Summary
Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação para estudar interações da proteína-proteína entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. Este método é adequado para demonstração das interacções entre factores de transcrição e reguladores transcricionais de co em hipóxia.
Abstract
Baixos níveis de oxigênio (hipóxia) desencadear uma variedade de respostas adaptativas com o Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complexos atuando como um regulador de mestre. HIF-1 consiste de uma subunidade α oxigênio-regulado de heterodimérica (HIF-1 α) e constitutivamente expressa a subunidade beta (HIF-1 β) também conhecido como aril hidrocarboneto do receptor nuclear translocator (ARNT), regulação de genes envolvidos em diversos processos, incluindo a angiogênese , eritropoiese e glicólise. A identificação das proteínas de interação de HIF-1 é a chave para a compreensão da hipóxia via de sinalização. Além do Regulamento de HIF-1 α estabilidade, a hipóxia também aciona a translocação nuclear de muitos fatores de transcrição, incluindo HIF-1 α e ARNT. Notavelmente, a maioria dos atuais métodos utilizados para estudar tais interações da proteína-proteína (PPIs) é baseada em sistemas onde os níveis de proteína são artificialmente aumentados através da superexpressão da proteína. Superexpressão da proteína, muitas vezes leva a resultados não-fisiológicos decorrentes de artefatos temporais e espaciais. Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação modificada após o tratamento de hipóxia usando proteínas nucleares endógenas e como uma prova de conceito, para mostrar a interação entre o HIF-1 α e ARNT de protocolo. Neste protocolo, as células hipóxicos foram colhidas em condições de hipóxicos e tampão de lavagem de o Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) também foi previamente equilibrado a hipoxia condições antes do uso para mitigar a degradação de proteína ou proteína complexa dissociação durante a reoxigenação. Além disso, as frações nucleares foram posteriormente extraídas para concentrar e estabilizar proteínas nucleares endógenas e evitar possíveis resultados espúrios muitas vezes vistos durante a superexpressão da proteína. Este protocolo pode ser usado para demonstrar endógenas e nativas de interações entre fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos.
Introduction
Hipóxia ocorre quando insuficiente oxigênio é fornecido para as células e tecidos do corpo. Desempenha um papel crítico em vários processos fisiológicos e patológicos, tais como a diferenciação de células-tronco, inflamação e câncer1,2. Hypoxia-inducible fatores (transplanta) funcionam como heterodímeros, compostos por uma subunidade α oxigênio-regulado e uma subunidade β constitutivamente expressa ARNT também conhecido como3. Até à data, foram identificadas três isoformas de três subunidades de HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) e as subunidades de HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3α). HIF-1 α e ARNT ubiquitously são expressos, Considerando que o HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 e ARNT3 têm mais restrito de padrões de expressão4. A complexo de proteína HIF-1 é o regulador chave da resposta hipoxia. Em condições de hipóxicos, HIF-1 α torna-se estabilizado, então translocates ao núcleo e dimeriza com ARNT5. Posteriormente, este complexo liga de nucleotídeos específicos conhecidos como elementos responsivos de hipóxia (HREs) e regula a expressão de genes-alvo envolvidos nos diversos processos, incluindo a angiogênese, eritropoiese e glicólise6. Além desta resposta "canônica", a via de sinalização de hipóxia é também conhecida por crosstalk com múltiplas resposta celular, sinalização de vias como entalhe e Nuclear Factor-kappa B (NF-κB)7,8,9.
A identificação das proteínas de interação romance HIF-1 é importante para uma melhor compreensão da hipóxia via de sinalização. Em contraste com ARNT, que é insensível aos níveis de oxigênio e constitutivamente expressa, níveis de proteína HIF-1 α estão fortemente regulamentados pelos níveis de oxigênio celular. No normoxia (21% de oxigênio), proteínas de HIF-1 α são rapidamente degradadas10,11. A meia-vida curta de HIF-1 α no normoxia apresenta desafios técnicos específicos para a deteção da proteína da célula extratos, bem como para a identificação das proteínas HIF-1 α-interagindo. Além disso, vários fatores de transcrição, incluindo aqueles do complexo HIF-1 translocar para o núcleo sob condições de hipóxia12,13,14. A maioria dos atuais métodos utilizados para estudos PPI é executada usando não-fisiológica superexpressão de proteínas. Tal superexpressão da proteína foi relatado para causar defeitos celulares diferentes através de vários mecanismos, incluindo a sobrecarga de recursos, desequilíbrio estequiométrico, interações promíscuas e via modulação15,16. Em termos de estudos PPI, a superexpressão da proteína pode levar a falso negativo positivo, ou mesmo falso, resultados, dependendo das propriedades da proteína e funções das proteínas Blumental. Portanto, os métodos atuais para estudos PPI tem que ser modificado a fim de revelar o IPP fisiologicamente relevantes sob condições de hipoxia. Nós demonstramos anteriormente a interação entre o HIF-1 e o fator de transcrição família Ets GA-proteína (GABP) em células de P19 hipóxicos, que contribui para a resposta do promotor Hes1 à hipóxia17. Aqui, descrevemos um co-imunoprecipitação para estudar PPIs entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. A interação entre o HIF-1 α e ARNT é mostrada como uma prova de conceito. Este protocolo é apropriado para demonstrar as interações entre os fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos, incluindo mas não limitado à identificação das proteínas de interação de HIF-1.
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Protocol
Esta seção de protocolo, que usa o rim embrionário humano 293A célula (HEK293A), s segue as diretrizes do Comitê de ética pesquisa humana em Nanyang Technological University, Singapore.
1. indução de hipóxia em células HEK293A
- Prepare-se quatro pratos de 10cm e sementes de 3 – 5 x 106 HEK293A células por prato em 10 mL Dulbecco modificado suplementado do Eagle (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio de 110 mg/L, 100 U/mL penicilina e 100 mg / estreptomicina mL. Cultura de células em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
Nota: Célula semeadura deve ser realizada em uma câmara de segurança biológica (CSB). As superfícies de todos os materiais sejam colocados o BSC devem ser limpo com álcool 70%. - 24 h após a semeadura, quando as células têm alcançado a confluência de 80-90%, colocou dois pratos a hipóxia subchamber no porta-luvas incubadora (ver Tabela de materiais) com 1% de O2 e 5% CO2 a 37 ° C e manter os outros dois pratos no normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) por 4 h. usar um conjunto de células hipóxicos e normoxic para avaliar o tratamento de hipóxia por western blot e utilizar o outro conjunto de células para as experiências de co-imunoprecipitação.
Nota: Os níveis de oxigênio podem ser definidos em 0 – 5% e a duração do tratamento a hipóxia pode ser variado dependendo do tipo de célula e estudo objetivo.
2. toda célula e extração Nuclear
Nota: Consulte a tabela 1 para obter informações sobre buffers usados no presente protocolo.
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As células de controle de normoxia da colheita.
- Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células com 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) utilizando uma pipeta de 10 mL.
Nota: Evite tocar a monocamada de células com a pipeta. Durante a lavagem, pipete suavemente o DPBS abaixo o muro da placa de cultura de células para evitar a perda de células. - Pipetar 5 mL DPBS gelada na placa e raspe as células da superfície da placa em PBS gelado com um raspador de célula.
- Transferir a suspensão de eritrócitos para tubos cônico de 15 mL e manter no gelo.
- Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células com 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) utilizando uma pipeta de 10 mL.
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Colha as células cultivadas em condições de hipóxicos.
- Pre-equilibrar a DPBS às condições de hipóxicos, colocando um descoberta 100 mL experimento reagente frasco de vidro cheio de DPBS no subchamber de hipóxia (1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C) por 24 h de antecedência.
- Aproximadamente 1 h antes da colheita de células a hipóxia tratada, coloque uma caixa de gelo contendo gelo na câmara de processamento do porta-luvas, que a solução foi equilibrada para 1% O2 e 5% de CO2. O frasco contendo a pre-equilibrado DPBS hipóxica da hipóxia subchamber para a câmara de processamento de transferência e colocá-lo no gelo.
- 4 h após o tratamento de hipóxia, transferir as células de subchamber a hipóxia para a câmara de transformação que tem sido pre-equilibrada para 1% O2 e 5% de CO2.
- Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células uma vez com 10 mL geladas DPBS hipóxicos pre-equilibradas com um 10 mL pipeta.
- Adicione 5 mL geladas DPBS pre-equilibradas com um 5 mL pipeta e desalojar as células por raspagem com uma espátula de célula.
- Inclinação da placa de cultura de células e coletar as células desanexadas usando uma pipeta de 10 mL. Transferir a suspensão de eritrócitos em DPBS para tubos cônico de 15 mL e manter no gelo.
- Abra a porta entre as câmaras processamento e tampão do porta-luvas, as quais foram previamente equilibradas para 1% O2 e 5% de CO2. Transferi os tubos cônico de 15 mL contendo células de hipóxia tratada da câmara de processamento para a câmara de tampão de gelo. Abra a porta da câmara reserva e remova completamente as células no porta-luvas.
- Pelota tanto as células normoxic de 2.1 e as células hipóxicos de 2.2 por centrifugação a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C.
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Prepare a célula inteira extratos.
- Resuspenda as pelotas de célula em 500 µ l de tampão de lise do ensaio (RIPA) imunoprecipitação rádio gelada contendo 50 mM pH cloridrato de Trisaminomethane (Tris-HCl) 8.0, 150 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1% preparar-tipo NP-40 (NP-40), 0,5% de sódio Deoxycholate do, e 0,1% Dodecil sulfato de sódio (SDS), suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease (ver Tabela de materiais) pipetando as pelotas de célula acima e para baixo várias vezes.
- Transferir os lisados celulares para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e manter no gelo por 30 min com ocasional num Vortex.
- Centrifugue os lisados celulares a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
- Recolher o sobrenadante, alíquota 50 µ l do sobrenadante para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C.
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Preparar os extratos nucleares usando uma extração nuclear kit (veja a tabela de materiais).
- Resuspenda suavemente as pelotas de célula em 500 µ l de tampão de Lise NL suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease e 0,1 M ditiotreitol (DTT) pipetando as pelotas de célula acima e para baixo várias vezes.
- Adicione 25 µ l de solução detergente NP para a suspensão de células e vórtice para 10 s na velocidade máxima.
- Centrifugação a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C.
- O sobrenadante (extratos citoplasmáticos), alíquota 50 µ l do sobrenadante para tubos de 1,5 mL microcentrifuga, de coletar e armazenar a-80 ° C.
- Resuspenda o pellet contendo núcleos de célula em 500 µ l de tampão de Lise NL suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease e 0,1 M DTT vortexing para 5 s na velocidade máxima.
- Centrifugar a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C e salvar a pelota nuclear.
- Resuspenda o pellet nuclear em 50 µ l de Buffer de extração NX1 suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease pipetando a pelota subindo e descendo várias vezes.
- Incubar durante 30 min no gelo, num Vortex para 10 s cada 5 min na velocidade máxima.
- Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.
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Do desalt os extratos nucleares.
- Recolha o sobrenadante da etapa 2.5.9 e transferência para os dispositivos de diálise mini com um volume máximo de 100 µ l por unidade.
- Tampe os dispositivos mini diálise e colocá-los em um dispositivo de flutuação.
- Colocar o dispositivo de flutuação em um béquer contendo 500 mL de tampão de diálise pre-refrigerados (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20% de glicerol, 100 mM de cloreto de potássio (KCl), 0,2 ácido etilenodiaminotetracético de mM (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoreto (PMSF) e 0,5 mM DTT) e incube por 30 min a 4 ° C, com agitação suave.
Cuidado: PMSF é perigosa. Evite o contato direto com a pele ou por inalação. - Coletar as amostras do canto dos dispositivos mini diálise e transferir para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL.
- Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C, alíquota 25 µ l de cada sobrenadante para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C.
3. avaliação do tratamento hipóxia por detecção da expressão da proteína e localização Subcellular de HIF-1 α
- Determinar a concentração de proteína da célula inteira ou nuclear/citoplasmática extrai usando o ensaio de microplacas de bicinchoninic ácido (BCA) proteína ensaio kit de acordo com as instruções de18 do fabricante.
- Diluir os lisados celulares em 1 x Laemmli amortecedor da amostra contendo 5% 2-Mercaptoetanol e ferva a 95 ° C por 5 min.
Cuidado: Não toque na superfície do bloco de aquecimento, uma vez que pode causar queimaduras. -
Separe as proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE).
- Carrega quantidades iguais de proteínas (25 µ g) em cada poço de um geles de SDS-PAGE prefabricado de gradiente (4 – 20%), juntamente com 3 µ l do marcador de peso molecular.
- Funcione o gel em marcha tampão contendo 2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS, PH8.3 por 30 min a 200 V.
-
Transferi as proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose.
- Monte o sanduíche de transferência (papel de filtro-gel-membrana-filtro de papel) com o gel do lado do ânodo e a membrana do lado do cátodo da fita.
- Coloque a fita no tanque de transferência preenchido com buffer de transferência contendo 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM e 20% de metanol.
Cuidado: O metanol é inflamável e deve ser armazenado dentro do armário de armazenamento líquido inflamável. - Efectue a transferência para 1 h a 100 V na sala fria.
- Bloquear o borrão em 10 mL de tampão de bloqueio contendo 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween 20 e 5% leite desnatado por 1h à temperatura ambiente em um shaker.
- Incubar o blot com anticorpo anti-HIF-1 α (diluição de 1/500), a mesma reserva de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
- Lave a mancha por 5 min por 3 vezes cada vez com 50 mL TBS-T.
- Incubar o blot com peroxidase de rábano (HRP)-anticorpo secundário conjugado (diluição de 1/1.000) em 10 mL TBS-T contendo 5% desnatado leite seco por 1h à temperatura ambiente.
- Lave a mancha por 5 min por 3 vezes cada vez com 50 mL TBS-T.
- Mix de 500 µ l cada de chemilumescent reforçada (ECL) reagente A e B em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e vórtice brevemente.
- Aplicar o substrato ECL para o Borrão e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.
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Capture os sinais quimioluminescente usando um dispositivo de carga acoplada (CCD) sistema de imagens baseado em câmera.
- Escorra o excesso substrato ECL tocando a borda da membrana com um papel absorvente e colocar a membrana em um protetor de folha.
- Coloque a membrana sobre a bandeja de amostra do CCD sistema de imagens baseado em câmera.
- Lançar o software de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais) e capturar as imagens com as seguintes configurações: arquivo → novo protocolo → único canal → configuração protocolo → Gel de imagem (aplicativo: Chemi; Área da imagem: Gel pronto Bio-Rad; Exposição de imagens: O software automaticamente irá otimizar o tempo de exposição para intensas bandas) protocolo de execução →
Nota: O tempo de exposição pode ser ajustado manualmente para conseguir as imagens ideais.
4. imunoprecipitação e detecção de proteínas de Immunoprecipitated
- Lave a 50 µ l de grânulos de proteína A/G sepharose em 500 µ l de tampão TBS em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C.
- Desprezar o sobrenadante e ressuspender as contas em 100 µ l de tampão TBS.
- Adicione 2 µ l de anticorpo monoclonal anti-ARNT de rato (1,4 mg/mL) ou mouse imunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) que foi preparado pela reorganização do mouse 0,7 mg IgG no buffer TBS 500 µ l.
- Coloque os tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo os grânulos em um rotador de tubo e incubar durante 2 h a 10 rpm na sala fria.
Nota: Lidar com os tubos suavemente e manter a suspensão contendo os grânulos no fundo do tubo. - Os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C e descartar os sobrenadantes.
- Dilua 200 µ g da proteína nuclear lisada obtida na etapa 2.6.5 em 800 µ l de buffer IP consistindo de 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM de NaCl, 20% de glicerol, 0,2% x NP-40 e 1 inibidor da protease cocktail. Incubar o lisado com os grânulos de anticorpos acoplados obtidos na etapa 4.5 durante a noite a 4 ° C.
- Os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C, descartar os sobrenadantes e lave os grânulos 3 vezes com 1 mL gelada TBS contendo 0,2% NP-40.
- Ferva os grânulos em 50 amortecedor da amostra Laemmli µ l a 95 ° C por 5 min.
- Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e descartar os grânulos.
Nota: O sobrenadante pode ser armazenado a 4 ° C para o curto prazo ou a-20 ° C, a longo prazo. - Detecta a presença de HIF-1 α partir os complexos de proteína immunoprecipitated pelo borrão ocidental, conforme descrito no passo 3.3 em diante.
Nota: A quantificação da proteína não é necessária para esta etapa. Carregar o volume completo (50 μL) do líquido sobrenadante de cada amostra em cada poço de um geles de SDS-PAGE prefabricado de gradiente (4 – 20%)
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Representative Results
Para avaliar a resposta celular a hipóxia, a expressão de níveis e Localização subcellular dos componentes do tratamento de hipóxia seguir HIF-1 complexo foram examinados. HEK293A as células foram cultivadas em condições de hipóxicos para 4h ou mantidos no normoxia como controles. Níveis de proteína HIF-1 α e ARNT foram examinados no celular ou nuclear/citoplasmática extrai pelo borrão ocidental. Como esperados, totais de níveis de HIF-1 α foram upregulated por hipóxia, Considerando que os níveis ARNT no lisado celular total não foram significativamente alteraram (figura 1A). Além disso, hipóxia induzida por acumulação nuclear do HIF-1 α e ARNT nas células HEK293A (figura 1B), que é consistente com relatórios anteriores, embora a expressão citoplasmática de ARNT não foi detectado em algumas das linhas celulares testados19.
Em seguida, demonstrar a interação entre o HIF-1 α e ARNT após o tratamento de hipóxia. Extratos nucleares foram preparados a partir de células de HEK293A expostas a normoxic ou hipóxicos condições para experiências de h. 4 Co-imunoprecipitação foram realizadas usando nucleares extratos de células HEK293A. Como mostrado na Figura 2, o HIF-1 α foi co-immunoprecipitated juntamente com ARNT de extractos nucleares de hipoxia HEK293A células.
Tomados em conjunto, o protocolo descrito pode ser utilizado com sucesso para induzir uma resposta hipoxia nas células e para ainda mais determinar a ligação às proteínas fisiológicas de endogenamente expressa complexos HIF-1 α/ARNT dentro do núcleo.
Figura 1: Regulação da expressão da proteína e Localização subcellular de HIF-1 componentes por hipoxia. (A) análise de Immunoblot da expressão total de HIF-1 α ou ARNT nas células HEK293A. As células foram expostas à hipoxia por 4 h (H) ou mantidas a normoxia (N). Proteínas de extratos de células inteiras foram separadas por SDS-PAGE e analisadas pelo immunoblotting com anti-HIF-1 α, anti-ARNT e anticorpos antigliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH). GAPDH foi usado como um controle de carregamento. (B) Immunoblot análise de expressão do HIF-1 α e ARNT em frações subcelulares de células HEK293A. HEK293A as células foram cultivadas em condições de hipóxicos para 4 h (H) ou mantido a normoxia (N). 25 µ g de proteína de extratos nucleares ou citoplasmáticas foram analisadas pelo immunoblotting utilizando anti-HIF-1 α, anti-ARNT, anti-yin e yang 1 (YY1) e anticorpos anti-GAPDH. YY1 e GAPDH foram usados como carregar controles para frações nucleares e citoplasmáticas, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: HIF-1 α interage com ARNT em condições de hipóxicos. HEK293A células eram expostas a hipóxia por 4 h ou mantidas no normoxia como controles. Nuclear, foram preparados extratos de células HEK293A e moleculas foram realizadas utilizando um anticorpo anti-ARNT. Nuclear extrai (entradas) e proteínas de immunoprecipitated foram analisadas pelo immunoblotting utilizando anticorpos anti-HIF-1 α, anti-ARNT e anti-YY1. YY1 foi usado como um controle de carregamento para as entradas enquanto IgG foi usado como controlo negativo para os experimentos de co-imunoprecipitação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Componentes | Comentários |
| Buffer de diálise | 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 20% de glicerol, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, PMSF de 0.2 mM e 0,5 mM DTT | Adicione PMSF e TDT imediatamente antes do uso. |
| Buffer de execução | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8,3), glicina 19,2 mM e 0,01% SDS | Misturar 100 mL 10 x tampão Tris/glicina/SDS com 900 mL ddH2O. |
| Buffer de transferência | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8,3), glicina 19,2 mM e 20% de metanol | Misturar 100 mL 10 x tampão Tris/glicina com 200 mL de metanol e 700 mL ddH2O. |
| Buffer de TBS | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) e 150 mM de NaCl | Misturar 100 mL 10 x TBS de tampão com 900 mL ddH2O. |
| Buffer de TBS-T | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl e 0.1% Tween 20 | Mistura de 100 mL 10 x TBS tampão com 900 mL ddH2O e 1 mL de Tween 20. |
| Tampão de bloqueio | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20 e 5% de leite desnatado | Dissolva 5 g de mata-borrão-Grade bloqueador no buffer de 100ml TBS-T. |
| Buffer de IP | 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20% de glicerol, 0,2% x NP-40 e 1 inibidor da protease cocktail | Adicione o cocktail de inibidor de protease imediatamente antes do uso. |
Tabela 1: Preparação da solução.
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Discussion
O complexo HIF-1 é um mestre regulador da homeostase celular oxigênio e regula uma infinidade de genes envolvidos em diferentes respostas adaptativas celulares à hipoxia. Identificação de novas proteínas de interação de HIF-1 é importante para a compreensão da transdução de sinal de hipoxia. Co-imunoprecipitação experimentos são comumente usados para estudos de IPP para delinear as vias de transdução de sinal de celular. No entanto, superexpressão de proteínas é ainda amplamente utilizada e isso pode levar a artefatos experimentais. Além disso, o HIF-1 α é uma proteína altamente instável e torna-se rapidamente degradada durante a re-oxigenação11. Além disso, a hipóxia desencadeia translocação nuclear do HIF-1 componentes em linhas de células de mamíferos mais. Portanto, protocolos de co-imunoprecipitação convencional precisam ser otimizado para a identificação das proteínas de interação fisiologicamente relevantes HIF-1 após o tratamento de hipóxia. Aqui, descrevemos um protocolo de co-imunoprecipitação modificados que é usado para demonstrar a interação entre o HIF-1 α e ARNT em hipóxia.
Para evitar a degradação do HIF-1 α durante a re-oxigenação, as hipoxia células foram colhidas no interior da câmara de processamento de incubadora porta-luvas que foi previamente incubado a condições de hipóxicos. O tampão de lavagem DPBS também foi incubado a hipoxia condições antes do uso. Se não há nenhuma estação de trabalho hipóxia disponíveis para processamento, as células hipóxicos podem ser lavadas com pre-equilibrado DPBS hipóxico e posteriormente colhidas rapidamente no gelo. Considerando que a hipóxia pode desencadear a translocação nuclear de componentes de HIF-1 e a superexpressão da proteína pode induzir resultados artefactual, endógenas proteínas nucleares foram utilizadas no presente protocolo. O uso de extratos nucleares no protocolo de co-imunoprecipitação também tem sido relatado por outros20. Representa uma vantagem técnica para o estudo das interações entre proteínas nucleares, pois isso minimiza a chance de proteínas nucleares de ser diluído para fora por proteínas de células inteiras. Além disso, o uso de extratos nucleares pode ser útil para a redução das interacções não-específicas, especialmente de proteínas citoplasmáticas irrelevantes altamente abundantes e para a melhoria da estabilidade da proteína nuclear, minimizando a exposição a proteases presentes no citoplasma. O uso de extratos nucleares endógenos, em vez de extratos de células inteiras para o co-imunoprecipitação mostra uma significativa melhoria técnica, como só podemos detectar a interação entre o HIF-1 α e GABPα endógenos extratos nucleares mas não usando toda a célula extrai17.
O protocolo descrito, várias condições podem ser ainda mais otimizadas para melhorar resultados. Induzimos hipóxia em células HEK293A, tratando-as com 1% de oxigênio por 4h. No entanto os níveis de oxigênio e a duração do tratamento a hipóxia podem ser variadas para diferentes tipos de células e ajustados de acordo com os objectivos do estudo. Por exemplo, HIF-1 α e HIF-2α podem ser diferencialmente regulada pela hipóxia de uma maneira específica de tipo de célula, indicando seus papéis distintos em diferentes contextos biológicos. Tem sido demonstrado que em células de neuroblastoma, HIF-1 α é mais ativo durante curtos períodos de intensa hipóxia (1% O2), enquanto HIF-2α também é ativa sob hipóxia leve (5% O2) e torna-se mais ativo seguir tratamento de hipóxia crônica (48-72 h de exposição hipóxica)21. 0 – 5% O2 níveis são comumente usados para tratamentos de hipóxia em vitro , onde 1 – 5% O2, 0,1-1% O2 e 0-0,1% O2 são frequentemente definidos como leve hipóxia, hipóxia e anóxia, respectivamente22. Concentração de sal é outro parâmetro que requer otimização, especialmente desde que desempenha um papel crítico para interações ionic em IPP23. Extratos nucleares foram utilizados neste estudo com as proteínas nucleares geralmente extraídas usando um buffer que contém altas concentrações de sal. Portanto, os extratos nucleares podem ter que ser postas antes das experiências de co-imunoprecipitação. Aqui, nós postas os extratos nucleares usando um buffer de diálise contendo 100 mM KCl e misturado os extratos dializados com a reserva IP que contém 180 mM NaCl proporcionalmente para atingir uma concentração final de sal perto de 150 mM, que é semelhante ao fisiológico condições de PPIs intracelulares. A concentração final de sal pode ser modificada dependendo das propriedades da IPP de interesse. Neste protocolo, GAPDH foi usado como um controle de carregamento para toda célula extratos e frações citoplasmáticas. Nós não observaram qualquer efeito regulamentar induzida por hipóxia significativo na expressão de GAPDH nas células HEK293A. No entanto, GAPDH anteriormente mostrou ser upregulated por hipóxia em certos tipos de célula24. Com isto em mente, um pode precisar usar controles alternativos carregamento adequado quando necessário25. Separadamente, observamos um nível significativo de fundo sinal decorrentes de grânulos ou anticorpos usados no protocolo atual. Para reduzir o fundo, pode-se prolongar as etapas de lavagem (10-15 min) ou executar mais de 3 lavagens (5 – 10 vezes). Alternativamente, a força iônica do tampão de lavagem também pode ser aumentada por titulada a concentração de sal entre 150 a 500 mM durante lavagens. Os lysates também pode ser desmarcados previamente pela incubação com grânulos de sepharose A/G de proteína para 1 h a 4 ° C, com rotação.
Este protocolo é limitado aos extractos nucleares e como tal pode não ser adequado para o estudo de IPP dentro de outros compartimentos celulares como mitocôndrias e retículo endoplasmático. Similar a outros protocolos de co-imunoprecipitação convencional, este método não pode ser usado para estudar o IPP em tempo real ou para determinar se o IPP é diretos ou indiretos.
Em resumo, nós fornecemos um co-imunoprecipitação modificado para a identificação de novas proteínas interagem fisiologicamente relevantes de HIF-1. Este protocolo também é adequado para o estudo das interacções entre factores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos. Embora este protocolo é projetado especificamente para as experiências de co-imunoprecipitação em condições de hipóxia, uma parte do protocolo descrito para as células de controle de normoxia também pode ser usada para estudar os PPIs nucleares sob condições de normoxia.
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Disclosures
Os autores declaram não há conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos o Prof Assoc. Sin Tiong Ong para a utilização da estação de hipóxia. Este trabalho foi apoiado pelo seguinte: Singapura Ministério da educação, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (para cá), Lee Kong Chian da faculdade de medicina, Universidade Tecnológica de Nanyang arranque grant M4230003 (p.o.b.), o Conselho Sueco de pesquisa, o Erling Persson Fundação da família, a Novo Nordisk Foundation, o Stichting af Jochnick Foundation, associação sueca de Diabetes, a companhia de seguros Scandia, a pesquisa do Diabetes e Wellness, Fundação do cais von Kantzow, o Programa de investigação estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet, a ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e a Fundação de Wallenberg Alice e Knut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
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