijfheid van het substraat veranderen kunnen, zodat de gemeten stijfheid enerzijds dat de cellen zal worden blootgesteld is aan moet worden uitgevoerd.
In plaats van een petrischaaltje, kan een plaat van stijve PDMS worden gebruikt als basis voor de zachte siliconen14. Een dergelijke configuratie kan worden gebruikt voor het toepassen van een externe stretch op cellen waarin het stijve silicone biedt het frame dat kan worden uitgerekt, en het zachte silicone biedt een cel micro-omgeving van stijfheid thats meer fysiologische. Tractie kracht microscopie15,16kan ook worden uitgevoerd met vergulde deze zachte siliconen gels7,en8cellen, en de aanwezigheid van fluorescerende microbeads in alleen de bovenste laag kan een goede resolutie met gewoon een widefield fluorescentie Microscoop. Collageen die kan ik in dit protocol worden vervangen door andere extracellulaire matrix-proteïnen. Vergeleken met iets meer betrokken methoden zoals atomaire kracht microscopie, kan de bol inspringing methode worden geïmplementeerd gemakkelijker, in het algemeen. De afwijking in het gemiddelde Youngs moduli opgehaald met de methode gebied inspringen ten opzichte van dat bepaald met behulp van een rheometer is doorgaans < 10%10. De bol inspringing methode (met behulp van een widefield fluorescentie Microscoop) biedt dus een toegankelijke methode voor de kwantificering van zachte siliconen (of hydrogel) stijfheid voor toepassingen in mechanobiology.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Margaret Gardel voor royaal waardoor het gebruik van de rheometer. Wij erkennen de steun van de NIH (1R15GM116082), die dit werk ingeschakeld.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
