Summary
Yüzeyler ile sertlik kilopascal aralıktaki hücreler yanıt fizyolojik ilgili mikro-çevre sertlik olarak çalışmaya yararlıdır. Sadece bir widefield floresan mikroskop kullanarak, yumuşak silikon jelleri, Young katsayısı ile uygun bir küre bir girinti kullanarak belirlenebilir.
Abstract
İnsan vücudunda yumuşak dokular genellikle kilopascal (kPa) aralığında sertlik var. Buna göre silikon ve hidrojel esnek yüzeylerde kısmen vivo içinde koşulları taklit eden bir fiziksel microenvironment hücrelerde kültür için yararlı yüzeylerde olmak kanıtlanmış oldu. Burada, Young'ın dönmeler izotropik doğrusal elastik yüzeyler genellikle mechanobiology çalışmaları için kullanılan, karakterize için basit bir protokol mevcut. Protokol bir Petri kabına veya sert silikon yumuşak silikon yüzey hazırlama, silikon substrat floresan boncuklar ile üst yüzey kaplama, floresan Imaging üst yüzeyi (yerçekimi) tarafından girintilemek için bir milimetre çaplı küre kullanarak oluşur boncuk floresan mikroskop kullanarak ve Young katsayısı, silikon substrat hesaplamak için sonuç görüntüleri analiz girintili silikon yüzeyi. Substrat'ın üst yüzeyi dönmeler hücre dışı matriks proteini (ek floresan boncuklar) ile kaplin kolayca sonraki çalışmalar traksiyon kuvvet mikroskobu deneyler kullanarak ve hücre kaplama için kullanılmak üzere silikon yüzey sağlar. Yumuşak silikon temeli olarak bir petri yerine sert silikon kullanımı dış streç içeren mechanobiology çalışmalar kullanımını etkinleştirir. Bu iletişim kuralı belirli bir avantajı birçok laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılabilir, widefield floresan mikroskop büyük ekipman bu yordam için gerekli olmasıdır. Biz bu iletişim kuralı, yumuşak silikon yüzeylerde farklı elastik dönmeler, Young katsayısı ölçerek göstermek.
Introduction
Yumuşak doku hücrelerinde bir mikro-kimin sertlik kilopascal Aralık1, doku kültürü yemekleri olan sertlik büyüklükte birkaç emir daha yüksek olduğunu aksine ortamı yer alır. Hücre dışı matriks proteini kaplı yumuşak yüzeylerde hücrelerdeyse ile erken deneyler yüzey sertliği nasıl hücreleri üzerinde hareket yanı sıra2,3altında hücre dışı matriks uygun etkiler gösterdi. Aslında, yüzey sertliği temelde yaygın biyokimyasal sinyalleri için benzer bir şekilde hücre fonksiyonu4 etkiler. Polyacrylamide (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplı) jelleri (su-permeating) kapsamlı5mechanobiology çalışmalar için kültür yüzeylerde hücre olarak kullanılmış olan hydrogels. POLYDİMETHYLSİLOXANE (PDMS), en sık kullanılan silikon (polysiloxane), yaygın sert bir silikon ile megapascal menzilli sertlik mikron ölçekli imalat6için kullanılmıştır. Son zamanlarda, daha yumuşak silikon yüzeyler ile sertlik daha fizyolojik ilgili kilopascal aralığındaki hücre kültür yüzeyler için mechanobiology çalışmalar7,8olarak istihdam edilmiştir.
Atomik kuvvet mikroskobu, makroskopik deformasyon küreler kullanarak ve küresel microindentors9 uçlu depoladığınız ve Reolojisi, germe üzerine tüm örnekleri de dahil olmak üzere esnek yüzeylerde sertliği ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır . Her tekniği kendine özgü avantajları ve dezavantajları olsa da, girinti bir küre ile yalnızca erişmesi gereken widefield floresan mikroskop bir özellikle basit ama oldukça doğru yöntemdir. Girinti metalik bir küre ile ön çalışma3,9,10hydrogels sertliği ölçmek için kullanılmaktadır. Yüzey sertliği hücre hareketi için önemini gösterdi erken dönem çalışmaları hidrojel yüzey sertliği3belirlemek için bu yöntemi kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, confocal mikroskobu da zarif karakterizasyonu10için kullanılmıştır.
Burada, floresan boncuk kaplin yumuşak silikon yüzey hazırlama adım adım bir iletişim kuralı mevcut (ve bir hücre dışı matriks protein kollajen gibi ben) düşsel bir indenting küre ve üst yüzey kullanarak sadece üst yüzeye, faz ve Imaging, sırasıyla ve nihayet Young katsayısı, silikon substrat hesaplamak için görüntüleri analiz floresan. Bu şekilde hazırlanan yumuşak silikon substrat çekiş kuvveti mikroskopisi deneyler için kolayca kullanılabilir. Yumuşak silikon üs olarak (yerine bir petri) sert silikon kullanımı da mechanobiology çalışmaları harici bir streç kullanarak sağlar. Garanti nerede pratik hususlar komplikasyonlar kaçınmak için gerekli ayrıca belirtilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. yumuşak silikon substrat imalatı
- 1,75 g bir bileşeni ve B bileşeni 1,75 gram ağırlığında (A:B = 1:1) (Polistiren) kullanarak yumuşak silikon elastomer Seti'nden tepsiler ağırlığında.
- B bileşeni tartı tepsisinde bir bileşeni eklemek ve bunları birlikte 5 min için bir uygun aplikatör stick kullanarak karıştırın.
- Yukarıdaki karışımı bir 35 mm Petri kabına ekleyin. Eşit yayılmış Petri kabına birkaç dakika karışım izin verin.
Not: Seçtiğiniz bir Petri kabına çapı ve yumuşak silikon miktarı yumuşak silikon kalınlığı belirler. Burada, kalınlığı yaklaşık 3.5 mm olacak; tartışma bölümünde elastomer kalınlığı belirlemeyle ilgili daha çok. - Herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak 15 dakika vakum odasında, kapak ile silikon karışımı ile Petri kabına yerleştirin. Bu süre içinde sıcak bir tabak ile 70 ° c ön ısı
- 70 ° C sıcak plaka ulaştıktan sonra bir cam slayt üzerine yerleştirin ve cam slayt üzerinde silikon karışımı ile Petri kabına yerleştirin. Silikon izin tedavi için 30 dk 70 ° c. Petri kabına erime gibi polistren çanak doğrudan sıcak tabakta koymayın.
2. yumuşak silikon için floresan lastikteki kaplin
- Tedavi yumuşak silikon (içinde ele geçen Petri kabına) derin bir UV odası (185 ve 254 nm ışık dalga boylarında ve derin bir UV lamba ile bir kasada) yerleştirin. Yumuşak silikon örnek (~ 5-10 cm uzaklıkta UV lambası) derin UV ışık için 5 min için maruz.
- Silikon derin UV ışığına maruz iken, aşağıdaki adım 2.2-2.6 ile devam edin. Derin UV Işınlarına maruz kalma sonra örnek almadan önce en az 5 min için derin UV odası degas.
- Bu arada, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 19 mg dışarı tartmak ve 500 μL deiyonize su (DI) su ekleyin. EDC tüpü hafifçe sallayarak geçiyoruz.
- Bir ayrı 1.5 mL microcentrifuge tüp N- hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) 11 mg tartmak, 500 μL DI su ekleyin ve tüpü hafifçe sallayarak sulfo NHS geçiyoruz. Sonra bir tek microcentrifuge tüp EDC ve sulfo-NHS çözümlerinde birleştirir.
- Bu EDC/sulfo-NHS, 30 μL 0,44 mikron çapında kırmızı (veya Floresan Mikroskobu kullanılabilir filtre küpleri göre başka bir floresan renk) değiştiren karboksilat floresan lastikteki (ile % 1 w/v hisse senedi toplama) ekleyin.
- EDC/sulfo-NHS/boncuk karışıma kollajen 0,02 mg (dan fare kuyruğu, hisse senedi 4 mg/mL 0,02 M asetik asit konsantrasyonu) 0,02 mg/mL konsantrasyonu elde etmek için.
- Girdap EDC/NHS/boncuk/kollajen ben karışımı kısa bir süre boncuk eşit boyunca, kaplin önce dağınık emin olun.
- Pipet EDC/NHS/boncuk/kollajen 1 mL ben karışımı parafilm başka bir sığ, düz kapak (daha küçük çaplı) üzerine yerleştirilen bir parçası üzerinde. Yumuşak silikon yüzey karışımı bağlantı kurar ama doğrudan küçük Petri kabına kapağı aşağıdaki yüzey dokunmatik değil böylece bu karışım üzerinde yumuşak silikon ile Petri kabına tersine çevirin. Ters Petri kabına artırmak için bir veya iki cam slayt ters Petri kabına çubukları iki tarafında altında kullanın.
Not: Lütfen adım 2.7 nasıl gerçekleştirildiğini görmek için Şekil 1 ' e bakın. - Alüminyum folyo ile örnek kapak ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Petri kabına yumuşak silikon ile kaldırın ve dik ayarlayın (silikon-yan).
- Yemek için PBS (pH 7,4) 2 mL ekleyerek yumuşak silikon yüzeyi fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile yıkayın. Birkaç dakika için oturup izin. PBS Aspire edin ve silikon PBS 2 mL ile tekrar yıkayın. Silikon tedavisi daha da yaklaşık bir gün ver. Bu nedenle, yumuşak silikon örnek 37 ° C'de gecede PBS içinde yerleştirin.
3. küre Widefield floresan mikroskop kullanarak girinti ile silikon sertlik ölçümü
- Petri kabına yumuşak silikon ile almak ve en az 1 mL silikon yüzeyi sıvı yüzeyinin altında birkaç mm için PBS içerdiğinden emin olun.
- Sivri uçlu cımbız kullanarak, beş 1 mm Zirkonyum küre indentors yumuşak silikon üzerinde bırakın. Küre sıvı orta bırakın ve bırakın, silikon katmanı ve diğer indentors konumunu uzak en az 5 indentor çapları kenarlarını uzak.
Not: sıvı yüzeyi üzerinde bıraktığımda, küreler sıvı orta (float) girmek sıvı orta 's yüzey gerilimi nedeniyle başarısız olabilir. - Petri kabına temel görüntüyü mümkün böylece Petri kabına yumuşak silikon ile mikroskop sahne alanı'nda yer.
- 10 X amacı ile faz Imaging'i kullanma (Kuru 10 X gibi objektif na 0,30), bulun ve bir küre indentor odak haline getirmek.
- Bir faz görüntü bir bölümünün ya da indentor bütün al ve bu resmi kaydedin. Bir kiremit tarama varsa kullanır. İndentor görünür herhangi bir kusur varsa, atın ve eski yerine koymak o ile başka bir indentor.
- Çerçevenin sol kenar en az ~1.5 R indentor Merkezi'nden bir mesafe olması canlı faz görüntüleme altında indentor'ın kenar sola çevir. İndentor merkezinin sağ tarafında görüntü çerçeve sağ kenarına yakın görünür kalmasını sağlamak. Bir faz görüntü alın ve kaydedin.
- Kırmızı floresan kanal için aydınlatma için mikroskop ışık kaynağı geçin. X- ve y-küre indentor'ın merkezi altında kırmızı floresan lastikteki kadar değişmeden koordinatları ( x-y konumu indentor merkezinin içinde ancak çerçevenin sağ kenarına yakın), focus (azalış Z) aşağı odak dışında git.
- Lastikteki silikon (yakın görüntüleme çerçevesinin sol kenarı) indentor uzak üst tabakası içinde odak dışında gidene 0.5 µm her z-artışı için görüntü yığınıyla z al.
- Örnek olarak diğer indentors ile 3.4-3,8 arasındaki adımları yineleyin.
4. silikon'ın sertlik (Young katsayısı) hesaplama
- ImageJ, tıkırtı üstünde çizgi aracını kullanarak indentor faz görüntüyü açmak ve indentor'ın çapı piksel cinsinden ölçün. Tıklatın ve bir noktada indentor kenarda tutun kenarında taban tabana zıt bir noktasına imleci hareket ve uzunluğu, pixel imleç serbest bırakmadan önce ImageJ ana pencerenin durum çubuğunda görüntülenen dikkat edin.
- Analiz tıklatarak uzunluk birimi piksel olarak ayarlandığından emin olun | Ayarla ölçek ve uzunluk birimikontrol.
- İndentor'ın RADIUS piksel cinsinden nesnel büyütme ve CCD kamera piksel boyutunu dikkate alarak mikron için dönüştürmek (mikron R piksel CCD kamera piksel boyutunu mikron x = R / nesnel büyütme).
- (Eğer lastikteki kırmızı floresan) kırmızı kanal z yığını microbead görüntüleri ImageJ içinde dosyası açmak | Alma | Görüntü sırası ve yığındaki herhangi bir görüntü seçin ve yığın açmak için Tamam ' ı tıklatın.
Not: F1 hangi lastikteki indentor Merkezi altında en iyi olası odakta ve F2 (at ~1.5 R boncuk merkezinden bölgesi) lastikteki çerçevenin sol kenar yakınındaki en iyi olası odakta olan çerçeve numarası çerçeve sayısıdır. Z-iki kare arasındaki farktır girinti derinlik δ.- Çizgi aracı ImageJ kullanarak, görüntü iyi tanımlanmış bir microbead arasında bir çizgi çizin. Tıkırtı üstünde analiz | Profil Arsa ve farklı çerçeve seçerken boncuk Güncellenme Zamanı satır tarama yoğunluğu elde etmek için Live düğmesini tıklayın. Maksimum yoğunluk en yüksek değerini verir kare kare odak olarak seçilebilir.
- Z-artış z-yığın çerçeveler arasında 0.5 mikron olduğundan, mikron olarak δ girinti derinlemesine hesaplamak (F2-F1) = 0.5 x.
- Yani üzerinde jel (eksi karşıt batmaz kuvvet), ağırlığı nedeniyle indentor tarafından sarf güç hesaplamak, girinti kuvvet F, (indentor - sıvı Orta yoğunluk yoğunluğu) x indentor x ivme yerçekimi nedeniyle hacmi olarak. Denklem F kullanın (4/3) x = (ρindentor - ρOrta) x (R3) x 3.142 indentor yarıçapı R nerede g x ρindentor olduğunu indentor, ρOrta yoğunluk sıvı Orta yoğunluk ve g ivmesi (9,81 m/s2) yerçekimi nedeniyle. Tüm miktarlar SI birimlerinde F (N) elde etmek için sağ taraftaki hızlı.
- Young katsayısı (E) değiştirilmiş bir11 Hertz model12 denklemi kullanarak silikon Hesapla:
Nerede:
c = o; aşağıdaki Hertz modeli ifade değiştirir bir düzeltme faktörü
v = Poisson oranı (0.5 incompressible malzemeler7gelince olarak alınan); silikon jel
F = girinti kuvvet;
R indentor RADIUS; = ve
Δ girinti derinlik =.
Tüm miktarlar SI birimlerinde E PA elde etmek için sağ taraftaki hızlı- 3aşağıdaki gibi düzeltme faktörü c Hesapla:
Nerede:
; ve
.
Bu düzeltme faktörü ne zaman sadece yumuşak silikon de Petri kabına (veya sert silikon) (Bu durumda burada) onun altına'nin özel olarak kullanılmak üzere olduğunu belirtmek. - S silikon eklendi ve Petri kabına çapı miktarına göre yumuşak silikon tabaka yüksekliği hesaplayabilirsiniz. Alternatif olarak, doğrudan silikon tabakanın alt ve üst yüzeyleri z koordinatını faz görüntüleme tarafından belirlenerek h elde etmek (küçük yabancı maddelerin her iki yüzeyde odak haline gelir). Bir büyük h için dikkat edin (s2 > Rδ), düzeltme faktörü c yakın 1'dir.
- 3aşağıdaki gibi düzeltme faktörü c Hesapla:
- 4.1-4.4 her indentor için yineleyin. Young katsayısı silikon örnek için Ortalama Young katsayısı elde etmek için her indentor elde edilen ortalama.
; ve
.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak, biz 35 mm Petri kabına yumuşak silikon hazırlanan, 70 ° c 30 dk için tedavi ve floresan lastikteki birleştiğinde (ve kollajen ben) Şekil 1' de şematik olarak tasvir üst yüzeyi için. Derin UV yüzeylerde13için kaplin nihai protein için daha önce kullanılmış. Biraz daha bir gün boyunca tedavi etmek için yumuşak silikon beklendiği gibi (I) burada kullanılan kür koşulları bu yumuşak silikon ve (II) girinti ölçüm için özel not ertesi gün gerçekleştirilir.
Silikon yüzeyinin küresel girinti karakterize çeşitli parametreler Şekil 2içindeAgösterilir. Faz görüntüleme yakalamak için kullanılan ya da (ben) indentor tüm görüntü Şekil 2' de gösterildiği gibiB (görüntü dikişi, gerekirse kullanarak) veya küre görüntü parçası (II). İndentor'ın görüntü elde edilebilir için tek çapına parametresidir. Örneğin, 1:1 yumuşak silikon bu protokolü ile kullanılan indentor için 950 µm 1,037 µm ortalama değerini ve 47 µm (8 indentors)'in standart sapması ile 1200 µm arasında değişiyordu çapları aynı çok farklı bireysel indentors vardı. Belirli bir indentor (birçok indentors için Ortalama çapı yerine) için ölçülen çap girinti indüklenen için sertlik hesaplama tarafından belirli o indentor kullanılması gerektiğini unutmayın.
Böylece indentor Bölgealtında çerçeveyi sağ kısmında silikon üst yüzeyi lastikteki floresan görüntülerini bir x-y çerçeve konumu alınır. Çerçevenin sol far parçası bölgede Şekil 3' te gösterildiği gibi indentor uzak bölge olması için seçilir. Z-yığın görüntüleri indentor altında ve indentor uzak bölgeleri Şekil 3' de gösterilmektedir. 1:1 yumuşak silikon ile kullanılan 1 mm çap Zirkonyum indentor için z değerleri 2 bölgeleri odak haline gelip yaklaşık 20 µm (δ) tarafından farklıydı. Bu çok 3.500 µm (ki aslında Zirkonyum dioksit ve silikon dioksit karışımından yapılır) zirkonyum indentor yoğunluğu (4.66 g/cm3) ve sıvı yoğunluğu kullanarak. yapıldı yumuşak silikon kalınlığı daha küçük Orta (PBS için: 1,01 g/cm3), silikon üzerinde sarf net kuvvet hesaplanabilir. Göz altında durum için 20-25 µN aralığında oldu. 1:1 yumuşak silikon için hesaplanan Young katsayısı 7.2 ± 2.4 kPa (konumlardan 6 bağımsız örnekleri havuzlu 28) yapıldı. Diğer A:B oranları (eşlik eden Belirli reaktifler tabloiçinde belirtilen) aynı yumuşak silikon için temsilcisi sonuçları tablo 1' de verilmiştir. Son olarak, bu protokol için açıklandığı gibi widefield mikroskop kullandığı küre girinti yöntemi doğrulamak için biz de Young'ın dönmeler ölçülen polyacrylamide jel biz bir Young katsayısı 21 ± 3 kPa, sahip olmak rheometer ile karakterize. Bu iletişim kuralı bir widefield mikroskop kullanarak küre girinti yöntemini kullanarak, polyacrylamide jel aynı kompozisyon bir Young katsayısı iyi anlaşması10gösteren 22.1 ± 4.2 kPa, var bulundu. Bu ölçümler taşıma yaparken dikkat uyarılar tartışma bölümünde ele alınmaktadır.
Şekil 1: yumuşak silikon üst yüzeyine flüoresan lastikteki kancası yordamı şematik tasviri. (A) tedavi edilmiş yumuşak silikon için derin UV maruz EDC, sulfo-NHS, boncuk ve kollajen 5 dk. (B) A karışımı için ışık ben su aşağı daha küçük çaplı bir kapak üstüne yerleştirilmiş parafilm bir parça üzerine pipetted. Sıvı temas ancak altında daha küçük kapağı üst yüzeyi ile olmasını sağlayın (C) yumuşak silikon örnek bu karışımı ters. İki cam slayt Petri dish altında iki tarafında çubukları hareket. (Örnek PBS, floresan lastikteki ile kaplı yumuşak silikon yüzeyi ile yıkama sertlik ölçüm için hazır olduktan sonraD). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: küre girinti yumuşak silikon yüzeyinin Şematik çizimde. (A) bu şematik tasvir bir yumuşak silikon örnek yüzeyinde bir küresel indentor gösterir. İlgi çeşitli parametreleri belirtilir. (B) Bu panel faz görüntüleme elde görüntüsü 1 mm indentor (üzerinde yumuşak silikon örnek) ile gösterir. Ölçek çubuğu 250 µm. gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: boncuk resim alma ve odaktaki görüntü belirlenmesi. (A) Bu floresan görüntü gösterir lastikteki yumuşak silikon örnek ve istenen x-y çerçevesini indentor (noktalı çizgi) göreli konumunu üst yüzeyinde. Ölçek çubuğu 150 µm. panelleri B ve C indentor (kutulu bölgelerde en iyi görüntü) uzak bölgeleri indentor ve (C) altında yumuşak silikon yüzeyi (B) z-yığın floresan resimleri göster gösterir. Göstergeler z1 ve z2 indentor altında bölge ve bölge indentor uzak odak, sırasıyla olan z değerleri için karşılık gelir. Ölçek çubuklar 20 µm gösterir. Gösterilen tek renkli görüntüler sözde pembe lastikteki kırmızı kanalı olan uyarma ve emisyon profilleri uygun kullanılan bu yana kırmızı kanalda elde bunlar. Odağı z-artışlarla 0.5 µm, çeşitli olarak (D) Bu paneli yoğunluk satır taraması bir mikro-boncuk (iç metin görüntü sarı bir çizgi ile karşıya gösterildiği) gösterir. Odaktaki yansımasına karşılık gelen odak (z-değeri) objektif satır tarama için en yüksek maksimum yoğunluğu ile karşılık gelen z değeri temel alınarak seçilebilir. Ölçek çubuğu ilave olarak 20 µm. gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Silikon elastomer * A:B | Young'ın modülü ** (kPa) |
| 1:1 | 7.2±2.4 |
| 4:7 | 37.6±3.9 |
| 1:2 | 64.1±6.9 |
| * belirtilen eşlik eden tablo, belirli reaktifler/ekipman ** olarak küre girinti yöntemi ile ölçülen bir widefield mikroskop ayrıntılı olarak bu protokolü kullanarak |
|
Tablo 1. Young katsayısı (için tablo, belirli reaktifler/ekipman içinde belirtilen belirli silikon) yumuşak silikon burada ölçülen ayrıntılı protokolü kullanarak olarak farklı kompozisyonlar için. İçin iki karma bileşenleri A:B (ve karşılık gelen numarayı ölçümlerin) oranı 1:1 (28), 4:7 (13) ve 1:2 (8) değerlerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Küre girinti yöntemi uygulamak çok kolay olmakla birlikte, indentor seçimi ve yumuşak silikon örnek kalınlığı dikkat ödenmelidir. Denklem Young katsayısı hesaplamak için kullanılan birtakım koşullar11altında geçerli olduğundan ve silikon örnek kalınlığı > %10 indentor yarıçap olduğunda bunlar genellikle memnun musunuz ve < ~ 13 x indentor yarıçapı. 5-10 x silikon kalınlığı indentor RADIUS neyin örnek kalınlığı çok yüksek değil iyi bir seçim olduğunu ortaya koymuştur (yani, nesnel çalışma mesafesi değil haline bir sınırlama) ve hesaplanan sertlik de çok duyarlı değildi Silikon kalınlığı tam değerini. Girinti derinlik δ < %10 silikon kalınlığı gibi < %10 indentor yarıçap öyle ki küresel indentor seçiminde de olmalıdır. Bunu göz önünde bulundurarak, çap ve farklı maddi indentors daha yumuşak ve sert Silikonlar sertliği ölçmek için kullanılabilir. Girinti derinliği bu Protokolü'nün en önemli adım belirlenmesidir. Odaktaki görüntüleri tanımlamak için bu protokol için önerilen yöntem girinti derinlik güvenilir bir şekilde belirlemenize yardımcı olması. Ayrıca küre girinti yöntemi için kullanılan sertlik hesaplama sürtünmesiz temas varsayar elektromanyetik teorisi kullanır dikkat edilmelidir. Burada, bu düşük pürüzlülük indentors için iyi bir varsayım. Biz-si olmak kullanılmış (eşlik eden Belirli reaktifler tabloiçinde listelenen) belirli yumuşak silikon elastomer, diğer ticari silikon elastomer kitleri kullanılabilir. Sert Silikon microfabrication için çok kullanılan Not sertlik kPa aralıktaki ile yüzeyler yapmak için iyi bir seçim değildir. Ancak, (Bu sertlik kPa aralığın alt sınırı içinde var) yumuşak Silikonlar kPa aralığın sonuna daha yüksek sertlik ile yüzeyler yapmak için sert Silikon küçük bir yüzdesi ile karışabilir. Belirtilen koşulları daha önce memnun olduğu sürece elastomer bağlı olarak farklı bir boyutu veya yoğunluğu ile bir indentor, seçilebilir.
Birkaç anahtar konuları kaplin için floresan lastikteki, yumuşak silikon'ın üst yüzeyi için önemlidir. İlk olarak, biz seçtik 0,44 µm karboksilat boncuk çünkü onların fluorophore içerik ve dolayısıyla parlaklık benzer boncuk daha küçük boyutta daha büyük. Boncuklar parlak fluorophores içerir, ancak alt mikron karboksilat boncuk çok çözünürlük yöntemin olumsuz yönde değil için kullanılması gerektiğini öneririz küçük boncuk boyutları kullanılabilir. EDC/sulfo-NHS/boncuk/col1 karışımı ile silikon yüzeyinin kuluçka ters yapılandırmasında silikon yüzeyi ile yapılır. Karışımı ile boncuk silikon yüzey üzerine yerleştirildiğinde, sebebi, boncuk kümeleri floresan lastikteki görüntüsü iken fakir bir uzaysal çözünürlük için önde gelen silikon yüzey yerleşmek. Bu iletişim kuralı ile bile, boncuk kümeleri zaman zaman ( Şekil 3en iyi görüntü parlak bölgeler) tespit edildi. Ancak, onlar yöntemin çözünürlük etkilemeye kapsamlı değildir. Sıvı temas için silikon yüzey ama değil katı yüzeyin izin vermek için Şekil 1 c içinde kenarlarına Petri yemekler, birinin altında çubukları kullanmak mümkündür. Lastikteki bir hidrofobik kaplama ile seçilirse yumuşak silikon üst yüzeyine lastikteki kaplin bile derin UV ışık olmadan bir adım gerçekleştirilebilir. Sertlik ölçüm final substrat (UV tedavi, boncuk kaplin ve ECM kaplin sonra) gerçekleştirilir hangi hücrelerin üzerinde kaplama. Bir sertlik karakterizasyonu muhtemelen yüzey sertliği değiştirebilirsiniz, böylece ölçülen sertlik hücreleri maruz olan adımları (gibi UV tedavi) sonra gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın nce karşılanması.
Bir petri yerine sert PDMS bir yumuşak silikon14için temel olarak kullanılabilir. Bu tür bir yapılandırma dış bir streç neyin sert silikon gergin olabilir çerçeve sağlar hücrelere uygulamak için kullanılabilir ve yumuşak silikon bir hücre mikro-ortam daha fizyolojik sertlik sağlar. Çekiş kuvveti mikroskopisi15,16da bu yumuşak silikon jel7,8kaplama hücreleri ile gerçekleştirilebilir ve sadece üst katmandaki floresan lastikteki varlığı ile iyi bir çözünürlük sağlar Sadece widefield floresan mikroskop. Ben bu protokolünde diğer hücre dışı matriks proteinleri ile yedek olabilir kollajen. Atomik kuvvet mikroskobu gibi biraz daha dahil yöntemleri ile karşılaştırıldığında, küre girinti yöntemi daha kolay, genel olarak uygulanabilir. Young'ın dönmeler küre girinti yöntemi kullanılarak elde kıyasla ortalama olarak sapma bir rheometer kullanarak genellikle < %1010olduğunu belirledi. Böylece, (widefield floresan mikroskop kullanarak) küre girinti yöntemi mechanobiology uygulamalar için miktar yumuşak silikon (veya hidrojel) sertlik için erişilebilir bir yöntem sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Margaret Gardel cömertçe rheometer kullanımına izin verdiğiniz için teşekkür ederim. Bu eser etkin NIH (1R15GM116082) destek anıyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
References
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Pelham, R. J., Wang, Y. -L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79, 144-152 (2000).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Lee, E., et al. Deletion of the cytoplasmic domain of N-cadherin reduces, but does not eliminate, traction force-transmission. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (4), 1640-1646 (2016).
- Frey, M. T., Engler, A., Discher, D. E., Lee, J., Wang, Y. L. Microscopic methods for measuring the elasticity of gel substrates for cell culture: microspheres, microindenters, and atomic force microscopy. Methods Cell Biol. 83, 47-65 (2007).
- Lee, D., Rahman, M. M., Zhou, Y., Ryu, S. Three-dimensional confocal microscopy indentation method for hydrogel elasticity measurement. Langmuir. 31 (35), 9684-9693 (2015).
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (5), 2798-2810 (2002).
- Hertz, H. Über die Berührung fester elastischer Körper. Journal für die reine und angewandte Mathematik. 92, 156-171 (1882).
- Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. Protein micropatterns: a direct printing protocol using deep UVs. Microtubules: In Vivo. Cassimeris, L., Tran, P. , Academic Press. Burlington, San Diego. 133-146 (2010).
- Bashirzadeh, Y., Qian, S., Maruthamuthu, V. Non-intrusive measurement of wall shear stress in flow channels. Sensors and Actuators A: Physical. 271, 118-123 (2018).
- Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. Biophysical tools to study cellular mechanotransduction. Bioengineering (Basel). 4 (1), 12 (2017).
- Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008 (2017).
