Summary
Här beskriver vi ett co-immunoprecipitation protokoll för att studera protein-protein interaktioner mellan endogena nukleära proteiner hypoxisk villkor. Denna metod är lämplig för demonstration av samspelet mellan transkriptionsfaktorer och transkriptionell samtidig regulatorer vid hypoxi.
Abstract
Låga syrenivåer (hypoxi) utlöser en mängd adaptiv svaren med hypoxi-inducerbara faktorn 1 (HIF-1) komplex egenskap en mästare regulator. HIF-1 består av en heterodimeriskt syre-reglerade α-subenheten (HIF-1α) och konstitutivt uttryckta β subenhet (HIF-1β) kallas även aryl kolväte receptor nukleära translocator (ARNT), reglerar genernas olika processer inklusive angiogenes , erytropoesen och glykolys. Identifiering av HIF-1 samverkande proteiner är nyckeln till förståelsen av den hypoxi signalering utbildningsavsnitt. Förutom regleringen av HIF-1α stabilitet utlöser hypoxi också på nukleära flyttning av många transkriptionsfaktorer inklusive HIF-1α och ARNT. Särskilt, är de flesta av de nuvarande metoder att studera sådana protein-protein interaktioner (PPI) baserade på system där proteinnivåer är artificiellt ökade genom protein överuttryck. Protein överuttryck ofta leder till icke-fysiologiskt resultat uppkommer tidsmässiga och rumsliga artefakter. Här beskriver vi en modifierad co-immunoprecipitation protokoll efter hypoxi behandling med hjälp av endogena nukleära proteiner, och som ett proof of concept, att Visa samspelet mellan HIF-1α och ARNT. I detta protokoll, hypoxisk celler skördats hypoxisk villkor och den Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) tvättbuffert var också pre skakad hypoxisk förhållanden före användning för att minska proteinnedbrytning eller proteinkomplex dissociation under reoxygenation. Dessutom extraherades de nukleära fraktionerna därefter för att koncentrera sig och stabilisera endogena nukleära proteiner och undvika möjliga falska resultat ses ofta under protein överuttryck. Detta protokoll kan användas för att demonstrera endogena och infödda interaktioner mellan transkriptionsfaktorer och transkriptionell samtidig tillsynsmyndigheter hypoxisk villkor.
Introduction
Hypoxi uppstår när otillräcklig syre levereras till celler och vävnader i kroppen. Det spelar en avgörande roll i olika fysiologiska och patologiska processer såsom stamcellers differentiering, inflammation och cancer1,2. Hypoxi-inducerbara faktorer (HIFs) fungera som heterodimerer består av en syre-reglerade α-subenheten och ett konstitutivt uttryckta β subenhet kallas även ARNT3. Tre isoformer av HIF-α subunitsna (HIF-1α, HIF-2α och HIF-3α) och tre HIF-β-subenheter (ARNT/HIF-1β, ARNT2 och ARNT3) har identifierats hittills. HIF-1α och ARNT uttrycks ubiquitously, medan HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 och ARNT3 har mer begränsad uttryck mönster4. HIF-1 protein komplex är den viktigaste regulatorn av hypoxi svaret. Hypoxisk villkor, HIF-1α blir stabiliserad, sedan translocates till kärnan och dimerizes med ARNT5. Därefter, detta komplex binder till specifika nukleotider kallas hypoxi responsive element (HREs) och reglerar uttrycket av målgener som är inblandade i olika processer inklusive angiogenes, erytropoesen och glykolys6. Utöver detta ”kanoniska” svar, den hypoxi signalvägen är också känt att överhörning med flera cellulära svar signalering vägar såsom Notch och Nuclear Factor-kappa B (NF-κB)7,8,9.
Identifiering av Roman HIF-1 samverkande proteiner är viktigt för en bättre förståelse för den hypoxi signalering utbildningsavsnitt. I motsats till ARNT, som är okänslig för syrehalten och konstitutivt uttryckta, är HIF-1α proteinnivåer hårt reglerad av cellulära syrenivåer. På normoxia (21% syre) är HIF-1α proteiner snabbt försämrade10,11. Den korta halveringstiden för HIF-1α på normoxia presenterar specifika tekniska utmaningar för detektion av proteinet från cell extrakt, liksom för identifiering av HIF-1α-interagera proteiner. Dessutom translocate flera transkriptionsfaktorer inklusive komplexet HIF-1 in i cellkärnan enligt hypoxisk villkor12,13,14. De flesta av de nuvarande metoderna för PPI studier utförs med icke-fysiologiskt överuttryck av proteiner. Sådan protein överuttryck har rapporterats orsaka olika cellulära defekter genom flera mekanismer inklusive resurs överbelastning, stökiometriska obalans, promiskuösa interaktioner och signalvägen moduleringen15,16. När det gäller PPI studier, kan protein överuttryck leda till falskt positiva, eller ens falska negativa, resultat beroende på protein egenskaper och funktioner av överuttryckt proteiner. Därför har de nuvarande metoderna för PPI studier ska ändras för att avslöja de fysiologiskt relevanta protonpumpshämmarna hypoxisk villkor. Vi har tidigare visat samspelet mellan HIF-1 och den Ets familj transkriptionsfaktor GA-bindande protein (GABP) i hypoxisk P19 celler, vilket bidrar till svaret från Hes1 arrangören till hypoxi17. Här beskriver vi ett co-immunoprecipitation protokoll för att studera protonpumpshämmare mellan endogena nukleära proteiner hypoxisk villkor. Samspelet mellan HIF-1α och ARNT visas som ett proof of concept. Detta protokoll är lämplig för att påvisa interaktioner mellan transkriptionsfaktorer och transkriptionell samtidig tillsynsmyndigheter hypoxisk villkor, inklusive men inte begränsat till identifiering av HIF-1 samverkande proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll avsnitt, som använder mänskliga embryonala njure 293A (HEK293A) cell, s följer riktlinjerna i mänskliga forskningsetisk kommitté i Nanyang Technological University, Singapore.
1. induktion av hypoxi i HEK293A celler
- Förbereda fyra 10 cm rätter och utsäde 3 – 5 x 106 HEK293A celler per maträtt i 10 mL Dulbecco's modified örnens medium (DMEM, 4,5 g/L glukos) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 110 mg/L natrium pyruvat, 100 U/mL penicillin och 100 mg / mL streptomycin. Odla cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
Obs: Cell sådd bör utföras i biologiska säkerhetsdragskåp (BSC). Ytorna på alla material placeras i BSC torkas med 70% etanol. - 24 h efter sådd, när cellerna har nått 80 – 90% konfluens, sätta två rätter i den hypoxi subchamber i inkubatorn glovebox (se Tabell för material) med 1% O2 och 5% CO2 vid 37 ° C, och hålla de andra två rätter på normoxia (21% O 2, 5% CO2 vid 37 ° C) för 4 h. använder en uppsättning normoxic och hypoxisk celler att utvärdera hypoxi behandling genom western blot och utnyttja den andra uppsättningen celler för co-immunoprecipitation experiment.
Obs: Syrehalten kan ställas in på 0 – 5%, och den hypoxi behandlingstiden kan varieras beroende på cell och studera mål.
2. hela cellen och nukleära utvinning
Obs: Se tabell 1 för information om buffertar används i detta protokoll.
-
Harvest normoxia kontroll cellerna.
- Ta bort kultur media genom aspiration och skölj cellerna med 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) med pipett 10 mL.
Obs: Undvik att vidröra den cell enskiktslager med pipetten. Under tvätten, Pipettera försiktigt DPBS ner muren av cell kultur plattan för att undvika cellförlust. - Pipettera 5 mL iskallt DPBS i plattan och skrapa cellerna från ytan av plattan i iskall PBS med en cell skrapa.
- Överföra cellsuspensionen i 15 mL koniska rör och hålla på is.
- Ta bort kultur media genom aspiration och skölj cellerna med 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) med pipett 10 mL.
-
Skörda cellerna odlade hypoxisk villkor.
- Pre temperera DPBS hypoxisk villkor genom att placera en avtäckta 100 mL experiment reagens glasflaska fylld med DPBS i den hypoxi subchamber (1% O2 och 5% CO2 vid 37 ° C) för 24 h i förväg.
- Ca 1 h före skörd hypoxi behandlas cellerna, placera en ice box innehållande is in i behandling kammaren av glovebox, som har varit utjämnad 1% O2 och 5% CO2. Överföra flaskan som innehåller den pre skakad hypoxisk DPBS från den hypoxi subchamber till behandling kammaren och placera den på is.
- 4 h efter hypoxi behandling, överföra cellerna från de hypoxi subchamber till behandling kammaren som har funnits före skakad 1% O2 och 5% CO2.
- Ta bort kultur media genom aspiration och skölj cellerna när med 10 mL iskallt pre skakad hypoxisk DPBS med en 10 mL Pipettera.
- Tillsätt 5 mL iskallt pre skakade DPBS med en 5 mL pipett och rubba cellerna genom att skrapa med en cell skrapa.
- Luta den cell kultur plattan och samla fristående cellerna med 10 mL pipett. Överför cellsuspensionen i DPBS till 15 mL koniska rör och hålla på is.
- Öppna dörren mellan bearbetning och buffert avdelningar med glovebox, som båda har varit före skakade till 1% O2 och 5% CO2. Överföra 15 mL koniska rören på is som innehåller hypoxi behandlas celler från bearbetning kammaren till avdelningen som buffert. Öppna dörren till buffert kammaren och ta bort cellerna helt från glovebox.
- Pellet både normoxic cellerna från 2.1 och hypoxisk cellerna från 2.2 genom centrifugering vid 1 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
-
Förbereda hela cellen extrakt.
- Återsuspendera cell pellets i 500 µL iskall radio immunoprecipitation assay (RIPA) lyseringsbuffert innehållande 50 mM Trisaminomethane hydroklorid (Tris-HCl) pH 8,0, 150 mM natriumklorid (NaCl), 1% tergitol-typ NP-40 (NP-40), 0,5% natriumdeoxikolat, och 0,1% sodium dodecyl sulfate (SDS), kompletterad med 1 x proteashämmare cocktail (se Tabell för material) av pipettering cell pellets upp och ner flera gånger.
- Överför den cell lysates till nya 1,5 mL mikrocentrifugrör och hålla på is för 30 min med enstaka vortexa.
- Centrifugera i cell lysates på 13 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Samla in den supernatant, alikvotens 50 μl av supernatanten i 1,5 mL mikrocentrifugrör och lagra vid-80 ° C.
-
Förbereda de nukleära extrakt med en nukleär utvinning kit (se tabell för material).
- Försiktigt resuspendera cell pellets i 500 µL lysis buffert NL kompletteras med 1 x proteashämmare cocktail och 0,1 M Ditiotreitol (DTT) av pipettering cell pellets upp och ner flera gånger.
- Tillsätt 25 µL av rengöringslösning NP till cellsuspension och virvel för 10 s med maximal hastighet.
- Centrifugera vid 10 000 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Samla in supernatanten (cytoplasmiska extrakt), alikvotens 50 μl av supernatanten i 1,5 mL mikrocentrifugrör, och lagra vid-80 ° C.
- Återsuspendera pelleten som innehåller cellkärna i 500 μl lyseringsbuffert NL kompletteras med 1 x proteashämmare cocktail och 0,1 M DTT vortexa för 5 s med maximal hastighet.
- Centrifugera vid 10 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C och spara den nukleära pelleten.
- Återsuspendera nukleära pelleten i 50 µL av utvinning buffert NX1 kompletteras med 1 x proteashämmare cocktail med pipettering pelleten upp och ner flera gånger.
- Inkubera i 30 min på is, vortexa för 10 s varje 5 min med maximal hastighet.
- Centrifugera vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
-
Avsalta nukleära extrakt.
- Samla in supernatanten från steg 2.5.9 och överföring i mini dialys enheter med en maximal volym av 100 µL per enhet.
- Cap mini dialys enheter och placera dem i ett flythjälpmedel.
- Placera den flotation-enheten i en bägare som innehåller 500 mL före kylda dialys buffert (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20% glycerol, 100 mM kaliumklorid (KCl), 0,2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) och 0,5 mM DTT) och inkubera i 30 minuter vid 4 ° C med skonsam omrörning.
Varning: PMSF är farliga. Undvik direkt kontakt med huden eller inandning. - Samla in prover från hörnet av mini dialys enheter och överföra till nya 1,5 mL mikrocentrifugrör.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C, alikvotens 25 µL av varje supernatanten i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, och lagra vid-80 ° C.
3. utvärdering av hypoxi behandling genom påvisande av proteinuttryck och subcellulär lokalisering av HIF-1α
- Att bestämma proteinkoncentration hela cellen eller kärn/cytoplasma extrakt med mikroplattan analys av en bicinchoninic syra (BCA) protein assay kit enligt tillverkarens instruktioner18.
- Späd den cellen lysates i 1 x Laemmli prov buffert som innehåller 5% 2-merkaptoetanol och koka vid 95 ° C i 5 min.
Varning: Vid inte ytan av värmeblocket, eftersom det kan orsaka brännskador. -
Separera proteiner av sodium dodecyl sulfate polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE).
- Läsa in lika mängder protein (25 µg) i varje brunn av en SDS-PAGE förtillverkade gradient geler (4 – 20%), tillsammans med 3 µL av molekylvikt markören.
- Kör gelen i kör buffert innehållande 2,5 mM Tris, 19,2 mM glycin, 0,01% SDS, PH8.3 för 30 min vid 200 V.
-
Överföra proteinerna till från gelen till nitrocellulosa membranet.
- Montera överföring smörgås (filterpapper-gel-membran-filter papper) med gelen på anoden sida och membranet på katoden sida av kassetten.
- Placera kassetten i överföring tanken fylld med överföring buffert innehållande 2,5 mM trisaminomethane (Tris), 19,2 mM glycin och 20% metanol.
FÖRSIKTIGHET: Metanol är brandfarligt och bör förvaras inuti den brandfarliga flytande lagringen skåp. - Genomföra överföringen för 1 h vid 100 V i kylrummet.
- Blockera blot i 10 mL blockerande buffert innehållande 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween 20 och 5% fettfri mjölk för 1 h i rumstemperatur på en shaker.
- Inkubera blot med anti-HIF-1α antikropp (1/500 utspädning) i samma blockerande buffert över natten vid 4 ° C.
- Tvätta blot 3 gånger för 5 min varje gång med 50 mL TBS-T.
- Inkubera blot med pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp (1/1000 utspädning) i 10 mL TBS-T innehåller 5% fettfri torr mjölk för 1 h i rumstemperatur.
- Tvätta blot 3 gånger för 5 min varje gång med 50 mL TBS-T.
- Blanda 500 µL varje förbättrad chemilumescent (ECL) reagens A och B i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och vortex kort.
- Gälla blot ECL substratet och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur.
-
Fånga de Kemiluminiscens signaler med hjälp av en kostnad – tillsammans enhet (CCD) kamerabaserade imaging system.
- Dränera överflödig ECL substrat genom att röra vid kanten av membranet med en pappersnäsduk och placera membranet i en ark beskyddare.
- Placera membranet på prov facket av CCD kamera-baserat imaging system.
- Starta programvara bildbehandling (se Tabell av material) och fånga bilderna med följande inställningar: fil → nya protokoll → enda kanal protokollet inställningar → → Gel imaging (ansökan: Chemi; Imaging område: Bio-Rad klar gel; Imaging exponering: Programvaran automatiskt optimerar exponeringstiden för intensiv band) → kör protokoll
Obs: Exponeringstiden kan ställas in manuellt att uppnå de optimala bilderna.
4. Immunoprecipitation och detektion av Immunoprecipitated proteiner
- Tvätta 50 µL av protein A/G sepharose pärlor i 500 µL av TBS buffert i 1,5 mL mikrocentrifugrör och pellet pärlorna genom centrifugering vid 3 000 x g under 2 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pärlorna i 100 µL av TBS buffert.
- Tillsätt 2 µL mus monoklonal anti-ARNT antikropp (1,4 mg/mL) eller mus immunglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL) som förbereddes genom beredning 0,7 mg mus-IgG i 500 µL TBS buffert.
- Placera de 1,5 mL mikrocentrifugrör som innehåller pärlor i en tube rotator och inkubera i 2 h på 10 rpm i kylrummet.
Obs: Hantera rören försiktigt och hålla suspensionen innehåller pärlorna på botten av röret. - Pellet pärlorna genom centrifugering vid 3 000 x g under 2 minuter vid 4 ° C och kassera supernatanterna.
- Späd 200 µg av nukleära protein lysate erhålls i steg 2.6.5 i 800 µL IP-bufferten som består av 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20% glycerol, 0,2% NP-40 och 1 x proteashämmare cocktail. Inkubera den lysate med antikropp-kopplade pärlor erhölls i steg 4,5 över natten vid 4 ° C.
- Pellet pärlorna genom centrifugering vid 3 000 x g under 2 minuter vid 4 ° C, kassera supernatanterna och tvätta pärlor 3 gånger med 1 mL iskallt TBS som innehåller 0,2% NP-40.
- Koka pärlorna i 50 µL Laemmli prov buffert vid 95 ° C i 5 min.
- Centrifugera pärlor vid 10 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C, samla supernatanten och kasta pärlor.
Obs: Supernatanten kan lagras vid 4 ° C på kort sikt eller -20 ° C på lång sikt. - Detektering av HIF-1α från de immunoprecipitated proteinkomplex genom western blot som tidigare beskrivs i steg 3.3 och framåt.
Obs: Protein kvantifiering krävs inte för detta steg. Läsa in full volym (50 µL) av supernatanten av varje prov i varje brunn av en SDS-PAGE förtillverkade gradient geler (4 – 20%)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma den cellulära svaren på hypoxi, uttrycket nivåer och subcellulär lokalisering av komponenterna i HIF-1 komplexa följande hypoxi behandling undersöktes. HEK293A celler var odlade hypoxisk villkor för 4 h eller hålls på normoxia som kontroller. HIF-1α och ARNT proteinnivåer undersöktes i hela cellen eller kärn/cytoplasma extrakt genom western blot. Som förväntat, totala HIF-1α nivåer var uppreglerad av hypoxi, medan ARNT i totala cellular lysates inte var signifikant förändrad (figur 1A). Dessutom inducerad hypoxi nukleära ansamling av både HIF-1α och ARNT i HEK293A celler (figur 1B), vilket överensstämmer med tidigare rapporter, även om cytoplasmiska uttryck av ARNT inte påvisades i några av de testa cell linjer19.
Nästa, vi visat samspelet mellan HIF-1α och ARNT efter behandling med hypoxi. Nukleära extrakt var beredda från HEK293A celler utsätts för normoxic eller hypoxisk villkor för 4 h. Co-immunoprecipitation experiment utfördes med nukleära extrakt från HEK293A celler. Som visas i figur 2, var HIF-1α co-immunoprecipitated tillsammans med ARNT från kärntekniska extrakt av hypoxisk HEK293A celler.
Sammantaget protokollet beskrivs kan framgångsrikt användas att inducera en hypoxisk svar i celler och för att ytterligare fastställa fysiologiska Proteinbindningen av endogent uttryckt HIF-1α/ARNT komplex inom kärnan.
Figur 1: Reglering av proteinuttryck och subcellulär lokalisering av HIF-1 komponenter av hypoxi. (A) Immunoblot analys av totala HIF-1α eller ARNT uttryck i HEK293A celler. Cellerna var utsatt för hypoxi i 4 h (H) eller hålls på normoxia (N). Proteiner från hela-cell extrakt skildes av SDS-PAGE och analyseras av immunoblotting med anti-HIF-1α, anti-ARNT och anti glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) antikroppar. GAPDH användes som en lastning kontroll. (B) Immunoblot analys av HIF-1α och ARNT uttryck i subcellulär bråkdelar av HEK293A celler. HEK293A celler var odlade hypoxisk villkor för 4 h (H) eller hålls på normoxia (N). 25 µg av protein från kärn- eller cytoplasmisk extrakt analyserades av immunoblotting använder anti-HIF-1α, anti-ARNT, anti yin och yang 1 (YY1) och anti-GAPDH antikroppar. YY1 och GAPDH användes som laddar kontroller för kärn- och cytoplasmiska fraktioner, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: HIF-1α interagerar med ARNT hypoxisk villkor. HEK293A celler var utsatt för hypoxi i 4 h eller hålls på normoxia som kontroller. Nukleära extrakt från HEK293A celler var beredda och immunoprecipitations utfördes med en anti-ARNT antikropp. Nuclear extrakt (ingångar) och immunoprecipitated proteiner analyserades av immunoblotting använder anti-HIF-1α, anti-ARNT och anti-YY1 antikroppar. YY1 användes som lastning kontroll för ingångar medan IgG användes som den negativa kontrollen för co-immunoprecipitation experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Komponenter | Kommentarer |
| Dialys buffert | 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 20% glycerol, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF och 0,5 mM DTT | Lägga till PMSF och DTT omedelbart före användning. |
| Kör buffert | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glycin och 0,01% SDS | Blanda 100 mL 10 x Tris/glycin/SDS buffert med 900 mL ddH2O. |
| Överföra buffert | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glycin och 20% metanol | Blanda 100 mL 10 x Tris/glycin buffert med 200 mL metanol och 700 mL ddH2O. |
| TBS buffert | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) och 150 mM NaCl | Blanda 100 mL 10 x TBS buffert med 900 mL ddH2O. |
| TBS-T buffert | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl och 0,1% Tween-20 | Blanda 100 mL 10 x TBS buffert med 900 mL ddH2O och 1 mL Tween 20. |
| Blockerande buffert | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20 och 5% fettfri mjölk | Lös upp 5 g av Blotting-Grade Blocker i 100 mL TBS-T buffert. |
| IP-buffert | 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20% glycerol, 0,2% NP-40 och 1 x proteashämmare cocktail | Lägg till proteas hämmare cocktail omedelbart före användning. |
Tabell 1: Lösning beredning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HIF-1 komplexet är en mästare regulator av cellulära syre homeostas och reglerar en uppsjö av gener involverade i olika cellulära adaptiva svar till hypoxi. Identifiering av romanen HIF-1 samverkande proteiner är viktiga för förståelsen av hypoxisk signaltransduktion. Co-immunoprecipitation experiment används ofta för protonpumpshämmare studier för att avgränsa cellulära cellsmedierade reaktioner. Men protein överuttryck används fortfarande flitigt och detta kan leda till experimentella artefakter. Dessutom HIF-1α är ett mycket instabila protein och det blir snabbt försämrad under förnyad syresättning11. Dessutom utlöser hypoxi translokationen i cellkärnan av HIF-1 komponenter i mest däggdjur cellinjer. Därför har konventionella co-immunoprecipitation protokoll ska optimeras för identifiering av fysiologiskt relevanta HIF-1 samverkande proteiner efter behandling med hypoxi. Här beskriver vi ett modifierat co-immunoprecipitation protokoll som används för att påvisa samspelet mellan HIF-1α och ARNT vid hypoxi.
För att undvika nedbrytning av HIF-1α under förnyad syresättning, skördades hypoxisk cellerna inuti bearbetning kammare inkubator glovebox som var före jämviktas hypoxisk villkor. DPBS tvättbuffert var också jämviktas hypoxisk förhållanden före användning. Om det finns ingen hypoxi arbetsstation tillgängliga för bearbetning, kan hypoxisk cellerna tvättas med pre skakad hypoxisk DPBS och därefter skördas snabbt på isen. Med tanke på att hypoxi kan utlösa det nukleära translokationen av HIF-1 komponenter och att protein överuttryck kan inducera tingsliga resultat, användes endogena nukleära proteiner i detta protokoll. Användningen av kärnkraft extrakt i co-immunoprecipitation protokollet har också rapporterats av andra20. Det utgör en teknisk fördel för studier av interaktioner mellan nukleära proteiner, eftersom det minimerar risken för nukleära proteiner från späds ut av hela-cellproteiner. Dessutom kan användningen av kärnkraft extrakt vara till hjälp för minskning av icke-specifika interaktioner, särskilt från mycket riklig irrelevant cytoplasmatiska proteiner, och för förbättring av nukleära protein stabilitet genom att minimera exponeringen för proteaser i cytoplasman. Användning av endogent nuclear extrakt istället för hela cellen extrakt för den co-immunoprecipitation visar en betydande tekniska förbättringar, som vi kan endast upptäcka samspelet mellan HIF-1α och GABPα använder endogena nukleära extrakt men inte använder hela cell extrakt17.
I protokollet beskrivs kan flera villkor optimeras ytterligare för att förbättra resultaten. Vi inducerad hypoxi i HEK293A celler genom att behandla dem med 1% syre i 4 h. Syrehalten och varaktigheten av hypoxi behandling kan emellertid varierade för olika celltyper och justeras enligt syftet med studien. Exempelvis kan HIF-1α och HIF-2α differentially regleras av hypoxi i en cell typ särskilda sätt, som anger deras olika roller i olika biologiska sammanhang. Det har visat att i neuroblastomceller, HIF-1α är mest aktiva under korta perioder av intensiv hypoxi (1% O2), medan HIF-2α är också aktiv under lindrig hypoxi (5% O2) och blir mer aktiv efter kronisk hypoxi behandling (48-72 h hypoxisk exponering)21. 0 – 5% O2 nivåer som vanligen används för in vitro- hypoxi behandlingar, där 1 – 5% O2, 0,1 – 1% O2 och 0 – 0,1% O2 definieras ofta som lindrig hypoxi, syrebrist och anoxi, respektive22. Salt koncentration är en annan parameter som kräver optimering, särskilt eftersom det spelar en avgörande roll för Joniska interaktioner i protonpumpshämmare23. Nukleära extrakt användes i denna studie med de nukleära proteiner som vanligtvis utvinns med hjälp av en buffert som innehåller höga koncentrationer av salt. Extrakt av kärnvapen kanske därför vara desalted innan co-immunoprecipitation experimenten. Här, desalted vi nukleära extrakten använder en dialys buffert innehållande 100 mM KCl och blandat dialyzed extrakt med IP-bufferten innehåller 180 mM NaCl proportionellt för att uppnå en slutlig salt koncentration nära 150 mM, som är liknande till fysiologiska intracellulära protonpumpshämmare villkor. Den slutliga salt koncentrationen kan ändras beroende på egenskaperna hos protonpumpshämmarna sevärdheter. I detta protokoll användes GAPDH som lastning kontroll för hela cellen extrakt och cytoplasmiska fraktioner. Vi inte iaktta någon signifikant hypoxi-inducerad reglerande effekt på GAPDH uttryck i HEK293A celler. GAPDH har dock tidigare visat sig vara uppreglerad av hypoxi i vissa cell typer24. Med detta i åtanke, kan man behöva använda alternativa korrekt lastning kontroller vid behov25. Separat, observerat vi en betydande nivå av bakgrund signal följd antingen av pärlor eller antikroppar används i det nuvarande protokollet. För att minska bakgrunden, kan man förlänga tvätt stegen (10 – 15 min) eller utföra mer än 3 tvättar (5 – 10 gånger). Alternativt kan jonstyrka tvättlösning också ökas genom titrering Saltkoncentrationen från 150 till 500 mM under tvättar. Lysates kan också raderas före genom inkubation med protein A/G sepharose pärlor för 1 h vid 4 ° C med rotation.
Detta protokoll är begränsad till nukleära extrakt och som sådan kanske inte är lämplig för studier av protonpumpshämmare inom andra cellulära fack såsom mitokondrier och endoplasmatiska retiklet. Liknar andra konventionella co-immunoprecipitation protokoll, denna metod kan inte användas att studera protonpumpshämmare i realtid eller att avgöra om protonpumpshämmarna är direkt eller indirekt.
I sammanfattning ger vi en modifierad co-immunoprecipitation protokoll för identifiering av romanen fysiologiskt relevanta HIF-1 samverkande proteiner. Detta protokoll är också lämplig för studier av samspelet mellan transkriptionsfaktorer och transkriptionell samtidig regulatorer hypoxisk villkor. Trots detta protokoll är utformat specifikt för co-immunoprecipitation experiment hypoxi villkor, kan en del av protokollet beskrivs för normoxia kontroll cellerna också användas att studera de nukleära protonpumpshämmarna under normoxia förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar Assoc. Prof. synd Tiong Ong för användning av hypoxi arbetsstationen. Detta arbete stöds av följande: Singapore undervisningsministeriet, MOE 1T1-02/04 och MOE2015-T2-2-087 (att Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University startpeng M4230003 (till P.O.B.), Vetenskapsrådet, den Familjen Erling-Perssons Stiftelse, Stiftelsen Novo Nordisk, Stichting af Jochnick Foundation, den svenska Diabetesförbundet, Scandia försäkringsbolaget, diabetesforskning och Wellnesss kaj von Kantzow stiftelse, den Strategiska forskningsprogrammet i Diabetes vid Karolinska Institutet, det Europeiska forskningsrådet ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, och Knut och Alice Wallenbergs stiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H.
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
