Summary
Her beskriver vi en co-immunoprecipitation protokol for at studere protein-protein interaktioner mellem endogene nukleare proteiner hypoksiske betingelser. Denne metode er velegnet til demonstration af vekselvirkninger mellem transkriptionsfaktorer og transcriptional Co lovgivere på hypoxi.
Abstract
Lavt iltindhold (hypoksi) udløse en bred vifte af adaptive responser med hypoxi-inducerbar faktor 1 (HIF-1) kompleks som en master regulator. HIF-1 består af en heterodimerisk ilt-regulerede α-underenhed (HIF-1α) og constitutively udtrykt β-underenheden (HIF-1β) også kendt som aryl kulbrinte receptor nukleare translocator (ARNT), regulere gener involveret i forskellige processer herunder angiogenese , erythropoiesen og glykolyse. Identifikation af HIF-1 interagerende proteiner er nøglen til forståelsen af hypoxi signalering pathway. Ud over regulering af HIF-1α stabilitet udløser hypoxi også nukleare omplantning af mange transskriptionsfaktorer herunder HIF-1α og ARNT. Navnlig, er de fleste af de nuværende metoder, der anvendes til at studere disse protein-protein interaktioner (ppi) baseret på systemer hvor protein niveauer er kunstigt forøget gennem protein overekspression. Protein overekspression ofte fører til ikke-fysiologiske resultater som følge af tidsmæssige og rumlige artefakter. Her beskriver vi en modificeret co-immunoprecipitation protokol efter hypoxi behandling ved hjælp af endogene nukleare proteiner, og som en proof of concept viser samspillet mellem HIF-1α og ARNT. I denne protokol, de hypoksiske celler blev høstet hypoksiske betingelser og den Dulbecco Phosphate-Buffered saltvand (DPBS) wash buffer var også pre afbalancerede hypoksiske betingelser før skik at afbøde protein nedbrydning eller protein kompleks dissociation under reoxygenation. Derudover var de nukleare fraktioner efterfølgende udvundet for at koncentrere sig og stabilisere endogene nukleare proteiner og undgå eventuelle falske resultater ses ofte under protein overekspression. Denne protokol kan bruges til at påvise endogene og indfødte interaktioner mellem transkriptionsfaktorer og transcriptional Co regulatorer hypoksiske betingelser.
Introduction
Iltsvind opstår, når utilstrækkelig ilt tilføres til celler og væv i kroppen. Det spiller en afgørende rolle i forskellige fysiologiske og patologiske processer såsom stamcelle differentiering, betændelse og cancer1,2. Hypoxi-inducerbar faktorer (HIFs) fungere som heterodimers består af en ilt-regulerede α-subunit og en constitutively udtrykt β-underenheden også kendt som ARNT3. Tre isoformer af HIF-α underenheder (HIF-1α, HIF-2α og HIF-3α) og tre HIF-β underenheder (ARNT/HIF-1β, ARNT2 og ARNT3) er blevet identificeret til dato. HIF-1α og ARNT udtrykkes allestedsnærværende, mens HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 og ARNT3 har mere begrænset udtryk mønstre4. HIF-1 protein kompleks er den centrale regulator af hypoxi svar. Hypoksiske betingelser HIF-1α bliver stabiliseret, derefter translocates til kernen og dimerizes med ARNT5. Senere, dette kompleks binder sig til specifikke nukleotider kendt som hypoxi lydhør elementer (HREs) og regulerer udtryk for target gener involveret i forskellige processer herunder angiogenese, erythropoiesen og glykolyse6. Ud over denne "canonical" svar, hypoxi signalvejen er også kendt at krydstale med flere cellulære reaktion signalering veje som Notch og nuklear Factor-kappa B (NF-κB)7,8,9.
Identifikation af roman HIF-1 interagerende proteiner er vigtige for en bedre forståelse af hypoxi signalering pathway. I modsætning til ARNT, der er ufølsom over for iltindholdet og constitutively udtrykt, er HIF-1α protein niveauer stramt reguleret af cellulær ilt niveauer. På normoxia (21% ilt) er HIF-1α proteiner hurtigt forringet10,11. HIF-1α kort halveringstid på normoxia præsenterer specifikke tekniske udfordringer for påvisning af protein fra celle ekstrakter og for identifikation af HIF-1α-interagere proteiner. Desuden translocate flere transskriptionsfaktorer herunder HIF-1 kompleks ind i kernen under hypoksiske betingelser12,13,14. De fleste af de nuværende metoder, der anvendes for PPI undersøgelser udføres ved hjælp af ikke-fysiologisk overekspression af proteiner. Sådanne protein overekspression er blevet rapporteret at forårsage forskellige cellulære defekter gennem flere mekanismer, herunder ressource overbelastning, støkiometriske ubalance, promiskuøs interaktioner og pathway graduering15,16. Med hensyn til PPI undersøgelser, kan protein overekspression føre til falsk positiv, eller sågar falske negative, resultater afhængigt af protein egenskaber og funktioner af overexpressed proteiner. De nuværende metoder for PPI undersøgelser skal derfor ændres for at afsløre de fysiologisk relevante PPI hypoksiske betingelser. Vi har tidligere vist samspillet mellem HIF-1 og Ets familie transkriptionsfaktor GA-bindende protein (GABP) i hypoksiske P19 celler, som bidrager til svar af Hes1 initiativtageren til hypoxi17. Her, beskriver vi en co-immunoprecipitation protokol for at studere PPI mellem endogene nukleare proteiner hypoksiske betingelser. Samspillet mellem HIF-1α og ARNT er vist som en proof of concept. Denne protokol er egnet til viser samspillet mellem transkriptionsfaktorer og transcriptional Co regulatorer hypoksiske betingelser, herunder men ikke begrænset til identifikation af HIF-1 interagerende proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokoltjenesten, som bruger menneskelige embryonale nyre 293A (HEK293A) celle, s følger retningslinjerne i menneskelige videnskabsetisk Komité i Nanyang Technological University, Singapore.
1. induktion af hypoxi i HEK293A celler
- Forberede fire 10 cm retter og frø 3-5 x 106 HEK293A celler pr. parabol i 10 mL Dulbeccos modificerede Eagle's medium (DMEM, 4,5 g/L glukose) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 110 mg/L natrium pyruvat, 100 U/mL penicillin og 100 mg / mL streptomycin. Kultur cellerne i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
Bemærk: Celle såning bør foretages en biologisk sikkerhed kabinet (BSC). Overflader af alle materialer skal placeres i BSC skal tørres med 70% ethanol. - 24 timer efter såning, når cellerne har nået 80-90% confluency, sat to retter i hypoxi subchamber i rugemaskine handskerum (Se Tabel af materialer) med 1% O2 og 5% CO2 ved 37 ° C, og holder den anden to retter på normoxia (21% O 2, 5% CO2 ved 37 ° C) til 4 h. bruge et sæt normoxic og hypoksiske celler til at evaluere hypoxi behandling af vestlige skamplet og udnytte andet sæt af celler for co-immunoprecipitation eksperimenter.
Bemærk: Ilt niveauer kan indstilles på 0-5%, og hypoxi behandlingens varighed kan varieres afhængigt af hvilken celle og studere mål.
2. hele cellen og nukleare udvinding
Bemærk: Se tabel 1 for oplysninger om buffere anvendes i denne protokol.
-
Høste normoxia kontrol celler.
- Fjern kultur medier ved aspiration og skyl celler med 10 mL DPBS (PH 7,0-7.2) ved hjælp af 10 mL pipette.
Bemærk: Undgå at berøre den celle éncellelag med en pipette. Under vask, afpipetteres forsigtigt DPBS ned på væggen af celle kultur plade for at undgå celletab. - Der afpipetteres 5 mL iskold DPBS i pladen og skrabe celler fra overfladen af pladen i iskold PBS med en celle skraber.
- Overføre cellesuspension til 15 mL koniske rør og holde på is.
- Fjern kultur medier ved aspiration og skyl celler med 10 mL DPBS (PH 7,0-7.2) ved hjælp af 10 mL pipette.
-
Høste cellerne kulturperler hypoksiske betingelser.
- Pre reagensglasset DPBS hypoksiske betingelser ved at placere en udækket 100 mL eksperiment glas reagensflaske fyldt med DPBS i hypoxi subchamber (1% O2 og 5% CO2 ved 37 ° C) i 24 timer i forvejen.
- Ca 1 time før høst hypoxi behandlede celler, placere en ice box der indeholder is i forarbejdning kammer handskerum, som har været ekvilibreres 1% O2 og 5% CO2. Overføre den flaske, der indeholder den pre afbalancerede hypoksiske DPBS fra hypoxi subchamber til forarbejdning kammer og placere den på is.
- 4 h efter hypoxi behandling, overføre cellerne fra hypoxi subchamber til forarbejdning kammeret, der har været præ afbalancerede 1% O2 og 5% CO2.
- Fjern kultur medier ved aspiration og skyl cellerne når med 10 mL iskold pre afbalancerede hypoksiske DPBS med 10 mL afpipetteres.
- Der tilsættes 5 mL iskold pre afbalancerede DPBS med 5 mL afpipetteres og løsne cellerne ved at skrabe med en celle skraber.
- Vippe celle kultur plade og indsamle de fritliggende celler ved hjælp af 10 mL pipette. Overføre cellesuspension i DPBS til 15 mL koniske rør og holde på is.
- Åbn døren mellem de behandling og buffer kamre i handskerum, som begge har været præ afbalancerede til 1% O2 og 5% CO2. Overføre 15 mL konisk rør på isen med hypoxi behandlede celler fra forarbejdning kammer til buffer kammer. Åbn døren til buffer salen og fjerne cellerne helt fra handskerum.
- Pellet både normoxic cellerne fra 2.1 og hypoksiske celler fra 2.2 ved centrifugering ved 1.000 x g i 5 min. ved 4 ° C.
-
Forberede hele cellen ekstrakter.
- Resuspend celle pellets i 500 µL af iskold radio immunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer indeholdende 50 mM Trisaminomethane hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM natriumchlorid (NaCl), 1% tergitol-type NP-40 (NP-40), 0,5% natrium deoxycholate, og 0,1% sodium dodecyl sulfat (SDS), suppleret med 1 x protease hæmmer cocktail (Se Tabel af materialer) af pipettering celle pellets op og ned flere gange.
- Overføre cellelysater til nye 1,5 mL microcentrifuge rør og holde på is i 30 min med lejlighedsvise vortexing.
- Centrifugeres cellelysater ved 13.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Indsamle supernatanten supernatanten, alikvot 50 µL i 1,5 mL microcentrifuge rør, og opbevares ved-80 ° C.
-
Forberede de nukleare ekstrakter ved hjælp af en nuklear udvinding kit (se tabel af materialer).
- Forsigtigt resuspend celle pellets i 500 µL af lysis buffer NL suppleret med 1 x protease hæmmer cocktail og 0,1 M dithiothreitol (DTT) af pipettering celle pellets op og ned flere gange.
- Tilsæt 25 µL af rengøringsmiddel NP til cellesuspension og vortex for 10 s ved maksimal hastighed.
- Der centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min. ved 4 ° C.
- Indsamle supernatanten (cytoplasmatisk uddrag), alikvot 50 µL af supernatanten i 1,5 mL microcentrifuge rør, og opbevares ved-80 ° C.
- Resuspenderes indeholdende cellekerner i 500 µL af lysisbuffer NL suppleret med 1 x protease hæmmer cocktail og 0,1 M DTT vortexing for 5 s ved maksimal hastighed.
- Der centrifugeres ved 10.000 x g i 5 min. ved 4 ° C og gemme den nukleare pellet.
- Nukleare resuspenderes i 50 µL af udvinding Buffer NX1 suppleret med 1 x protease hæmmer cocktail af pipettering pellet op og ned flere gange.
- Inkuber i 30 min på is, vortexing for 10 s hvert 5 min ved maksimal hastighed.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C.
-
Desalt de nukleare ekstrakter.
- Indsamle supernatanten fra trin 2.5.9 og overførsel til mini dialyse enheder med et maksimalt rumfang på 100 µL pr. enhed.
- Cap mini dialyse enheder og placere dem i en flotation enhed.
- Sætte flydeanordninger enheden i et bægerglas, der indeholder 500 mL af pre kølet dialyse buffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20% glycerol, 100 mM kaliumchlorid (KCl), 0,2 mM ethylendiamintetra syre (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) og 0,5 mM DTT) og Inkuber i 30 min. ved 4 ° C med blid omrøring.
Forsigtig: PMSF er farlige. Undgå direkte kontakt med huden eller ved indånding. - Indsamle prøver fra hjørnet af mini dialyse enheder og overføre til ny 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C, alikvot 25 µL af hver supernatanten ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør, og opbevares ved-80 ° C.
3. evaluering af hypoxi behandling af påvisning af Protein udtryk og subcellulært lokalisering af HIF-1α
- Bestemme proteinkoncentration hele cellen eller nukleare/cytoplasmatisk ekstrakter bruger mikrotiterplade analysen af en bicinchoninic syre (BCA) protein assay kit ifølge producentens instruktioner18.
- Fortynd cellelysater i 1 x Laemmli prøvebuffer indeholdende 5% 2-Mercaptoethanol og kog ved 95 ° C i 5 min.
Forsigtig: Rør ikke ved overfladen af den varme blok, da det kan forårsage forbrændinger. -
Adskille proteiner af sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE).
- Læg lige store mængder af protein (25 µg) i hver brønd med en SDS-PAGE præfabrikerede gradient geler (4 – 20%), sammen med 3 µL af molekylvægt markør.
- Kør gelen i kører buffer indeholdende 2,5 mM Tris, 19,2 mM glycin, 0,01% SDS, PH8.3 for 30 min på 200 V.
-
Overføre proteiner til fra gel til nitrocellulose membran.
- Samle overførsel sandwich (filtrerpapir-gel-membranfilter papir) med gel på anode side og membran katode side af kassetten.
- Placer kassetten i overførsel tanken fyldt med overførsel buffer indeholdende 2,5 mM trisaminomethane (Tris), 19,2 mM glycin og 20% methanol.
Forsigtig: Methanol er brandfarligt og bør opbevares inde den brandfarlige flydende opbevaringsskab. - Gennemføre overførslen i 1 time ved 100 V i det kolde rum.
- Blokere skamplet i 10 mL blokerende buffer indeholdende 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1 Tween 20 og 5% fedtfrit mælk i 1 time ved stuetemperatur på en shaker.
- Inkuber skamplet med anti-HIF-1α antistof (1/500 fortynding) i den samme blokerende buffer natten over ved 4 ° C.
- Vask skamplet 3 gange for 5 min hver gang med 50 mL TBS-T.
- Inkuber skamplet med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundær antistof (1/1.000 fortynding) i 10 mL TBS-T indeholdende 5% fedtfrit tørt mælk i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask skamplet 3 gange for 5 min hver gang med 50 mL TBS-T.
- Mix 500 µL hver af forøget chemilumescent (ECL) reagens A og B i en 1,5 mL microcentrifuge rør og vortex kort.
- Gælde skamplet ECL substrat og inkuberes i 1 min. ved stuetemperatur.
-
Fange de kemiluminescens signaler ved hjælp af en afgift - sammen enhed (CCD) kamera-baserede imaging system.
- Dræne overskydende ECL substrat ved at røre ved kanten af membran med en silkepapir og placere membranen i en ark protector.
- Placer membranen på bakken stikprøve af CCD kamera-baserede imaging system.
- Lancere billedbehandlingsprogram (Se Tabel af materialer) og tage billeder med følgende indstillinger: File → ny protokol → Single channel → protokol opsætning → Gel imaging (anvendelse: Chemi; Imaging område: Bio-Rad klar gel; Imaging eksponering: Softwaren vil automatisk optimere eksponeringstid for intens bands) → Run protokol
Bemærk: Eksponeringstiden kan indstilles manuelt til at opnå de optimale billeder.
4. Immunoprecipitation og påvisning af Immunoprecipitated proteiner
- Vask 50 µL af protein A/G sepharose perler i 500 µL af TBS buffer i 1,5 mL microcentrifuge rør og pellet perlerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 2 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten og resuspend perlerne i 100 µL af TBS buffer.
- Tilføj 2 µL af musen monoklonalt anti-ARNT antistof (1,4 mg/mL) eller mus Immunoglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL), som blev udarbejdet af erstatningsgodtgørelse 0,7 mg mus IgG i 500 µL TBS buffer.
- Placer 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende perler i en tube rotator og inkuberes i 2 timer ved 10 rpm i det kolde rum.
Bemærk: Håndtere rør forsigtigt og holde den suspension, der indeholder perler i bunden af røret. - Pellet perlerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 2 min. ved 4 ° C og kassér analysere.
- Fortynde 200 µg af den nukleare protein lysate fremstillet i trin 2.6.5 i 800 µL af den IP buffer bestående af 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20% glycerol, 0,2% NP-40 og 1 x protease hæmmer cocktail. Inkuber den lysate med antistof-kombineret perlerne fremstilles trin 4.5 natten over ved 4 ° C.
- Pellet perlerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 2 min. ved 4 ° C, slette analysere og vaske perlerne 3 gange med 1 mL iskold TBS indeholdende 0,2% NP-40.
- Kog perlerne i 50 µL Laemmli prøvebuffer ved 95 ° C i 5 min.
- Centrifugeres perler på 10.000 x g i 5 min. ved 4 ° C, indsamle supernatanten, og kassér perlerne.
Bemærk: Supernatanten kan opbevares ved 4 ° C på kort sigt eller -20 ° C på lang sigt. - Påvise tilstedeværelsen af HIF-1α fra immunoprecipitated proteinkomplekser af vestlige skamplet som tidligere beskrevet i trin 3.3 og fremefter.
Bemærk: Protein kvantificering er ikke nødvendig for dette trin. Indlæse fuld volumen (50 µL) af supernatanten af hver prøve i hver brønd med en SDS-PAGE præfabrikerede gradient geler (4 – 20%)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vurdere den cellulære reaktion på hypoxi, udtrykket niveauer og subcellulært lokalisering af komponenterne i HIF-1 komplekse følgende hypoxi behandlingen blev undersøgt. HEK293A celler blev kulturperler hypoksiske betingelser for 4 h eller holdes på normoxia som kontrol. HIF-1α og ARNT protein niveauer blev undersøgt i hele cellen eller nukleare/cytoplasmatisk uddrag af vestlige skamplet. Som forventede, samlede HIF-1α niveauer var upregulated af hypoxi, mens ARNT niveauer i samlede cellulære lysates ikke var væsentligt ændret (figur 1A). Derudover induceret hypoxi nukleare ophobning af både HIF-1α og ARNT i HEK293A celler (figur 1B), som er i overensstemmelse med tidligere betænkninger, selv om cytoplasmatisk udtryk for ARNT ikke blev fundet i nogle af de testede celle linjer19.
Næste, vi viste interaktion mellem HIF-1α og ARNT efter hypoxi behandling. Nukleare ekstrakter blev udarbejdet fra HEK293A celler udsat for normoxic eller hypoksiske betingelser for 4 h. Co-immunoprecipitation eksperimenter blev udført ved hjælp af nukleare uddrag af HEK293A celler. Som vist i figur 2, var HIF-1α co-immunoprecipitated sammen med ARNT af nukleare ekstrakter af hypoksiske HEK293A celler.
Tilsammen, protokollen beskrevet med held kan anvendes til at fremkalde en hypoksiske svar i celler og du kan yderligere bestemme fysiologiske protein binding af endogent udtrykt HIF-1α/ARNT komplekser i kernen.
Figur 1: Regulering af protein udtryk og subcellulært lokalisering af HIF-1 komponenter af hypoxi. (A) immunblot analyse af samlede HIF-1α eller ARNT udtryk i HEK293A celler. Cellerne blev udsat for iltmangel for 4 h (H) eller holdes på normoxia (N). Proteiner fra hele-celle ekstrakter var adskilt af SDS-PAGE og analyseret af immunoblotting med anti-HIF-1α, anti-ARNT og anti-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) antistoffer. GAPDH blev brugt som en loading kontrol. (B) immunblot analyse af HIF-1α og ARNT udtryk i subcellulært brøkdele af HEK293A celler. HEK293A celler blev kulturperler hypoksiske betingelser for 4 h (H) eller holdes på normoxia (N). 25 µg protein fra nukleare eller cytoplasmatisk ekstrakter blev analyseret af immunoblotting ved hjælp af anti-HIF-1α, anti-ARNT, anti-yin og yang 1 (YY1) og anti-GAPDH antistoffer. YY1 og GAPDH blev brugt som lastning kontrolforanstaltninger for nukleare og cytoplasmatisk fraktioner, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: HIF-1α interagerer med ARNT hypoksiske betingelser. HEK293A celler blev udsat for iltmangel for 4 h eller holdes på normoxia som kontrol. Nukleare ekstrakter fra HEK293A celler blev forberedt og immunoprecipitations blev udført ved hjælp af et anti-ARNT antistof. Nuklear ekstrakter (input) og immunoprecipitated proteiner blev analyseret af immunoblotting ved hjælp af anti-HIF-1α, anti-ARNT og anti-YY1 antistoffer. YY1 blev brugt som en loading kontrol for råmaterialer, mens IgG blev brugt som den negative kontrol for co-immunoprecipitation eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Løsning | Komponenter | Kommentarer |
| Dialyse buffer | 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 20% glycerol, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF og 0,5 mM DTT | Tilsæt PMSF og DTT umiddelbart før brug. |
| Kører buffer | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glycin og 0,01% SDS | Blandes 100 mL 10 x glycin-Tris-SDS buffer med 900 mL ddH2O. |
| Overføre buffer | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glycin og 20% methanol | Blandes 100 mL 10 x Tris/glycin buffer med 200 mL methanol og 700 mL ddH2O. |
| TBS buffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) og 150 mM NaCl | Blandes 100 mL 10 x TBS buffer med 900 mL ddH2O. |
| TBS-T buffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20 | Blandes 100 mL 10 x TBS buffer med 900 mL ddH2O og 1 mL af Tween 20. |
| Blokerende buffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 og 5% fedtfrit mælk | Opløse Blotting-Grade Blocker. 5 g i 100 mL TBS-T buffer. |
| IP buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20% glycerol, 0,2% NP-40 og 1 x protease hæmmer cocktail | Tilføje protease hæmmer cocktail umiddelbart før brug. |
Tabel 1: Løsning forberedelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HIF-1 komplekset er en master regulator af cellulær ilt homøostase og regulerer et væld af gener involveret i forskellige cellulære adaptive responser til hypoxi. Identifikation af roman HIF-1 interagerende proteiner er vigtige for forståelsen af hypoksiske signaltransduktion. Co-immunoprecipitation eksperimenter er almindeligt anvendt til PPI undersøgelser for at afgrænse cellulære signaltransduktionsveje. Men protein overekspression er stadig udbredt og dette kan føre til eksperimentelle artefakter. Derudover HIF-1α er en meget ustabil protein og det bliver hurtigt nedbrudt under fornyet iltning11. Derudover udløser hypoxi nukleare translokation af HIF-1 komponenter i de fleste pattedyr cellelinjer. Konventionelle co-immunoprecipitation protokoller skal derfor være optimeret til identifikation af fysiologisk relevante HIF-1 interagerende proteiner efter hypoxi behandling. Her, beskriver vi en modificeret co-immunoprecipitation-protokollen, som bruges til at vise interaktion mellem HIF-1α og ARNT på hypoxi.
For at undgå forringelse af HIF-1α under fornyet iltning, blev de hypoksiske celler høstet inde i forarbejdning kammer af inkubator handskerum, som blev præ ekvilibreres hypoksiske betingelser. DPBS wash buffer var også ekvilibreres hypoksiske betingelser før brug. Hvis der er ingen hypoxi arbejdsstation til forarbejdning, kan hypoksiske cellerne vaskes med pre afbalancerede hypoksiske DPBS og herefter høstes hurtigt på is. I betragtning af at hypoxi kan udløse nukleare omplantning af HIF-1 komponenter og at protein overekspression kan fremkalde artefactual resultater, blev endogene nukleare proteiner anvendt i denne protokol. Brugen af nukleare ekstrakter i co-immunoprecipitation-protokollen har også været rapporteret af andre20. Det repræsenterer en teknisk fordel for undersøgelse af samspillet mellem nuklear proteiner, fordi den minimerer risikoen for nuklear proteiner fra at være fortyndet ud af hele-celle proteiner. Desuden, brug af nuklear ekstrakter kan være nyttige for reduktion af ikke-specifikke interaktioner, især fra meget rigelige irrelevant cytoplasmatisk proteiner, og til forbedring af nukleare protein stabilitet ved at minimere eksponering for proteaser stede i cytoplasmaet. Brugen af endogene nukleare ekstrakter i stedet for hele cellen ekstrakter til co-immunoprecipitation viser en betydelig teknisk forbedring, som vi kun kan opdage samspillet mellem HIF-1α og GABPα bruger endogene nukleare ekstrakter, men ikke bruger hele celle ekstrakter17.
I den beskrevne protokol, kan flere betingelser optimeres yderligere for at forbedre resultaterne. Vi induceret hypoxi i HEK293A celler ved at behandle dem med 1% ilt til 4 h. Ilt niveauer og hypoxi behandlingens varighed kan dog varierede for forskellige celletyper og tilpasset målene for undersøgelsen. For eksempel, kan HIF-1α og HIF-2α varierende reguleres af hypoxi i en celle type bestemt måde, med angivelse af deres forskellige roller i forskellige biologiske sammenhænge. Det har vist sig at i neuroblastoma celler, HIF-1α er mest aktive i korte perioder med intens hypoxi (1% O2), mens HIF-2α er også aktiv under milde hypoxi (5% O2) og bliver mere aktive følgende kronisk hypoxi behandling (48-72 h af hypoksiske eksponering)21. 0 – 5% O2 niveauer er almindeligt anvendt til in vitro- hypoxi behandlinger, hvor 1-5% O2, 0,1-1% O2 og 0-0,1% O2 defineres ofte som mild hypoxi, hypoxi og iltmangel, henholdsvis22. Saltkoncentration er en anden parameter, der kræver optimering, især fordi det spiller en afgørende rolle for ionisk interaktioner i ppi23. Nukleare ekstrakter blev anvendt i denne undersøgelse med de nukleare proteiner normalt udvindes ved hjælp af en buffer, som indeholder høje koncentrationer af salt. Derfor kan de nukleare ekstrakter skal afsaltes inden co-immunoprecipitation eksperimenter. Her, afsaltes vi de nukleare ekstrakter ved hjælp af en dialyse buffer indeholdende 100 mM KCl, og blandet de dialyzed ekstrakter med IP bufferen indeholder 180 mM NaCl proportionalt at opnå en endelig saltkoncentration tæt på 150 mM, som er lig fysiologiske intracellulære PPI betingelser. Den endelige salt koncentration kan blive ændret afhængigt af egenskaberne for PPI af interesse. I denne protokol, blev GAPDH brugt som lastning kontrol til hele cellen ekstrakter og cytoplasmatisk fraktioner. Vi ikke observere nogen betydelig hypoxi-induceret regulerende effekt på GAPDH udtryk i HEK293A celler. Dog har GAPDH tidligere vist sig at være upregulated af hypoxi i visse celle typer24. Med dette i tankerne, man kan være nødvendigt at bruge alternative korrekt indlæsning kontrol når nødvendigt25. Separat, konstaterede vi en betydelig grad af baggrunden signal stammer fra enten perler eller antistoffer bruges i den aktuelle protokol. For at reducere baggrunden, kan man forlænge vask trin (10-15 min) eller udføre mere end 3 vasker (5 – 10 gange). Ionisk styrken af wash buffer kan alternativt også øges ved tilsætningen saltkoncentration fra 150 til 500 mM under vasker. Lysates kan også ryddes pre ved inkubering med protein A/G sepharose perler i 1 time ved 4 ° C med rotation.
Denne protokol er begrænset til nukleare ekstrakter og som sådan kan ikke være egnet til undersøgelse af PPI inden for andre cellulære rum såsom mitokondrier og det endoplasmatiske reticulum. Svarende til andre konventionelle co-immunoprecipitation protokoller, kan denne metode bruges til at studere PPI i real-time eller at afgøre, om PPI er direkte eller indirekte.
I sammendrag leverer vi en modificeret co-immunoprecipitation protokol for identifikation af roman fysiologisk relevante HIF-1 interagerende proteiner. Denne protokol er også velegnet til undersøgelse af samspillet mellem transkriptionsfaktorer og transcriptional Co regulatorer hypoksiske betingelser. Selv om denne protokol er designet specielt til co-immunoprecipitation eksperimenter hypoxi betingelser, kan en del af den beskrevne protokol for normoxia kontrol celler også bruges til at studere de nukleare PPI normoxia betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Assoc. Prof. synd Tiong Ong for brugen af hypoxi arbejdsstation. Dette arbejde blev støttet af følgende: Singapore Ministeriet for uddannelse, MOE 1T1-02/04 og MOE2015-T2-2-087 (til Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University starttilskud M4230003 (til P.O.B.), det svenske Forskningsråd, den Familie Erling Persson Foundation, Novo Nordisk Fonden, Stichting af Jochnick Foundation, den svenske Diabetes Association, Scandia Insurance Company, Diabetes forskning og Wellness Foundation, Kaj von Kantzow fond, den Strategisk forskningsprogram i Diabetes på Karolinska Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, og Knut og Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H.
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
