Summary
Qui descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare le interazioni proteina-proteina tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. Questo metodo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali all'ipossia.
Abstract
Bassi livelli di ossigeno (ipossia) innescano una serie di risposte adattative con il Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) che agisce come un regolatore matrice complessa. HIF-1 è costituito da una subunità α ossigeno-regolato di heterodimeric (HIF-1 α) e costitutivamente espresso subunità β (HIF-1 β) noto anche come arilico dell'idrocarburo del recettore nucleare translocator (ARNT), regolazione di geni coinvolti in diversi processi tra cui l'angiogenesi , eritropoiesi e glicolisi. L'identificazione di proteine interagenti HIF-1 è la chiave per la comprensione dell'ipossia via di segnalazione. Oltre alla regolazione della stabilità di HIF-1 α, ipossia attiva inoltre la traslocazione nucleare di molti fattori di trascrizione tra cui HIF-1 α e ARNT. In particolare, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per lo studio di tali interazioni proteina-proteina (PPIs) sono basata su sistemi dove i livelli della proteina sono aumentati artificialmente attraverso la sovraespressione della proteina. Sovraespressione di proteine spesso porta a risultati non-fisiologica derivanti dagli elementi spaziali e temporali. Qui descriviamo una co-immunoprecipitazione modificata a seguito del trattamento di ipossia utilizzando proteine nucleari endogene e come un proof of concept, per mostrare l'interazione tra HIF-1 α e ARNT di protocollo. In questo protocollo, le cellule ipossiche sono state raccolte in condizioni ipossiche e tampone di lavaggio di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) era anche pre-equilibrato a condizioni di ipossia prima dell'uso per mitigare la degradazione della proteina o proteina complessa dissociazione durante la riossigenazione. Inoltre, le frazioni nucleari sono stati successivamente estratti per concentrare e stabilizzare le proteine nucleari endogene ed evitare possibili risultati spuri spesso visto durante la sovraespressione della proteina. Questo protocollo consente di dimostrare endogeni e nativi di interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia.
Introduction
L'ipossia si verifica quando viene fornito ossigeno insufficiente di cellule e tessuti del corpo. Esso svolge un ruolo critico in vari processi fisiologici e patologici, quali il differenziamento di cellule staminali, infiammazione e cancro1,2. Fattori inducibili dall'ipossia (HIFs) fungono da eterodimeri composto di una subunità α ossigeno-regolato e una subunità β costitutivamente espressa anche conosciuto come ARNT3. Tre isoforme della subunità HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3 α) e tre subunità HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) sono state identificate fino ad oggi. HIF-1 α e ARNT sono espresso ubiquitariamente, considerando che HIF-2α, HIF-3 α, ARNT2 e ARNT3 hanno limitato più espressione modelli4. Il complesso della proteina HIF-1 è il regolatore chiave della risposta ipossia. In condizioni di ipossia HIF-1 α diventa stabilizzato, poi trasloca nel nucleo e dimerizza con ARNT5. Successivamente, questo complesso si lega a specifici nucleotidi conosciuti come elementi reattivi di ipossia (HREs) e regola l'espressione di geni bersaglio coinvolti in diversi processi tra cui l'angiogenesi, eritropoiesi e glicolisi6. Oltre a questa risposta "canonica", la via di segnalazione di ipossia è noto anche per diafonia con risposta cellulare più vie come tacca e nucleare della fattore-kappa B (NF-κB) di segnalazione7,8,9.
L'identificazione delle proteine interagenti romanzo HIF-1 è importante per una migliore comprensione dell'ipossia via di segnalazione. In contrasto con ARNT, che è insensibile ai livelli di ossigeno e costitutivamente espressa, i livelli della proteina HIF-1 α sono strettamente regolati dai livelli di ossigeno cellulare. Al normoxia (21% di ossigeno), proteine di HIF-1 α sono rapidamente degradata10,11. La breve emivita di HIF-1 α al normoxia presenta sfide tecniche specifiche per la rilevazione della proteina da estratti cellulari, così come per l'identificazione di proteine che interagiscono HIF-1 α. Inoltre, diversi fattori di trascrizione, compresi quelli del complesso HIF-1 traslocano nel nucleo sotto condizioni di ipossia12,13,14. La maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per studi di PPI sono eseguita usando non-fisiologica iperespressione delle proteine. Tale sovraespressione della proteina è stata segnalata per causare difetti cellulari differenti attraverso i meccanismi multipli compreso sovraccarico delle risorse, squilibrio stechiometrico, interazioni promiscue e via modulazione15,16. In termini di studi PPI, sovraespressione della proteina può portare a falsi negativi positivi, o addirittura falsi, risultati a seconda delle proprietà della proteina e le funzioni delle proteine overexpressed. Pertanto, i metodi attuali per gli studi di PPI necessario essere modificato al fine di rivelare la PPIs fisiologicamente rilevanti in condizioni ipossiche. Precedentemente abbiamo dimostrato l'interazione tra HIF-1 e il fattore di trascrizione famiglia Ets GA-legante della proteina (GABP) in cellule P19 hypoxic, che contribuisce alla risposta del promotore Hes1 a ipossia17. Qui, descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare PPIs tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. L'interazione tra HIF-1 α e ARNT è mostrato come un proof of concept. Questo protocollo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia, compresi ma non limitati all'identificazione di proteine interagenti HIF-1.
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Protocol
In questa sezione del protocollo, che utilizza 293A embrionali umane del rene (HEK293A) cella, s segue le linee guida del comitato etico di ricerca umana a Nanyang Technological University, Singapore.
1. induzione di ipossia in cellule di HEK293A
- Preparare quattro piatti di 10cm e semi di 3 – 5 x 106 HEK293A cellule per piatto in 10 mL Dulbecco per volta medium dell'Aquila (DMEM, glucosio di 4,5 g/L) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, 110 mg/L sodio piruvato, 100 U/mL di penicillina e 100 mg / mL di streptomicina. Coltura le cellule in un 37 ° C, 5% CO2 incubator.
Nota: Cella semina deve essere effettuata in una cappa di sicurezza biologica (BSC). Le superfici di tutti i materiali ad essere messi in BSC dovrebbero essere cancellate con etanolo al 70%. - 24 h dopo la semina, quando le cellule hanno raggiunto l'80 – 90% confluency, mettere due piatti nel subchamber di ipossia nel vano portaoggetti incubatore (Vedi Tabella materiali) con 1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C e tenere gli altri due piatti al normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) per 4 h. utilizzare un insieme di condizioni di normossia e cellule ipossiche per valutare il trattamento di ipossia mediante western blot e utilizzare l'altro set di celle per gli esperimenti di co-immunoprecipitazione.
Nota: I livelli di ossigeno possono essere impostati a 0 – 5% e la durata del trattamento ipossia può essere variata a seconda del tipo di cella e obiettivo di studio.
2. intera cellula ed estrazione nucleare
Nota: Vedi tabella 1 per informazioni sui buffer utilizzata nel presente protocollo.
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Raccogliere le cellule di controllo normoxia.
- Rimuovere il supporto di cultura dall'aspirazione e lavare le cellule con 10 mL di DPBS (PH 7.0-7.2) usando una pipetta da 10 mL.
Nota: Evitare di toccare il monostrato cellulare con la pipetta. Durante il lavaggio, pipettare delicatamente DPBS abbattendo il muro della piastra di coltura cellulare per evitare la perdita delle cellule. - Pipettare 5 mL DPBS ghiacciata nella piastra e raschiare le cellule sulla superficie della piastra in PBS ghiacciata con un raschietto di cella.
- Trasferire la sospensione cellulare in provette coniche da 15 mL e tenere sul ghiaccio.
- Rimuovere il supporto di cultura dall'aspirazione e lavare le cellule con 10 mL di DPBS (PH 7.0-7.2) usando una pipetta da 10 mL.
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Raccogliere le cellule coltivate in condizioni di ipossia.
- Pre-equilibrare il DPBS a condizioni ipossiche inserendo un flacone di reagente di vetro dall'esperimento di 00ml scoperti 1riempito con DPBS nel subchamber di ipossia (1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C) per 24 ore in anticipo.
- Circa 1 h prima della raccolta delle cellule di ipossia trattato, posizionare una scatola di ghiaccio contenente ghiaccio nella camera di lavorazione del vano portaoggetti, che è stato equilibrato al 1% O2 e 5% CO2. Trasferire il flacone contenente il pre-equilibrato DPBS ipossica dalla subchamber di ipossia a camera di lavorazione e posizionarlo sul ghiaccio.
- 4 h dopo il trattamento di ipossia, trasferire le cellule dalla subchamber di ipossia nella camera di trattamento che è stato pre-equilibrato al 1% O2 e 5% CO2.
- Rimuovere il supporto di cultura dall'aspirazione e sciacquare le cellule una volta con 10 mL Pipettare ghiacciata DPBS hypoxic pre-equilibrato con un 10 mL.
- Aggiungere 5 mL DPBS ghiacciata pre-equilibrato con un 5 mL Pipettare e sloggiare le cellule da raschiare con un raschietto di cella.
- Inclinare la piastra di coltura delle cellule e raccogliere le cellule indipendente utilizzando una pipetta da 10 mL. Trasferire la sospensione cellulare in DPBS in provette coniche da 15 mL e tenere sul ghiaccio.
- Aprire la porta tra le camere elaborazione e buffer del vano portaoggetti, entrambi i quali sono stati pre-equilibrati per 1% O2 e 5% CO2. Trasferire le provette coniche da 15 mL sul ghiaccio che contengono le cellule di ipossia trattato dalla camera di elaborazione per l'alloggiamento di buffer. Aprire la porta della camera del tampone e rimuovere completamente le cellule dal vano portaoggetti.
- Pellet sia le cellule normossiche da 2.1 e le cellule ipossiche da 2.2 mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C.
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Preparare l'intera cellula estratti.
- Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone di lisi di gelida radio immunoprecipitazione assay (RIPA) contenente 50 mM pH Trisaminomethane cloridrato (Tris-HCl) 8.0, 150 mM di cloruro di sodio (NaCl), 1% tergitol-tipo NP-40 (NP-40), 0,5% sodio desossicolato, e 0.1% sodio dodecil solfato (SDS), completato con 1 x cocktail di inibitore della proteasi (Vedi Tabella materiali) pipettando il pellet cellulare su e giù più volte.
- Trasferire i lisati cellulari in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 mL e tenere il ghiaccio per 30 min con occasionali Vortex.
- Centrifugare i lisati cellulari a 13.000 x g per 10 min a 4 ° C.
- Raccogliere il surnatante, aliquotare 50 µ l del surnatante in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.
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Preparare gli estratti nucleari utilizzando un'estrazione nucleare kit (Vedi tabella materiali).
- Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 500 µ l di NL di buffer di lisi completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi e 0,1 M ditiotreitolo (DTT) pipettando il pellet cellulare su e giù più volte.
- Aggiungere 25 µ l di soluzione detergente NP alla sospensione cellulare e vortexare per 10 s a velocità massima.
- Centrifuga a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C.
- Raccogliere il surnatante (estratti citoplasmatici), aliquotare 50 µ l del surnatante in provette microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.
- Risospendere il pellet contenente nuclei delle cellule in 500 µ l di tampone di lisi NL completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi e 0,1 M DTT nel Vortex per 5 s alla velocità massima.
- Centrifugare a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C e salvare la pallina nucleare.
- Risospendere il pellet nucleare in 50 µ l di estrazione Buffer NX1 completati con 1 x cocktail di inibitore della proteasi pipettando il pellet su e giù più volte.
- Incubare per 30 min su ghiaccio, su vortex per 10 s ogni 5 min alla massima velocità.
- Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C.
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Desalificare estratti nucleari.
- Raccogliere il surnatante da passo 2.5.9 e trasferire nelle periferiche mini dialisi con un volume massimo di 100 µ l per unità.
- I dispositivi mini dialisi di Cap e metterli in un dispositivo di galleggiamento.
- Mettere il dispositivo di galleggiamento in un becher contenente 500 mL di tampone di dialisi pre-refrigerati (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20% glicerolo, 100 mM di cloruro di potassio (KCl), 0,2 mM acido etilendiamminotetracetico (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e 0,5 mM DTT) ed incubare per 30 min a 4 ° C con agitazione delicata.
Attenzione: PMSF è pericoloso. Evitare il contatto diretto con la pelle o per inalazione. - Raccogliere i campioni dall'angolo dei dispositivi mini dialisi e trasferire nella nuova per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C, aliquota 25 µ l di ogni surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e conservare a-80 ° C.
3. valutazione del trattamento ipossia tramite rilevazione dell'espressione della proteina e localizzazione subcellulare di HIF-1 α
- Determinare la concentrazione nella proteina della cellula intera o nucleare/citoplasmico estratti facendo uso dell'analisi di un kit di dosaggio acido (BCA) proteina bicinconinico secondo istruzioni18 del produttoremicropiastre.
- Diluire i lisati cellulari in 1 x Laemmli tampone contenente 5% 2-mercaptoetanolo e bollire a 95 ° C per 5 min.
Attenzione: Non toccare la superficie del blocco riscaldante, poiché può provocare ustioni. -
Separare le proteine elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE).
- Caricare uguali quantità di proteina (25 µ g) in ciascun pozzetto di un gel di SDS-PAGE prefabbricati di gradiente (4 – 20%), insieme a 3 µ l di marcatore di peso molecolare.
- Esegua il gel in tampone contenente 2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS, PH8.3 per 30 min a 200 V di corsa.
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Trasferire le proteine dal gel alla membrana di nitrocellulosa.
- Montare il panino di trasferimento (carta da filtro-gel-membrana-filtro di carta) con il gel sul lato anodo e la membrana sul lato catodo della cassetta.
- Inserire la cassetta nel trasferimento serbatoio riempito con tampone di trasferimento contenente 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM e 20% metanolo.
Attenzione: Metanolo è infiammabile e deve essere conservato all'interno l'armadietto di immagazzinaggio liquido infiammabile. - Effettuare il trasferimento per 1 h a 100 V in camera fredda.
- Bloccare la macchia nel tampone di bloccaggio da 10 mL contenente 50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween 20 e 5% senza grassi del latte per 1 h a temperatura ambiente in un agitatore.
- Incubare la macchia con l'anticorpo anti-HIF-1 α (diluizione 1/500) nello stesso tampone bloccante durante la notte a 4 ° C.
- Lavare la macchia 3 volte per 5 min ogni volta con 50 mL di TBS-T.
- Incubare la macchia con perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo secondario coniugato (diluizione 1/1.000) in 10 mL TBS-T contenente 5% non-grasso di latte secco per 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare la macchia 3 volte per 5 min ogni volta con 50 mL di TBS-T.
- Mix 500 µ l ciascuna di chemilumescent avanzata (ECL) Reagente A e B in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e agitare brevemente.
- Applicare il substrato di ECL il blot e incubare per 1 min a temperatura ambiente.
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Catturare i segnali a chemiluminescenza utilizzando un charge coupled device (CCD) sistema di imaging basata su videocamera.
- Scolare in eccesso substrato ECL toccando il bordo della membrana con una velina e posizionare la membrana in un foglio di protezione.
- Posizionare la membrana sul vassoio campione del CCD sistema di imaging basata su videocamera.
- Lanciare il software di elaborazione immagine (Vedi Tabella materiali) e catturare le immagini con le seguenti impostazioni: File → nuovo protocollo → monocanale → Protocol Setup → Gel imaging (applicazione: Chemi; Area Imaging: Gel pronto Bio-Rad; Imaging dell'esposizione: Il software automaticamente consente di ottimizzare il tempo di esposizione per bande intensi) protocollo di esecuzione →
Nota: E ' possibile impostare manualmente il tempo di esposizione, per ottenere immagini ottimali.
4. immunoprecipitazione e rilevamento delle proteine immunoprecipitati
- Lavare 50 µ l di perle di proteina A/G sepharose in 500 µ l di tampone TBS in provette per microcentrifuga da 1,5 mL e pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C.
- Eliminare il supernatante e risospendere le sfere in 100 µ l di tampone TBS.
- Aggiungere 2 µ l di anticorpo monoclonale anti-ARNT (1,4 mg/mL) o il mouse dell'immunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) che è stato preparato mediante ricostituzione IgG di topo di 0,7 mg in 500 µ l di tampone TBS.
- Collocare la microcentrifuga da 1,5 mL contenente microsfere in un rotatore del tubo ed incubare per 2 ore a 10 giri/min in camera fredda.
Nota: Maneggiare i tubi delicatamente e tenere la sospensione contenente le perline nella parte inferiore del tubo. - A pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C ed eliminare i sovranatante.
- Diluire 200 µ g della proteina nucleare lisato ottenuto nel passaggio 2.6.5 in 800 µ l di buffer IP composto da 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glicerolo, inibitore di proteasi di 0,2% NP-40 e 1 x cocktail. Incubare il lisato con i branelli accoppiati anticorpi ottenuti nel passaggio 4.5 durante la notte a 4 ° C.
- A pellet le perline mediante centrifugazione a 3.000 x g per 2 min a 4 ° C, eliminare i sovranatante e lavare le perle 3 volte con 1 mL ghiacciata TBS contenente 0,2% NP-40.
- Cuocere le perline in 50 µ l tampone di Laemmli campione a 95 ° C per 5 min.
- Centrifugare le perline a 10.000 x g per 5 min a 4 ° C, raccogliere il surnatante e scartare le perline.
Nota: Il surnatante possa essere memorizzato a 4 ° C per breve periodo o a-20 ° C per il lungo termine. - Rilevare la presenza di HIF-1 α dai complessi proteina immunoprecipitata con western blot come precedentemente descritto nel passaggio 3.3 in poi.
Nota: Quantificazione della proteina non è necessaria per questo passaggio. Caricare tutto volume (50 µ l) del surnatante di ogni campione in ciascun pozzetto di un gel di SDS-PAGE prefabbricati di gradiente (4 – 20%)
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Representative Results
Per valutare la risposta cellulare all'ipossia, l'espressione sono stati esaminati i livelli e localizzazione subcellulare delle componenti del trattamento seguente complesso di ipossia HIF-1. HEK293A cellule sono state coltivate in condizioni di ipossia per 4 h o tenuti a normoxia come controlli. Livelli della proteina HIF-1 α e ARNT sono stati esaminati in cellule intere o nucleare/citoplasmico estratti mediante western blot. Come previsti, totali livelli di HIF-1 α sono stati aumentati da ipossia, mentre i livelli ARNT in totale lisati cellulari non erano significativamente alterata (Figura 1A). Inoltre, l'ipossia indotta accumulo nucleare di HIF-1 α e ARNT in HEK293A cellule (Figura 1B), che è coerente con i rapporti precedenti, anche se l'espressione citoplasmica di ARNT non è stato rilevato in alcune linee cellulari testati19.
Successivamente, abbiamo dimostrato l'interazione tra HIF-1 α e ARNT dopo il trattamento di ipossia. Gli estratti nucleari sono stati preparati da HEK293A le cellule esposte a condizioni di normossia o condizioni di ipossia per esperimenti di 4 h. Co-immunoprecipitazione sono state effettuate usando gli estratti nucleari dalle cellule HEK293A. Come illustrato nella Figura 2, HIF-1 α è stato co-immunoprecipitate con ARNT da estratti nucleari di cellule ipossiche HEK293A.
Presi insieme, il protocollo descritto può essere usato con successo per indurre una risposta ipossica in cellule e per determinare ulteriormente il legame con le proteine fisiologiche di endogenamente espresso complessi di HIF-1 α/ARNT all'interno del nucleo.
Figura 1: Regolamento di espressione della proteina e localizzazione subcellulare di HIF-1 componenti da ipossia. (A) l'analisi di Immunoblot di espressione di HIF-1 α o ARNT totale nelle cellule HEK293A. Le cellule sono state esposte a ipossia per 4 h (H) o tenute a normoxia (N). Proteine da estratti di cellule intere sono state separate da SDS-PAGE e analizzate dall'immunoblotting con anti-HIF-1 α, anti-ARNT e gli anticorpi anti-gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). GAPDH è stato usato come un controllo di carico. (B) l'analisi di Immunoblot di espressione di HIF-1 α e ARNT in frazioni subcellulari delle cellule HEK293A. HEK293A cellule sono state coltivate in condizioni di ipossia per 4 h (H) o tenuti a normoxia (N). 25 µ g di proteina da estratti nucleari o citoplasmatici sono stati analizzati dall'immunoblotting utilizzando anti-HIF-1 α, anti-ARNT, anti-yin e yang 1 (YY1) e gli anticorpi anti-GAPDH. YY1 e GAPDH sono stati utilizzati come caricare i controlli per le frazioni nucleari e citoplasmatici, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: HIF-1 α interagisce con ARNT in condizioni ipossiche. Le cellule HEK293A sono stati esposti ad ipossia per 4 h o tenute a normoxia come controlli. Gli estratti nucleari dalle cellule HEK293A sono stati preparati e immunoprecipitati sono stati eseguiti utilizzando un anticorpo anti-ARNT. Estratti nucleari (ingressi) e immunoprecipitati proteine sono stati analizzati dall'immunoblotting usando gli anticorpi anti-HIF-1 α, anti-ARNT e anti-YY1. YY1 è stato utilizzato come un controllo di carico per gli ingressi, mentre IgG è stato usato come controllo negativo per gli esperimenti di co-immunoprecipitazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione | Componenti | Commenti |
| Buffer di dialisi | 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 20% glicerolo, 100 mM KCl, EDTA 0,2 mM, 0,2 mM PMSF e 0,5 mM DTT | Aggiungere PMSF e DTT immediatamente prima dell'uso. |
| Buffer in esecuzione | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8.3), 19,2 mM glicina e 0,01% SDS | Miscelare 100 mL 10 x tampone Tris/glicina/SDS con 900 mL ddH2O. |
| Buffer di trasferimento | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8.3), glicina 19,2 mM e 20% metanolo | Miscelare 100 mL 10 x tampone Tris/glicina con 200 mL di metanolo e 700 mL ddH2O. |
| Buffer di TBS | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) e NaCl 150 mM | Mescolare 100 mL 10 x TBS di tampone con 900 mL ddH2O. |
| Buffer di TBS-T | 50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl e 0.1% Tween 20 | Mix 100 mL 10 x TBS tampone con 900 mL ddH2O e 1 mL di Tween 20. |
| Tampone di bloccaggio | 50 mM Tris-Cl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20 e 5% senza grassi del latte | Sciogliere 5 g di assorbente-Grade Blocker in TBS-T di 100 mL di tampone. |
| Buffer di IP | 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glicerolo, inibitore di proteasi di 0,2% NP-40 e 1 x cocktail | Aggiungere cocktail di inibitore di proteasi immediatamente prima dell'uso. |
Tabella 1: Preparazione di soluzione.
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Discussion
Il complesso di HIF-1 è un regolatore dell'omeostasi dell'ossigeno cellulare e regola una pletora di geni coinvolti in diverse risposte adattative cellulari all'ipossia. Identificazione di nuove proteine interagenti di HIF-1 è importante per la comprensione della trasduzione del segnale ipossico. Esperimenti di co-immunoprecipitazione comunemente utilizzati per studi di PPIs per delineare vie di trasduzione del segnale cellulare. Tuttavia, la sovraespressione di proteina è ancora ampiamente usata e questo può portare ad artefatti sperimentali. Inoltre, HIF-1 α è una proteina altamente instabile e diventa rapidamente degradata durante la riossigenazione11. Inoltre, l'ipossia attiva traslocazione nucleare di componenti di HIF-1 in linee cellulari di mammifero più. Pertanto, protocolli convenzionali di co-immunoprecipitazione devono essere ottimizzato per l'identificazione di HIF-1 fisiologicamente rilevanti proteine interagenti dopo il trattamento di ipossia. Qui, descriviamo un protocollo modificato co-immunoprecipitazione che viene utilizzato per illustrare l'interazione tra HIF-1 α e ARNT in ipossia.
Per evitare la degradazione di HIF-1 α durante la riossigenazione, le cellule ipossiche sono state raccolte all'interno della camera di trattamento della guantiera di incubatore che era pre-equilibrato a condizioni di ipossia. Il tampone di lavaggio DPBS era equilibrato anche a condizioni di ipossia prima dell'uso. Se non c'è nessuna workstation di ipossia disponibile per l'elaborazione, le cellule ipossiche possono essere lavate con DPBS hypoxic pre-equilibrato e successivamente raccolto rapidamente sul ghiaccio. Considerando che l'ipossia può innescare la traslocazione nucleare di componenti di HIF-1 e che la sovraespressione della proteina può indurre risultati artefactual, proteine endogene nucleari sono state utilizzate in questo protocollo. L'uso di estratti nucleari nel protocollo di co-immunoprecipitazione inoltre è stato segnalato da altri20. Rappresenta un vantaggio tecnico per lo studio delle interazioni tra proteine nucleari, perché riduce al minimo la possibilità di proteine nucleari da essere diluito da cellule intere proteine. Inoltre, l'uso di estratti nucleari può essere utile per la riduzione delle interazioni aspecifiche, soprattutto da altamente abbondanti proteine citoplasmatiche irrilevante e per il miglioramento della stabilità della proteina nucleare riducendo al minimo l'esposizione a proteasi presente nel citoplasma. L'uso di estratti nucleari endogeni invece di estratti di cellule intere per la co-immunoprecipitazione Mostra un significativo miglioramento tecnico, come possiamo rilevare solo l'interazione tra HIF-1 α e GABPα endogeni estratti nucleari ma senza usare tutta la 17estratti cellulari.
Nel protocollo descritto, diverse condizioni possono essere ulteriormente ottimizzate per migliorare i risultati. Abbiamo indotto ipossia in HEK293A cellule trattandole con 1% di ossigeno per 4 h. Tuttavia i livelli di ossigeno e la durata del trattamento ipossia può essere variati per diversi tipi di cellule e regolate secondo le finalità dello studio. Per esempio, HIF-1 α e HIF-2α può essere differenzialmente regolata dall'ipossia in modo specifico tipo cellulare, indicando loro ruoli distinti in diversi contesti biologici. È stato dimostrato che in cellule di neuroblastoma, HIF-1 α è più attivo durante brevi periodi di intensa ipossia (1% O2), mentre HIF-2α è inoltre attiva nell'ambito di ipossia lieve (5% O2) e diventa più attivo dopo il trattamento (48-72 h di ipossia cronica l'esposizione hypoxic)21. 0 – 5% O2 livelli sono comunemente utilizzati per i trattamenti di ipossia in vitro , dove 1 – 5% O2, 0,1 – 1% O2 e 0-0,1% O2 vengono spesso definiti come lieve ipossia, ipossia e anossia, rispettivamente22. Concentrazione di sale è un altro parametro che richiede l'ottimizzazione, soprattutto perché essa svolge un ruolo critico per le interazioni ioniche in PPIs23. Gli estratti nucleari sono stati utilizzati in questo studio con le proteine nucleari di solito estratti utilizzando un buffer contenente alte concentrazioni di sale. Di conseguenza, estratti nucleari potrebbero essere necessario essere dissalato prima gli esperimenti di co-immunoprecipitazione. Qui, abbiamo dissalato estratti nucleari utilizzando un buffer di dialisi contenenti 100 mM KCl e mescolato gli estratti dializzati con il buffer IP contenente 180 mM NaCl proporzionalmente per ottenere una concentrazione finale di sale nei pressi di 150 mM, che è simile al fisiologico condizioni di PPIs intracellulare. La concentrazione finale di sale può essere modificata a seconda delle proprietà degli IPP di interesse. In questo protocollo, GAPDH è stato utilizzato come un controllo di carico per tutta la cella estratti e le frazioni citoplasmiche. Non abbiamo osservato alcun effetto normativo indotta da ipossia significativo sull'espressione di GAPDH in cellule HEK293A. Tuttavia, GAPDH ha precedentemente dimostrato di essere upregulated da ipossia in alcuni tipi di cella24. Con questo in mente, uno potrebbe essere necessario utilizzare controlli alternativi caricamento corretto quando necessario25. Separatamente, abbiamo osservato un notevole livello di sfondo derivanti da perline o anticorpi utilizzati nel protocollo corrente del segnale. Per ridurre lo sfondo, uno può prolungare la procedura di lavaggio (10 – 15 min) o eseguire più di 3 lavaggi (5 – 10 volte). In alternativa, la forza ionica del tampone di lavaggio può essere aumentata anche dalla titolazione la concentrazione di sale da 150 a 500 mM durante i lavaggi. I lisati possono anche essere pre-cancellati incubando con proteina A/G sepharose perline per 1 h a 4 ° C con rotazione.
Questo protocollo è limitato a estratti nucleari e come tale potrebbe non essere adatto per lo studio degli IPP all'interno di altri compartimenti cellulari come i mitocondri e il reticolo endoplasmatico. Simile ad altri protocolli convenzionali di co-immunoprecipitazione, questo metodo non può essere utilizzato per studiare PPIs in tempo reale o per determinare se i PPI sono diretti o indiretti.
In sintesi, forniamo un protocollo modificato co-immunoprecipitazione per l'identificazione di nuove proteine interagenti fisiologicamente rilevanti di HIF-1. Questo protocollo è anche adatto per lo studio delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia. Anche se questo protocollo è progettato specificamente per gli esperimenti di co-immunoprecipitazione in condizioni di ipossia, una parte del protocollo descritto per le cellule di controllo normoxia utilizzabile anche per studiare la PPIs nucleare in normoxia condizioni.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo Assoc. Prof. ssa Sin Tiong Ong per l'utilizzo della workstation ipossia. Questo lavoro è stato supportato dal testo seguente: Singapore Ministry of Education, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (a Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University avviamento sovvenzione M4230003 (p.o.b.), il Consiglio svedese della ricerca, il Famiglia Erling Persson Foundation, la Fondazione di Novo Nordisk, l'af di Stichting Jochnick Foundation, l'associazione svedese di diabete, la compagnia di assicurazione di Scandia, la ricerca sul diabete e Wellness Foundation, Fondazione di ormeggio von Kantzow, il Programma di ricerca strategico nel diabete al Karolinska Institutet, l'ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e Knut e Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
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