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Biology

Essai de co-immunoprécipitation des protéines nucléaires endogènes de cellules cultivées dans des Conditions hypoxiques

Published: August 2, 2018 doi: 10.3791/57836
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 4, 5, 3, 1,2,3, 1,2
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

Summary

Nous décrivons ici un protocole co-immunoprécipitation pour étudier les interactions protéine-protéine entre les protéines nucléaires endogènes dans des conditions hypoxiques. Cette méthode convient pour la démonstration des interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels à l’hypoxie.

Abstract

Faibles teneurs en oxygène (hypoxie) déclenchent une variété de réponses adaptatives avec le Hypoxia-inducible factor complexe agissant comme un maître régulateur 1 (HIF-1). HIF-1 se compose d’une sous-unité α oxygène régulée des hétérodimères (HIF-1 bis) et exprimé constitutivement sous-unité β (HIF-1β) également connu sous le nom aryl hydrocarbon receptor nucléaire translocator (ARNT), régulation des gènes impliqués dans divers processus, y compris l’angiogenèse , l’érythropoïèse et la glycolyse. L’identification des protéines qui interagissent HIF-1 est essentielle à la compréhension de la voie de signalisation de l’hypoxie. Sans compter que la régulation de la stabilité de l’HIF-1α, hypoxie déclenche également la translocation nucléaire de nombreux facteurs de transcription dont HIF-1α et ARNT. Notamment, la plupart des méthodes actuelles utilisées pour étudier ces interactions protéine-protéine (IPP) sont basés sur les systèmes où les taux de protéines sont artificiellement augmentés par la surexpression de la protéine. Surexpression de la protéine souvent conduit à des résultats non physiologiques dus aux artefacts temporelles et spatiales. Nous décrivons ici une co-immunoprécipitation mis à jour le protocole après le traitement de l’hypoxie en utilisant des protéines nucléaires endogènes et comme une preuve de concept, de montrer l’interaction entre HIF-1α et ARNT. Dans le présent protocole, les cellules hypoxiques ont été récoltés dans des conditions hypoxiques et tampon de lavage de la Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (SPD) a également été préalablement équilibré à des conditions hypoxiques avant son utilisation afin d’atténuer la dégradation des protéines ou complexes de protéines dissociation durant la réoxygénation. En outre, les fractions nucléaires ont été par la suite extraites de façon à se concentrer et de stabiliser les protéines nucléaires endogènes et d’éviter de possibles résultats fallacieux souvent vu au cours de la surexpression de la protéine. Ce protocole peut être utilisé pour démontrer endogènes et natives des interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels dans des conditions hypoxiques.

Introduction

L’hypoxie se produit lorsque l’oxygène insuffisant est fournie pour les cellules et les tissus du corps. Il joue un rôle critique dans divers processus physiologiques et pathologiques tels que la différenciation des cellules souches, l’inflammation et le cancer1,2. Facteurs inductibles par l’hypoxie (HIFs) fonctionnent comme des hétérodimères composé d’une sous-unité α réglementés d’oxygène et une sous-unité β constitutivement exprimé également connu sous le nom de ARNT3. Trois isoformes des sous-unités HIF-α (HIF-1α, HIF-2α et HIF-3α) et trois sous-unités β HIF (ARNT/HIF-1β, ARNT2 et ARNT3) ont été identifiées à ce jour. HIF-1α et ARNT sont exprimés ubiquitaire, alors que HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 et ARNT3 ont plus restreinte de modèles expression4. La complexe de la protéine HIF-1 est le régulateur essentiel de la réponse de l’hypoxie. Dans des conditions hypoxiques, HIF-1α devient stabilisé, puis translocation vers le noyau et se dimérise avec ARNT5. Par la suite, ce complexe se lie à des nucléotides spécifiques appelés éléments sensibles de l’hypoxie (HREs) et régule l’expression de gènes cibles impliqués dans divers processus, y compris de l’angiogenèse, l’érythropoïèse et la glycolyse6. En plus de cette réponse « canonique », la voie de signalisation de l’hypoxie est également connue pour la diaphonie avec plusieurs réponse cellulaire signalisation tels que Notch et nucléaire facteur-kappa B (NF-κB)7,8,,9.

L’identification des protéines qui interagissent roman HIF-1 est importante pour une meilleure compréhension de la voie de signalisation de l’hypoxie. Contrairement à l’ARNT, ce qui est insensible aux niveaux d’oxygène et constitutivement exprimé, des niveaux de protéine HIF-1α sont étroitement contrôlée par les niveaux d’oxygène cellulaire. À la normoxie (21 % d’oxygène), HIF-1α protéines sont rapidement dégradées10,11. La courte demi-vie de HIF-1α à normoxie présente des défis techniques spécifiques pour la détection de la protéine d’extraits cellulaires, ainsi que pour l’identification des protéines d’HIF-1α-interaction. En outre, plusieurs facteurs de transcription, dont celles du complexe HIF-1 translocation dans le noyau sous conditions hypoxiques12,13,14. La plupart des méthodes actuelles utilisées pour les études PPI est effectuée au moyen de la surexpression de protéines non physiologiques. La surexpression de cette protéine a été signalée pour causer des défauts cellulaires différents par le biais de plusieurs mécanismes, y compris la surcharge de ressource, déséquilibre stoechiométrique, interactions promiscuitées et voie modulation15,16. En ce qui concerne les études de l’IPP, la surexpression de protéines peut conduire à faux positif, ou même faussement négatif, des résultats selon les propriétés de la protéine et la fonction des protéines surexprimées. Par conséquent, les méthodes actuelles pour les études PPI devront être modifiées afin de révéler les IPP physiologiquement pertinents dans des conditions hypoxiques. Nous avons déjà démontré l’interaction entre HIF-1 et le facteur de transcription famille de Ets la protéine liant le GA (GABP) dans les cellules hypoxiques P19, qui contribue à la réponse du promoteur Hes1 à hypoxie17. Nous décrivons ici un protocole co-immunoprécipitation pour étudier les IPP entre protéines nucléaires endogènes dans des conditions hypoxiques. L’interaction entre HIF-1α et ARNT est présentée comme une preuve de concept. Ce protocole est conçu pour démontrer les interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels dans des conditions hypoxiques, incluant mais non limité à l’identification des protéines qui interagissent HIF-1.

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Protocol

Cette section de protocole, qui utilise des reins embryonnaires humaines 293 a cell (HEK293A), s conforme aux lignes directrices du Comité d’éthique de la recherche humaine à l’Université technologique de Nanyang, Singapour.

1. l’induction de l’hypoxie dans les cellules de HEK293A

  1. Préparer quatre plats de 10 cm et de semences de 3 – 5 x 106 HEK293A cellules par plat dans 10 mL Dulbecco aigle modifié (DMEM, 4,5 g/L de glucose) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 2 mM de L-glutamine, pyruvate de sodium 110 mg/L, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg / mL de streptomycine. Culture de cellules dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.
    NOTE : Cellule ensemencement devrait se faire sous une hotte de sécurité biologique (BSC). Les surfaces de toutes les matières à placer dans la GCS doivent être essuyés avec l’éthanol à 70 %.
  2. 24h après le semis, lorsque les cellules ont atteint 80 à 90 % confluence, mettre deux plats dans la subchamber de l’hypoxie dans la boîte à gants de l’incubateur (voir Table des matières) avec 1 % d’O2 et de 5 % de CO2 à 37 ° C et de garder les deux autres plats à la normoxie (21 % O 2, 5 % de CO2 à 37 ° C) pendant 4 h. Utilisez un jeu de normoxique et hypoxiques cellules pour évaluer le traitement de l’hypoxie par western blot et utiliser l’autre jeu de cellules pour les expériences de co-immunoprécipitation.
    Remarque : Les niveaux d’oxygène peuvent être réglés à 0 – 5 % et la durée du traitement hypoxie peut varier selon le type de cellule et étudier l’objectif.

2. cellulaire et nucléaire Extraction

NOTE : Voir le tableau 1 pour plus d’informations sur les tampons utilisés dans le présent protocole.

  1. Récolter les cellules de contrôle normoxie.
    1. Retirez le support de culture par aspiration et rincer les cellules 10 ml SPD (PH 7.0 – 7.2) à l’aide d’une pipette 10 mL.
      Remarque : Ne pas toucher la monocouche de cellules à l’aide de la pipette. Pendant le lavage, Pipetez doucement le SPD tomber le mur de la plaque de culture cellulaire afin d’éviter la perte de cellules.
    2. Pipetter 5 mL glacee SPD dans la plaque et raclez les cellules sur la surface de la plaque dans du PBS glacée avec un grattoir de cellules.
    3. Transférer la suspension cellulaire dans les tubes coniques 15 mL et rester sur la glace.
  2. Récolter les cellules cultivées dans des conditions hypoxiques.
    1. Equilibrer avant le SPD à des conditions d’hypoxie en plaçant une découvert 1mL 00 expérience réactif bouteille en verre remplie de SPD dans la subchamber de l’hypoxie (1 % O2 et 5 % de CO2 à 37 ° C) pendant 24 h à l’avance.
    2. Environ 1 h avant la récolte des cellules de l’hypoxie traitée, placer une glacière contenant de la glace dans la chambre de traitement de la boîte à gants, qui a été équilibrée à 1 % O2 et de 5 % de CO2. Transférer le flacon contenant le SPD hypoxique préalablement équilibré de l’hypoxie subchamber à la chambre de traitement et placez-le sur la glace.
    3. 4 h après le traitement de l’hypoxie, transférer les cellules de l’hypoxie subchamber à la chambre de traitement qui a été préalablement équilibrée à 1 % O2 et de 5 % de CO2.
    4. Retirez le support de culture par aspiration et rincer les cellules une fois 10 ml pipette glacee SPD hypoxique préalablement équilibré avec un 10 mL.
    5. Ajouter 5 mL glacee SPD préalablement équilibré avec un 5 mL pipette et déloger les cellules en grattant avec un grattoir de cellules.
    6. Inclinaison de la plaque de culture cellulaire et de recueillir les cellules individuelles à l’aide d’une pipette 10 mL. Transférer la suspension cellulaire au SPD dans les tubes coniques 15 mL et rester sur la glace.
    7. Ouvrez la porte entre les chambres de traitement et de la mémoire tampon de la boîte à gants, qui ont été préalablement équilibrés à 1 % O2 et 5 % de CO2. Transférer les tubes coniques 15 mL sur glace contenant des cellules de la chambre de traitement hypoxie traité devant la chambre de la mémoire tampon. Ouvrir la porte de la chambre de la mémoire tampon et enlèvera les cellules complètement de la boîte à gants.
  3. Fois les cellules normoxiques de 2,1 et les cellules hypoxiques de 2,2 à pellets par centrifugation à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Préparer la cellule entière extraits.
    1. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 500 µL de radio glacee immunoprécipitation (RIPA) lyse tampon contenant 50 mM Trisaminomethane chlorhydrate (Tris-HCl) pH 8,0, 150 mM de chlorure de sodium (NaCl), 1 % tergitol-type NP-40 (NP-40), désoxycholate de sodium 0,5 %, et 0,1 % dodécylsulfate de sodium (SDS), additionné de 1 x cocktail inhibiteur de la protéase (voir Table des matières) en pipettant également, les granules cellulaires et descendre plusieurs fois.
    2. Transférer les lysats cellulaires dans des tubes de microcentrifuge 1,5 mL neufs et rester sur la glace pendant 30 min avec agitation occasionnelle.
    3. Centrifuger les lysats cellulaires à 13 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
    4. Recueillir le surnageant, aliquote 50 µL de surnageant dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et conserver à-80 ° C.
  5. Préparer les extraits nucléaires en utilisant une extraction nucléaire nécessaire (voir la Table des matières).
    1. Resuspendre doucement les boulettes de cellule dans 500 µL de NL de tampon de lyse additionné de 1 inhibiteur de la protéase cocktail et 0,1 M le dithiothréitol (DTT) en pipettant également, les granules cellulaires et descendre plusieurs fois.
    2. Ajouter 25 µL de solution détergente NP à la suspension cellulaire et vortexer pendant 10 s à vitesse maximale.
    3. Centrifuger à 10 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    4. Recueillir le liquide surnageant (extraits cytoplasmiques), aliquote 50µl de surnageant dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et stocker à-80 ° C.
    5. Resuspendre le culot contenant des noyaux des cellules en 500 µL de tampon de lyse NL additionné de 1 inhibiteur de la protéase cocktail et 0,1 M DTT au Vortex pendant 5 s à vitesse maximale.
    6. Centrifuger à 10 000 g pendant 5 min à 4 ° C et sauver le culot nucléaire.
    7. Resuspendre le culot nucléaire dans 50 µL de NX1 de tampon d’Extraction additionné de 1 x inhibiteur de la protéase cocktail en pipettant également, le culot de monter et descendre plusieurs fois.
    8. Incuber pendant 30 min sur glace, vortex pour 10 s toutes les 5 min à vitesse maximale.
    9. Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
  6. Dessalement des extraits nucléaires.
    1. Recueillir le surnageant à l’étape 2.5.9 et transfert dans les appareils de dialyse mini avec un volume maximum de 100 µL par unité.
    2. Boucher les appareils de dialyse mini et placez-les dans un dispositif de flottaison.
    3. Mettre le dispositif de flottaison dans un bécher de 500 mL de tampon de dialyse préalablement réfrigérées (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20 % de glycérol, le chlorure de potassium (KCl) 100 mM, 0,2 mM l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,2 le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) mM et 0,5 mM TNT) et laisser incuber 30 min à 4 ° C sous agitation douce.
      ATTENTION : Le PMSF est dangereux. Évitez tout contact direct avec la peau ou par inhalation.
    4. Recueillir les échantillons du coin de l’appareils de dialyse mini et transférer dans nouveaux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
    5. Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C, aliquote 25 µL de chaque surnageant dans un tube de microtubes de 1,5 mL et conserver à-80 ° C.

3. evaluation du traitement de l’hypoxie par détection de l’Expression de la protéine et la localisation subcellulaire de HIF-1α

  1. Déterminer la concentration de protéine des cellules entières ou des extraits nucléaires/cytoplasmiques utilisant l’analyse de la microplaque de bicinchoninic acide (BCA) protéine test kit selon les instructions de fabricant18.
  2. Diluer les lysats cellulaires dans 1 x Laemmli solution tampon contenant 5 % de 2-mercaptoéthanol et faites bouillir à 95 ° C pendant 5 min.
    ATTENTION : Ne pas toucher la surface du bloc chauffant, car il peut causer des brûlures.
  3. Séparer les protéines par électrophorèse en gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE).
    1. Charger des quantités égales de protéines (25 µg) dans chaque puits d’un SDS-PAGE préfabriqué gradient gels (4 – 20 %), ainsi que 3 µL du marqueur de poids moléculaire.
    2. Exécutez le gel en tampon contenant 2,5 mM Tris, glycine 19,2 mM, SDS de 0,01 %, PH8.3 pendant 30 min à 200 volts.
  4. Transfert des protéines à partir du gel à la membrane de nitrocellulose.
    1. Monter le sandwich de transfert (papier filtre-gel-membrane-filtre papier) avec le gel sur le côté de l’anode et la membrane du côté de la cathode de la cassette.
    2. Placez la cassette dans le réservoir de transfert rempli avec tampon de transfert contenant 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glycine 19,2 mM et 20 % de méthanol.
      ATTENTION : Méthanol est inflammable et doit être conservé à l’intérieur de l’armoire de stockage liquide inflammable.
    3. Effectuer le virement pendant 1 h à 100 V dans la chambre froide.
  5. Bloquer la tache au tampon de blocage de 10 mL contenant 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), NaCl 150 mM, 0.1 Tween 20 et 5 % de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur.
  6. Incuber la tache avec de l’anticorps anti-HIF-1α (dilution 1/500) dans un tampon bloquant la même nuit à 4 ° C.
  7. Lavez la tache 3 fois pendant 5 min à chaque fois avec 50 mL de SCT-T.
  8. Incuber la tache avec la peroxydase de raifort (HRP)-anticorps secondaire conjugué (dilution 1/1 000) dans 10 mL SCT-T contenant 5 % dégraissé de lait sec pendant 1 h à température ambiante.
  9. Lavez la tache 3 fois pendant 5 min à chaque fois avec 50 mL de SCT-T.
  10. Mix 500 µL chacun de chemilumescent amélioré (ECL) réactif A et B dans un tube de microtubes de 1,5 mL et vortex brièvement.
  11. Appliquer le substrat de l’ECL à la tache et laisser incuber pendant 1 min à température ambiante.
  12. Capter les signaux de chimiluminescence en utilisant une charge - coupled device (CCD) système d’imagerie par caméra.
    1. Égoutter l’excès substrat ECL en touchant le bord de la membrane avec un papier de soie et placer la membrane dans un protecteur de la feuille.
    2. Placer la membrane sur le plateau de l’échantillon du CCD caméra basée sur système d’imagerie.
    3. Lancer le logiciel de traitement d’image (voir la Table des matières) et capturer les images avec les paramètres suivants : fichier → nouveau protocole → monocanal → configuration protocole → Gel imagerie (Application : Chemi ; Domaine de l’imagerie : Gel prêt Bio-Rad ; Exposition d’imagerie : Le logiciel optimisera automatiquement le temps d’exposition pour les bandes intenses) protocole Run →
      Remarque : La durée d’exposition peut être réglée manuellement pour obtenir des images optimales.

4. immunoprécipitation et détection des protéines immunoprécipitée

  1. Lavez 50µl de billes de protéine A/G Sépharose dans 500 µL de tampon TBS dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et les perles de granule par centrifugation à 3 000 x g pendant 2 min à 4 ° C.
  2. Jeter le surnageant et remettre en suspension les perles dans 100 µL de tampon de TBS.
  3. Ajouter 2 µL de l’anticorps monoclonal anti-ARNT de souris (1,4 mg/mL) ou de la souris l’immunoglobuline G (IgG) (1,4 mg/mL) qui a été préparé en reconstituant la souris IgG de 0,7 mg dans 500 µL de tampon de TBS.
  4. Placer les tubes de microcentrifuge de 1,5 mL contenant les perles dans une coiffe de tube et incuber pendant 2 h à 10 tr/min dans la chambre froide.
    NOTE : Gérez les tubes doucement et garder la suspension contenant les billes au fond du tube.
  5. Les perles de granule par centrifugation à 3 000 x g pendant 2 min à 4 ° C et jeter le surnageant.
  6. Diluer 200 µg de la protéine nucléaire lysate obtenue en étape 2.6.5 dans 800 µL de tampon IP 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), consistant en 180 mM NaCl, 20 % de glycérol, inhibiteur de protéase de NP-40 et 1 x 0,2 % cocktail. Incuber le lysat avec les perles couplée à l’anticorps obtenus à l’étape 4.5 durant la nuit à 4 ° C.
  7. Les perles de granule par centrifugation à 3 000 x g pendant 2 min à 4 ° C, jeter le surnageant et laver les perles 3 fois avec 1 mL SCT glacée contenant 0,2 % NP-40.
  8. Faire bouillir les perles dans 50 µL de tampon d’échantillon Laemmli à 95 ° C pendant 5 min.
  9. Centrifuger les perles à 10 000 x g pendant 5 min à 4 ° C, recueillir le liquide surnageant et jeter les perles.
    Remarque : Le liquide surnageant peut être stocké à 4 ° C pour le court terme ou à-20 ° C pour le long terme.
  10. Détecter la présence de HIF-1α depuis les complexes de protéine immunoprécipitée par western blot, comme décrit dans l’étape 3.3 partir.
    NOTE : Quantification des protéines n’est pas nécessaire pour cette étape. Charger le volume complet (50 µL) de surnageant de chaque échantillon dans chaque cupule d’un SDS-PAGE préfabriqué gradient gels (4 – 20 %)

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Representative Results

Pour évaluer la réponse cellulaire à l’hypoxie, l’expression de niveaux et localisation subcellulaire des composants du traitement hypoxie ci-après HIF1 complex ont été examinés. HEK293A cellules ont été cultivées dans des conditions hypoxiques pendant 4 h ou maintenu à la normoxie comme témoins. Les taux de protéine HIF-1α et ARNT sont examinés à germes entiers ou des extraits nucléaires/cytoplasmique par western blot. Comme prévus, totales HIF-1α niveaux étaient surexprimés par l’hypoxie, tandis que les niveaux de l’ARNT dans les lysats cellulaires totales n’étaient pas significativement modifié (Figure 1 a). En outre, l’hypoxie induite par accumulation nucléaire de HIF-1α et ARNT dans les cellules HEK293A (Figure 1 b), ce qui concorde avec les rapports précédents, bien qu’expression cytoplasmique de l’ARNT n’a pas été détectée dans certaines des lignes cellulaires testées19.

Ensuite, nous avons démontré l’interaction entre HIF-1α et ARNT suivant le traitement de l’hypoxie. Extraits nucléaires sont préparés à partir des cellules de HEK293A exposées pour normoxique ou des conditions d’hypoxie pour des expériences de 4 h. Co-Immunoprécipitation ont été réalisées en utilisant des extraits nucléaires des cellules HEK293A. Comme illustré à la Figure 2, HIF-1α a été co-immunoprécipitée avec ARNT des extraits nucléaires des cellules hypoxiques de HEK293A.

Pris ensemble, le protocole décrit peut être utilisé avec succès pour induire une réponse à l’hypoxie dans les cellules et pour mieux déterminer la liaison aux protéines physiologiques de façon endogène exprimé complexes de HIF-1α/ARNT dans le noyau.

Figure 1
Figure 1 : Règlement d’expression de la protéine et la localisation sous-cellulaire de des composants par l’hypoxie HIF-1. (A) Immunoblot analyse d’expression de HIF-1α ou ARNT totale dans les cellules HEK293A. Les cellules ont été exposés à une hypoxie pendant 4 h (H) ou conservés à la normoxie (N). Protéines à partir d’extraits de cellules entières ont été séparés par SDS-PAGE et analysées par immunotransfert avec anti-HIF-1α, anti-ARNT et anticorps anti-glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH). GAPDH a été utilisé comme un contrôle de chargement. (B) Immunoblot analyse d’expression de HIF-1α et ARNT dans les fractions subcellulaires des cellules HEK293A. Les cellules HEK293A ont été cultivées dans des conditions hypoxiques pendant 4 h (H) ou conservés à la normoxie (N). 25 µg de protéines à partir des extraits nucléaires et cytoplasmiques ont été analysés par immunotransfert utilisant anti-HIF-1α, anti-ARNT, anti-yin et yang 1 (YY1) et des anticorps anti-GAPDH. YY1 et GAPDH ont servi de chargement de contrôles pour les fractions nucléaires et cytoplasmiques, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : HIF-1α interagit avec l’ARNT dans des conditions hypoxiques. HEK293A cellules ont été exposés à une hypoxie pendant 4 h ou maintenus à la normoxie comme témoins. Des extraits nucléaires des cellules HEK293A ont été préparés et immunoprécipitation ont été effectuées à l’aide d’un anticorps anti-ARNT. Nucléaire extrait (entrées) et les protéines immunoprécipitée ont été analysées par immunotransfert utilisant des anticorps anti-HIF-1α, anti-ARNT et anti-YY1. YY1 a été utilisée comme un contrôle de chargement pour les entrées et IgG a été utilisé comme contrôle négatif pour les expériences de co-immunoprécipitation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Solution Composants Commentaires
Tampon de dialyse 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 20 % de glycérol, 100 mM KCl, 0. 2 mM EDTA, PMSF à 0,2 mM et 0,5 mM TNT Ajouter PMSF et TNT immédiatement avant l’emploi.
Tampon en cours d’exécution 2,5 mM Tris-HCl (PH 8,3), glycine 19,2 mM et 0,01 % SDS Mélanger 100 mL 10 x tampon Tris/Glycine/SDS avec 900 mL FD2O.
Tampon de transfert 2,5 mM Tris-HCl (PH 8,3), glycine 19,2 mM et 20 % de méthanol Mélanger 100 mL 10 x tampon Tris/Glycine avec 200 mL de méthanol et 700 mL FD2O.
Tampon du SCT 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) et NaCl 150 mM Mélanger 100 mL 10 x TBS tampon avec 900 mL FD2O.
Tampon de SCT-T 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), NaCl 150 mM et 0,1 % Tween 20 Mélanger 100 mL 10 x TBS de tampon avec 900 mL FD2O et 1 mL de Tween 20.
Tampon de blocage 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), NaCl 150 mM, 0,1 % Tween 20 et 5 % lait Dissoudre 5 g de bloqueur de buvard-Grade dans un tampon 100 mL SCT-T.
Mémoire tampon d’IP 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20 % de glycérol, inhibiteur de protéase de NP-40 et 1 x 0,2 % cocktail Ajouter le cocktail inhibiteur de la protéase immédiatement avant l’emploi.

Tableau 1 : Préparation de la Solution.

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Discussion

Le complexe de HIF-1 est un maître régulateur de l’homéostasie cellulaire de l’oxygène et réglemente une pléthore de gènes impliqués dans les différentes réponses adaptatives cellulaires à l’hypoxie. Identification de nouvelles protéines qui interagissent de HIF-1 est importante pour la compréhension de la transduction du signal hypoxique. Co-Immunoprécipitation expériences sont couramment utilisés pour les études de l’IPP pour délimiter les voies de transduction de signal cellulaire. Cependant, la surexpression de la protéine est encore largement utilisée et cela peut entraîner des artefacts expérimentaux. En outre, HIF-1α est une protéine très instable et il devient rapidement dégradé pendant la ré-oxygénation11. En outre, l’hypoxie déclenche une translocation nucléaire de HIF-1 composants dans des lignées de cellules mammifères plus. Conventionnel co-immunoprécipitation protocoles doivent donc être optimisé pour l’identification des protéines qui interagissent de physiologiquement pertinents HIF-1 après le traitement de l’hypoxie. Nous décrivons ici un co-immunoprécipitation mis à jour le protocole qui est utilisé pour démontrer l’interaction entre HIF-1α et ARNT à l’hypoxie.

Pour éviter la dégradation de l’HIF-1α pendant la ré-oxygénation, les cellules hypoxiques ont été récoltés à l’intérieur de la chambre de traitement de la boîte à gants de l’incubateur qui a été préalablement équilibré à des conditions d’hypoxie. Le tampon de lavage du SPD a été également équilibré à des conditions hypoxiques avant utilisation. S’il n’y a aucun poste de travail hypoxie disponibles pour le traitement, les cellules hypoxiques peuvent être lavés avec SPD hypoxique préalablement équilibré et ensuite récoltés rapidement sur glace. Considérant que l’hypoxie peut déclencher la translocation nucléaire des composants de HIF-1 et que la surexpression de protéines peut provoquer des résultats artéfactuelles, protéines nucléaires endogènes ont été utilisés dans le présent protocole. L’utilisation des extraits nucléaires dans le protocole de co-immunoprécipitation a également été rapporté par d’autres20. Il représente un avantage technique pour l’étude des interactions entre protéines nucléaires, car il réduit le risque de protéines nucléaires de dilution dehors par des protéines de la cellule entière. En outre, l’utilisation des extraits nucléaires peut être utile pour la réduction des interactions non spécifiques, en particulier de très abondantes protéines cytoplasmiques non pertinentes et pour l’amélioration de la stabilité des protéines nucléaires en réduisant au minimum l’exposition à protéases présentes dans le cytoplasme. L’utilisation des extraits nucléaires endogènes au lieu d’extraits de cellules entières pour le co-immunoprécipitation montre une nette amélioration technique, que nous pouvons détecter seulement l’interaction entre HIF-1α et GABPα utilisant des extraits nucléaires endogènes mais ne pas ensemble 17extraits cellulaires.

Dans le protocole décrit, plusieurs conditions peuvent être optimisées pour améliorer les résultats. Nous induit par l’hypoxie dans les cellules HEK293A en les traitant avec 1 % d’oxygène pendant 4 h. Cependant les niveaux d’oxygène et de la durée du traitement hypoxie peuvent être variés pour différents types de cellules et ajustés en fonction des objectifs de l’étude. Par exemple, HIF-1α et HIF-2α peuvent être différentiellement régulés par l’hypoxie dans une manière spécifique de type cellulaire, indiquant leurs rôles distincts dans différents contextes biologiques. Il a été démontré que dans les cellules de neuroblastome, HIF-1α est plus active pendant de courtes périodes d’hypoxie intense (1 % O2), alors que HIF-2α est également actif en vertu de l’hypoxie légère (5 % O2) et devient plus actif après le traitement de l’hypoxie chronique (48 à 72 h de l’exposition hypoxique)21. 0 – 5 % O2 niveaux sont couramment utilisés pour in vitro les traitements hypoxie, où 1 – 5 % O2, 0,1 et 1 % O2 et 0 à 0,1 % O2 sont souvent définis comme légère hypoxie, l’hypoxie et l’anoxie, respectivement le22. Concentration en sel est un autre paramètre qui requiert l’optimisation, en particulier puisqu’il joue un rôle essentiel pour les interactions ioniques à l’IPP,23. Des extraits nucléaires ont été utilisées dans cette étude avec les protéines nucléaires généralement extraites à l’aide d’un tampon contenant de fortes concentrations de sel. Par conséquent, les extraits nucléaires peut-être être dessalé avant les expériences de co-immunoprécipitation. Ici, nous dessalé des extraits nucléaires à l’aide d’un tampon de dialyse contenant 100 mM KCl et mélangé les extraits dialysés avec le tampon d’IP contenant 180 mM NaCl proportionnellement à obtenir une concentration finale de sel près de 150 mM, qui est similaire au physiologique conditions d’IPP intracellulaires. La concentration finale de sel peut être modifiée en fonction des propriétés de l’IPP d’intérêt. Dans ce protocole, GAPDH a été utilisé comme un contrôle de chargement des extraits de germes entiers et fractions cytoplasmiques. Nous n’avons pas observé aucun effet significatif de réglementation induite par l’hypoxie sur expression GAPDH dans les cellules HEK293A. Cependant, GAPDH a précédemment est avéré surexprimés par l’hypoxie dans certains types de cellules24. Dans cette optique, on peut avoir besoin d’utiliser alternative chargement adéquat des contrôles lorsque cela est nécessaire25. Séparément, nous avons observé un niveau important de fond découlant soit les perles ou les anticorps utilisés dans le protocole actuel de signaux. Pour réduire l’arrière-plan, on peut prolonger les étapes de lavage (10 à 15 min) ou effectuer plus de 3 lavages (5 à 10 fois). Alternativement, la force ionique du tampon de lavage peut aussi être augmentée par titrage de la concentration en sel de 150 à 500 mM au cours de lavages. Les lysats peuvent également être préalablement autorisés par incubation avec des perles de Sépharose A/G de protéine pendant 1 h à 4 ° C, avec une rotation.

Ce protocole est limité à des extraits nucléaires et comme telle peut ne pas convenir pour l’étude des IPP au sein d’autres compartiments cellulaires comme les mitochondries et le réticulum endoplasmique. Semblable à d’autres protocoles classiques co-immunoprécipitation, cette méthode inutilisable pour étudier des IPP en temps réel ou pour déterminer si l’IPP sont directs ou indirects.

En résumé, nous fournissons un protocole mis à jour le co-immunoprécipitation pour l’identification de nouvelles protéines qui interagissent physiologiquement pertinents de HIF-1. Ce protocole est également adapté pour l’étude des interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels dans des conditions hypoxiques. Bien que ce protocole est conçu spécifiquement pour les expériences de co-immunoprécipitation dans des conditions d’hypoxie, une partie du protocole décrit pour les cellules de contrôle normoxie peut également servir à étudier les IPP nucléaire dans des conditions de normoxie.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Nous remercions Assoc. Prof. Sin Tiong Ong pour l’utilisation de la plateforme de l’hypoxie. Ce travail a été soutenu par ce qui suit : Singapour Ministry of Education, MOE 1 t 1-02/04 et MOE2015-T2-2-087 (à Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, subvention de démarrage de Nanyang Technological University M4230003 (à P.O.B.), le Conseil de recherche suédois, le Erling Persson Fondation de la famille, le Novo Nordisk Foundation, la Stichting af Jochnick Fondation, l’Association suédoise du diabète, la compagnie d’assurance de Scandia, la recherche sur le diabète et Wellness, Fondation de couchette von Kantzow, le Programme de recherche stratégique dans le diabète au Karolinska Institutet, l’ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage et Knut et Alice Wallenberg Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4  1st BASE 1415
Protein A/G Sepharose beads Abcam ab193262
Natural Mouse IgG protein Abcam ab198772
EDTA Bio-Rad 1610729
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610737
2-Mercaptoethanol Bio-Rad 1610710
Nitrocellulose Membrane    Bio-Rad 1620112
Blotting-Grade Blocker Bio-Rad 1706404 Non-fat dry milk for western blotting applications
10x Tris Buffered Saline (TBS) Bio-Rad 1706435
10% Tween 20 Bio-Rad 1610781
10x Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 1610732
10x Tris/Glycine Buffer  Bio-Rad 1610771
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610374
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling 7074
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody  Cell Signaling 7076
SignalFire ECL Reagent Cell Signaling 6883
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Corning 21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Merck Millipore 52332
ARNT/HIF-1 beta Antibody  Novus Biologicals NB100-124  Concentration: 1.4 mg/mL
HIF-1 alpha Antibody Novus Biologicals NB100-479 Concentration: 1.0 mg/mL
YY1 Antibody Novus Biologicals NBP1-46218 Concentration: 0.2 mg/mL
Qproteome Nuclear Protein Kit Qiagen 37582 Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit
GAPDH Antibody Santa Cruz sc-47724 Concentration: 0.2 mg/mL
Glycerol (≥99%) Sigma G5516
Potassium chloride Sigma P9541
RIPA buffer Sigma R0278
Sodium Chloride (NaCl) Sigma 71376
NP-40 Sigma 127087-87-0
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) Thermo Fisher Scientific 11995065
Dithiothreitol (DTT) Thermo Fisher Scientific R0861
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10270106
HEK293A cell line Thermo Fisher Scientific R70507
Methanol  Thermo Fisher Scientific 67-56-1
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Pierce Protease Inhibitor Tablets  Thermo Fisher Scientific 88660
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
QSP gel loading tip  Thermo Fisher Scientific QSP#010-R204-Q-PK 1-200 uL
Equipment/Instrument
Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm Bio-Rad 1703932
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1658034
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561083
ChemiDoc XRS+ System Bio-Rad 1708265
I-Glove BioSpherix I-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader  BioTek BTS1LFTA
Costar 5mL Stripette Serological Pipets Corning 4487
Costar 10mL Stripette Serological Pipets Corning 4488
Costar 25mL Stripette Serological Pipets Corning 4251
Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates Corning 3631
15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes Corning 352095
Small Cell Scraper Corning 3010
Gilson Pipetman L 4-pipettes kit  Gilson F167370 P2, P20, P200, P1000 and accessories
1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes Greiner Bio-One  616201
PIPETBOY acu 2 Pipettor INTEGRA Biosciences 155 000 
Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets Justrite Manufacturing Co. 896000
Vortex mixer Labnet S0200
CO2 incubator NuAire NU-5820
Orbital shakers Stuart SSL1
Tube rotator SB3 Stuart SB3
MicroCL 21R Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002470
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004240
Tissue Culture Dishes (100 mm) Thermo Fisher Scientific 150350
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Thermo Fisher Scientific 69580 10K MWCO, 0.1 mL
Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices Thermo Fisher Scientific 69588
LSE Digital Dry Bath Heaters Thermo Fisher Scientific 1168H25
Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets Thermo Fisher Scientific 13-261-308
Software
Image Lab Software Bio-Rad 1709691

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References

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Biologie numéro 138 biologie moléculaire co-immunoprécipitation interactions protéine-protéine (IPP) hypoxie facteurs inductibles par l’hypoxie (HIFs) protéines endogènes des extraits nucléaires
Essai de co-immunoprécipitation des protéines nucléaires endogènes de cellules cultivées dans des Conditions hypoxiques
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Zheng, X., Ho, C. Q. W., Zheng, X.,… More

Zheng, X., Ho, C. Q. W., Zheng, X., Lee, K. L., Gradin, K., Pereira, T. S., Berggren, P. O., Ali, Y. Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions. J. Vis. Exp. (138), e57836, doi:10.3791/57836 (2018).

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