Summary
Hier beschreiben wir ein co-Immunopräzipitation-Protokoll, um Protein-Protein-Interaktionen zwischen endogenen nuklearen Proteine unter hypoxischen Bedingungen zu studieren. Diese Methode eignet sich zur Demonstration der Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulierungsbehörden auf Hypoxie.
Abstract
Niedrige Sauerstoffsättigung (Hypoxie) lösen eine Vielzahl von adaptive Reaktionen mit Hypoxie-induzierbaren Faktors Komplex als ein master Regler 1 (HIF-1). HIF-1 besteht aus einem heterodimerisierenden Sauerstoff reguliert α Untereinheit (HIF-1α) und konstitutiv ausgedrückt β-Untereinheit (HIF-1β) auch bekannt als Aryl Hydrocarbon-Rezeptor nuklearen Nyrianer (ARNT), Regulierung von Genen, die in unterschiedlichen Prozessen einschließlich Angiogenese , Erythropoese und Glykolyse. Die Identifizierung von HIF-1 interagierenden Proteine ist Schlüssel zum Verständnis der Hypoxie Signalweg. Neben der Regelung von HIF-1α Stabilität löst Hypoxie auch die nukleare Translokation von vielen Transkriptionsfaktoren einschließlich HIF-1α und ARNT. Bemerkenswert ist, basieren die meisten aktuellen Methoden zur Untersuchung solcher Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) auf Systemen, wo proteingehalte durch Protein-Überexpression künstlich erhöht werden. Protein-Überexpression oft führt zu unphysiologischen Ergebnisse aus zeitlichen und räumlichen Artefakte. Hier beschreiben wir eine modifizierte co-Immunopräzipitation Protokoll nach Hypoxie Behandlung mit endogenen nuklearen Proteine und als ein Proof of Concept, das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT zu zeigen. In diesem Protokoll die hypoxischen Zellen unter hypoxischen Bedingungen geerntet wurden und die Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) Waschpuffer war auch vorab äquilibriert hypoxischen Bedingungen vor der Benutzung zum Proteinabbau oder Proteinkomplex mindern Dissoziation in flussbettfilters. Darüber hinaus waren die nuklearen Fraktionen anschließend extrahiert, um konzentrieren und endogenen nuklearen Proteine stabilisieren und vermeiden mögliche falsche Ergebnisse oft während Protein Überexpression gesehen. Dieses Protokoll kann zur endogene und native Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulierungsbehörden unter hypoxischen Bedingungen zu demonstrieren.
Introduction
Hypoxie tritt auf, wenn die Zellen und Geweben des Körpers nicht ausreichend Sauerstoff zugeführt wird. Es spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen wie stammzelldifferenzierung, Entzündungen und Krebs1,2. Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) fungieren als Heterodimere bestehend aus einem Sauerstoff-regulierten α-Untereinheit und einer konstitutiv exprimierten β-Untereinheit auch bekannt als ARNT3. Bis heute wurden drei Isoformen von HIF-α-Untereinheiten (HIF-1α, HIF-2α und HIF-3α) und drei HIF-β-Untereinheiten (ARNT/HIF-1β, ARNT2 und ARNT3) identifiziert. HIF-1α und ARNT sind ubiquitär ausgedrückt, während HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 und ARNT3 mehr Ausdruck Muster4eingeschränkt haben. Die HIF-1-Protein-Komplex ist der zentrale Regler der Hypoxie Antwort. Unter hypoxischen Bedingungen HIF-1α stabilisiert wird, dann translocates in den Zellkern und dimerizes mit ARNT5. Anschließend dieser Komplex bindet an spezifische Nukleotide bekannt als Hypoxie reagiert Elemente (HREs) und den Ausdruck der Zielgene in vielfältigen Prozesse einschließlich der Angiogenese, Erythropoese und Glykolyse6regelt. Neben dieser "kanonisch" Reaktion, die Hypoxie-Signalweg ist auch bekannt, Übersprechen mit mehreren zelluläre Reaktion Signalwege wie Notch und Nuclear Factor-Kappa B (NF-κB)7,8,9.
Die Identifizierung von interagierenden Proteine Roman HIF-1 ist wichtig für ein besseres Verständnis für die Hypoxie Signalweg. Im Gegensatz zu ARNT, ist unempfindlich gegenüber Sauerstoff-Niveaus und konstitutiv exprimierten sind HIF-1α proteingehalte zellulären Sauerstoff-Niveaus fest geregelt. Bei normoxiezustand (21 % Sauerstoff) sind Proteine, HIF-1α stark degradierten10,11. Die kurze Halbwertszeit von HIF-1α am normoxiezustand präsentiert spezielle technische Herausforderungen für die Erkennung des Proteins aus Zelle Extrakten sowie für die Identifizierung von HIF-1α-wechselwirkenden Proteinen. Darüber hinaus translozieren mehrere Transkriptionsfaktoren, einschließlich derjenigen der HIF-1-Komplex in den Zellkern unter hypoxischen Bedingungen12,13,14. Die meisten der aktuellen Methoden für die PPI-Studien werden mit unphysiologischen Überexpression von Proteinen durchgeführt. Diese Protein-Überexpression wurde berichtet, zu verschiedenen zellulären defekten durch mehrere Mechanismen, einschließlich des Ressource-Überladung, stöchiometrischen Ungleichgewicht und promiscuous Interaktionen Weg Modulation15,16. In Bezug auf PPI Studien kann Protein Überexpression zu falsch positive oder sogar falsch Negative Ergebnisse je nach Protein Eigenschaften und der Funktionsweise der überexprimieren Proteine führen. Die aktuellen Methoden zur PPI Studien müssen daher geändert werden, um die physiologisch relevanten ppi unter hypoxischen Bedingungen zu offenbaren. Zuvor haben wir bewiesen, dass die Interaktion zwischen HIF-1 und Ets Familie Transkriptionsfaktors GA-bindeprotein (GABP) in hypoxischen P19 Zellen, die für die Reaktion des Hes1 -Promotors auf Hypoxie17beiträgt. Hier beschreiben wir ein co-Immunopräzipitation Protokoll zur ppi zwischen endogenen nuklearen Proteine unter hypoxischen Bedingungen zu studieren. Das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT erscheint als ein Proof of Concept. Dieses Protokoll eignet sich für den Nachweis der Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulatoren unter hypoxischen Bedingungen, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Identifizierung von HIF-1 interagierenden Proteine.
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Protocol
In diesem Protokoll Abschnitt, die menschliche embryonale Nieren 293A verwendet (HEK293A) Zelle s erfolgt nach den Richtlinien der Humanforschung Ethikkommission in Nanyang Technological University, Singapore.
1. Induktion von Hypoxie in HEK293A Zellen
- Bereiten Sie vier 10 cm Gerichte und Samen 3 – 5 x 106 HEK293A Zellen pro Schale in 10 mL Dulbeccos geändert Adlers Medium (DMEM, 4,5 g/L Glukose) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 110 mg/L Natrium Pyruvat, 100 U/mL Penicillin und 100 mg / mL Streptomycin. Kultur der Zellen in einem 37 ° C, 5 % CO2 Inkubator.
Hinweis: Zelle Aussaat sollte in einem biologischen Sicherheitsschrank (BSC) durchgeführt werden. Die Oberflächen aller Materialien in der BSC platziert werden sollte mit 70 % Ethanol abgerieben werden. - 24 h nach der Aussaat, wenn die Zellen 80 – 90 % Konfluenz erreicht haben setzen zwei Gerichte in der Hypoxie-Subchamber in den Inkubator Glovebox (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 % O2 und 5 % CO2 bei 37 ° C und halten Sie die anderen beiden Gerichte auf normoxiezustand (21 % O 2, 5 % CO2 bei 37 ° C) für 4 Std. verwenden Sie eine Reihe von Inklusieve und hypoxische Zellen zu bewerten die Hypoxie-Behandlung von western-Blot und die andere Gruppe von Zellen für die co-Immunopräzipitation Experimente zu nutzen.
Hinweis: Der Sauerstoffgehalt ist einstellbar auf 0 – 5 % und die Dauer der Behandlung Hypoxie kann variiert werden, je nach Zelltyp und Ziel zu studieren.
(2) die ganze Zelle und nukleare Extraktion
Hinweis: Informationen finden Sie unter Tabelle 1 auf Puffer, die in diesem Protokoll verwendeten.
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Die normoxiezustand Kontrollzellen zu ernten.
- Entfernen Sie die Kultur-Medien durch Absaugen und spülen Sie die Zellen mit 10 mL DPBS (PH 7,0 – 7,2) mit einer 10 mL-Pipette.
Hinweis: Berühren Sie nicht die Zelle monomolekularen Film mit der Pipette. Während des Waschens pipette vorsichtig die DPBS die Mauer der Zellplatte Kultur um Zellverlust zu vermeiden. - 5 mL Pipette eiskalte DPBS in die Platte und die Zellen von der Oberfläche der Platte in eiskaltem PBS mit einer Zelle Spachtel zu kratzen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in 15 mL konische Röhrchen und halten Sie auf dem Eis.
- Entfernen Sie die Kultur-Medien durch Absaugen und spülen Sie die Zellen mit 10 mL DPBS (PH 7,0 – 7,2) mit einer 10 mL-Pipette.
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Ernten Sie die Zellen unter hypoxischen Bedingungen kultiviert.
- Pre-equilibrate des DPBS hypoxischen Bedingungen durch die Platzierung eines ungedeckten 100 mL Experiment Reagenz Glasflasche gefüllt mit DPBS in der Hypoxie-Subchamber (1 % O2 und 5 % CO2 bei 37 ° C) für 24 h im voraus.
- Ca. 1 h vor der Ernte der Zellen Hypoxie behandelt, legen Sie eine Eisbox mit Eis in der Prozesskammer das Handschuhfach, die 1 % O2 und 5 % CO2equilibriert worden. Übertragen Sie die Flasche mit Pre äquilibriert hypoxischen DPBS aus der Hypoxie-Subchamber in der Prozesskammer und auf Eis legen.
- 4 h nach der Behandlung der Hypoxie, übertragen die Zellen von Hypoxie-Subchamber auf die Prozesskammer, die vorab äquilibriert, 1 % O2 und 5 % CO2wurde.
- Entfernen Sie die Nährmedien durch Absaugen und spülen Sie die Zellen, einmal mit 10 mL eiskaltes Pre äquilibriert hypoxischen DPBS mit 10 mL pipette.
- Fügen Sie 5 mL eiskaltes Pre äquilibriert DPBS mit 5 mL pipette und verdrängen die Zellen durch kratzen mit einem Schaber Zelle hinzu.
- Kippen Sie der Zellplatte Kultur und sammeln Sie die freistehenden Zellen mit einer 10 mL-Pipette. Übertragen Sie die Zellsuspension in DPBS in 15 mL konische Röhrchen und halten Sie auf dem Eis.
- Öffnen Sie die Tür zwischen den Verarbeitungs- und Puffer Kammern der Glovebox, die beide Pre äquilibriert, 1 % O2 und 5 % CO2gewesen sein. Übertragen Sie die 15 mL konische Röhrchen auf Eis mit Hypoxie behandelt Zellen aus der Verarbeitung-Kammer, die Sperrkammer. Öffnen Sie die Tür der Pufferkammer und entfernen Sie die Zellen vollständig aus dem Handschuhfach.
- Pellet-sowohl die Inklusieve Zellen von 2.1 und die hypoxischen Zellen von 2.2 durch Zentrifugation bei 1.000 X g für 5 min bei 4 ° C.
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Bereiten Sie die ganze Zelle Extrakten.
- Die Zelle Pellets in 500 µL eiskalte Radio Immunopräzipitation (RIPA) Lyse testpuffer mit 50 mM Trisaminomethane-Hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM Natriumchlorid (NaCl), 1 % Tergitol-Typ NP-40 (NP-40), 0,5 % Natrium Deoxycholate, aufschwemmen und 0,1 % Natrium Dodecyl Sulfat (SDS), ergänzt mit 1 x cocktail Protease-Hemmer (siehe Tabelle der Materialien) durch die Zelle Pellets nach oben und unten mehrmals pipettieren.
- Übertragen Sie die Zelle Lysates in neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie für 30 min mit gelegentlichen Vortexen auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die Zelle Lysates 13.000 x g für 10 min bei 4 ° C.
- Der Überstand, aliquoten 50 µL des Überstands in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen sammeln und speichern bei-80 ° C.
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Bereiten Sie die nukleare Extrakte mit einer nuklearen Extraktion kit (siehe Tabelle der Materialien).
- Sanft Aufschwemmen der Zelle Pellets in 500 µL Lyse Puffer NL mit 1 x cocktail-Proteasehemmer und 0,1 M Dithiothreitol (DTT) ergänzt durch die Zelle Pellets nach oben und unten mehrmals pipettieren.
- 25 µL der Reinigungslösung NP hinzu kommen die Zellsuspension und Wirbel für 10 s mit maximaler Geschwindigkeit.
- Zentrifuge bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C.
- Den überstand (zytoplasmatischen Auszüge), aliquoten 50 µL des Überstands in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, erheben und speichern bei-80 ° C.
- Aufschwemmen der Pellet mit Zellkerne in 500 µL Lyse Puffer NL ergänzt mit 1 x cocktail-Proteasehemmer und 0,1 M DTT durch Vortexen für 5 s mit maximaler Geschwindigkeit.
- Zentrifugieren bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C, und speichern Sie die nukleare Pellet.
- Aufschwemmen der nuklearen Pellet in 50 µL Extraktion Puffer NX1 mit 1 x Proteaseinhibitor cocktail durch pipettieren die Kugel nach oben und unten mehrmals ergänzt.
- Inkubation für 30 min auf Eis, Vortexen für 10 s alle 5 min. bei maximaler Geschwindigkeit.
- Zentrifuge bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C.
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Entsalzen Sie die nukleare Extrakte.
- Sammeln des Überstands Schritt 2.5.9 und Transfer in die Mini-Dialyse-Geräte mit einem maximalen Volumen von 100 µL pro Einheit.
- Verschließe die Mini Dialysegeräten und legen Sie sie in eine Schwimmhilfe.
- Legen Sie die Schwimmhilfe in einen Becher mit 500 mL vorgekühlt Dialyse-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20 % Glycerin, 100 mM Kaliumchlorid (KCl), 0,2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA), 0,2 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mM DVB-t) und 30 min bei 4 ° C unter schonenden rühren inkubieren.
Achtung: PMSF ist gefährlich. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit Haut oder Inhalation. - Die Proben aus der Ecke von der Mini-Dialysegeräten zu sammeln und übertragen in neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren bei 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C, aliquoten 25 µL jeder überstand zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und bei-80 ° c Lagern
3. Bewertung der Hypoxie Behandlung durch Erkennung der Proteinexpression und subzelluläre Lokalisation der HIF-1α
- Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins die ganze Zelle oder eines nuklearen/zytoplasmatischen Extrakte mit Mikrotestplatte Assay eine Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay Kit nach Herstellerangaben Anweisungen18.
- Verdünnen Sie die Zelle Lysates in 1 X Laemmli Probenpuffer mit 5 % 2-Mercaptoethanol und bei 95 ° C für 5 min kochen.
Achtung: Berühren Sie nicht die Oberfläche der Heizblock, da dies zu Verbrennungen führen kann. -
Trennen Sie die Proteine durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE).
- Laden Sie gleiche Mengen von Protein (25 µg) in jede Vertiefung eine SDS-PAGE Fertigteile gradient Gele (4 – 20 %), zusammen mit 3 µL des Markers Molekulargewicht.
- Führen Sie das Gel im laufenden Puffer mit 2,5 mM Tris, 19,2 mM Glycin, 0,01 % SDS, PH8.3 für 30 min bei 200 V.
-
Übertragen Sie die Proteine aus dem Gel auf die Nitrozellulose-Membran.
- Montieren Sie das Transfer-Sandwich (Filterpapier-Gel-Membran-Filterpapier) mit dem Gel auf der Anodenseite und die Membran an der Kathodenseite der Kassette.
- Legen Sie die Kassette in den Transfer-Tank mit Transfer-Puffer mit 2,5 mM Trisaminomethane (Tris), 19,2 mM Glycin und 20 % Methanol gefüllt.
Achtung: Methanol ist brennbar und sollte innerhalb der brennbaren Flüssigkeit Schrank gelagert werden. - Führen Sie den Transfer für 1 h bei 100 V in den kalten Raum.
- Blockieren Sie den Blot in 10 mL blockierende Puffer mit 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1 Tween 20 und 5 % fettfreie Milch für 1 h bei Raumtemperatur in einen Shaker geben.
- Inkubieren Sie den Fleck mit Anti-HIF-1α Antikörper (Verdünnung 1: 500) in den gleichen blockierenden Puffer über Nacht bei 4 ° c
- Waschen Sie den Fleck 3 Mal für 5 min jeweils mit 50 mL TBS-T.
- Inkubieren Sie den Fleck mit Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper (1/1.000 Verdünnung) in 10 mL TBS-T mit 5 % fettfreie Trockenmilch für 1 h bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie den Fleck 3 Mal für 5 min jeweils mit 50 mL TBS-T.
- Mix 500 µL jeder verbesserte Chemilumescent (ECL) Reagenz A und B in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Wirbel kurz.
- ECL-Substrat auf den Fleck auftragen und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.
-
Die Chemolumineszenz Signale mit einem kostenlos – Coupled Gerät (CCD) Kamera-basierten imaging-System zu erfassen.
- Abtropfen lassen Sie überschüssige ECL Substrat durch berühren den Rand der Membran mit einem Papiertuch und die Membran in ein Blatt Beschützer.
- Legen Sie die Membran auf Probenteller des CCD Kamerabasierte imaging-System.
- Bildverarbeitungs-Software zu starten (siehe Tabelle der Materialien) und die Aufnahmen mit den folgenden Einstellungen: Datei → neue Protokoll → Einkanal → Protokolleinstellungen → Gel Imaging (Anwendung: Chemi; Imaging-Bereich: Bio-Rad bereit Gel; Imaging Belichtung: Die Software wird automatisch optimieren die Belichtungszeit für intensive Bands) → Run Protokoll
Hinweis: Die Belichtungszeit kann manuell eingestellt werden, um die optimale Bilder zu erreichen.
4. Immunopräzipitation und Erkennung der Immunoprecipitated Proteine
- Waschen 50 µL Protein A/G-Sepharose-Kügelchen in 500 µL des TBS-Puffers in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C.
- Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Perlen in 100 µL der TBS-Puffer.
- Fügen Sie 2 µL der Maus monoklonalen Anti-ARNT Antikörper (1,4 mg/mL) oder Maus-Immunglobulin G (IgG) (1,4 mg/mL), die durch Neuaufbau 0,7 mg Maus IgG in 500 µL TBS Puffer vorbereitet wurde.
- Legen Sie die 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, enthält die Perlen in ein Rohr-Rotator und inkubieren Sie für 2 h bei 10 u/min in den kalten Raum.
Hinweis: Behandeln Sie die Rohre vorsichtig zu und halten Sie die Suspension mit den Perlen an der Unterseite des Rohres. - Pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C und die Überstände zu verwerfen.
- Verdünnen Sie 200 µg des nuklearen Proteins lysate erwarb Schritt 2.6.5 in 800 µL des Puffers IP-bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20 % Glycerin, 0,2 % NP-40 und 1 X Proteaseinhibitor cocktail. Inkubieren Sie mit dem Antikörper gekoppelt Perlen im Schritt 4.5 über Nacht bei 4 ° c erreicht die lysate
- Pellet-die Perlen durch Zentrifugation bei 3.000 X g für 2 min bei 4 ° C, verwerfen die Überstände und waschen Sie die Perlen 3 Mal mit 1 mL eiskaltes TBS mit 0,2 % NP-40.
- Kochen Sie die Perlen in 50 µL Laemmli Probenpuffer bei 95 ° C für 5 min.
- Zentrifugieren Sie die Perlen bei 10.000 X g für 5 min bei 4 ° C, sammeln Sie den überstand zu und entsorgen Sie die Perlen.
Hinweis: Der Überstand kann bei 4 ° C für den kurzfristigen oder-20 ° C dauerhaft gespeichert werden. - Ermitteln Sie das Vorhandensein von HIF-1α aus der Immunoprecipitated-Protein-komplexe durch western-Blot wie oben beschrieben im Schritt 3.3 ab.
Hinweis: Protein Quantifizierung ist nicht erforderlich für diesen Schritt. Laden Sie vollen Lautstärke (50 µL) des Überstands jeder Probe in jede Vertiefung eine SDS-PAGE Fertigteile gradient Gele (4 – 20 %)
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Representative Results
Die zelluläre Reaktion auf Hypoxie, der Ausdruck beurteilen wurden Ebenen und subzelluläre Lokalisation der Komponenten der HIF-1 folgende Hypoxie Komplexbehandlung untersucht. HEK293A Zellen wurden kultiviert unter hypoxischen Bedingungen für 4 h oder als Steuerelemente auf normoxiezustand gehalten. HIF-1α und ARNT proteingehalte untersucht wurden ganze Zelle oder nukleare/zytoplasmatischen extrahiert durch western-Blot. Wie erwartete, total HIF-1α-Ebenen hochreguliert durch Hypoxie, ARNT Ebenen im gesamten zellulären Lysates waren nicht signifikant verändert (Abb. 1A). Darüber hinaus induzierte Hypoxie nuklearen Anreicherung von HIF-1α und ARNT in HEK293A Zellen (Abbildung 1 b), die konsistent mit früheren Berichten, obwohl zytoplasmatischen Ausdruck von ARNT in einigen der getesteten Zelle Linien19nicht erkannt wurde.
Als nächstes haben wir das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT nach Hypoxie Behandlung gezeigt. Nukleare Extrakte wurden aus HEK293A Zellen, Inklusieve vorbereitet oder hypoxische Bedingungen für 4 Std. Co-Immunopräzipitation Experimente wurden mit nuklearen Auszüge aus HEK293A Zellen durchgeführt. Wie in Abbildung 2gezeigt, war HIF-1α co-Immunoprecipitated zusammen mit ARNT aus den nuklearen Extrakten von hypoxischen HEK293A Zellen.
Zusammen genommen, das Protokoll beschrieben erfolgreich einsetzbar induzieren eine hypoxische Reaktion in den Zellen und um weitere physiologische Proteinbindung von endogen bestimmt ausgedrückt HIF-1α/ARNT komplexe innerhalb des Zellkerns.
Abbildung 1: Regulierung der Proteinexpression und subzelluläre Lokalisation der HIF-1 Komponenten durch Hypoxie. (A) Immunoblot Analyse der gesamten HIF-1α oder ARNT Ausdruck in den HEK293A Zellen. Die Zellen wurden ausgesetzt Hypoxie für 4 h (H) oder normoxiezustand (N) gehalten. Proteine aus ganzen zellextrakte wurden durch SDS-PAGE getrennt und analysiert durch Immunoblotting mit Anti-HIF-1α, Anti-ARNT und Anti-Glyceraldehyde-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) Antikörper. GAPDH diente als ein Steuerelement laden. (B) Immunoblot Analyse der HIF-1α und ARNT Ausdruck in subzellulären Bruchteilen von HEK293A Zellen. HEK293A Zellen wurden kultiviert unter hypoxischen Bedingungen für 4 h (H) oder normoxiezustand (N) gehalten. 25 µg Protein aus nuklearen oder zytoplasmatischen Extrakten analysiert wurden durch Immunoblotting mit Anti-HIF-1α, Anti-ARNT, Anti-Yin und Yang 1 (YY1) und Anti-GAPDH Antikörper. YY1 und GAPDH dienten als Steuerelemente für nukleare und zytoplasmatischen Bruchteile, bzw. laden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: HIF-1α interagiert mit ARNT unter hypoxischen Bedingungen. HEK293A Zellen wurden ausgesetzt, Hypoxie für 4 h oder als Steuerelemente auf normoxiezustand gehalten. Nukleare Auszüge aus HEK293A Zellen wurden vorbereitet und Immunperoxidase wurden mit einem Anti-ARNT Antikörper durchgeführt. Nukleare extrahiert (Eingänge) und Immunoprecipitated Proteine analysiert wurden durch Immunoblotting mit Anti-HIF-1α, Anti-ARNT und Anti-YY1 Antikörpern. YY1 diente als ein Laden-Steuerelement für die Eingänge während IgG als die negativ-Kontrolle für die co-Immunopräzipitation Experimente verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Lösung | Komponenten | Kommentare |
| Dialyse-Puffer | 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 20 % Glycerin, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM PMSF und 0,5 mM DVB-t | Fügen Sie PMSF und DVB-t, unmittelbar vor der Anwendung. |
| Laufenden Puffer | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8,3), 19,2 mM Glycin und 0,01 % SDS | Mischen Sie 100 mL 10 x Tris/Glycin/SDS Puffer mit 900 mL DdH2O. |
| Puffer zu übertragen | 2,5 mM Tris-HCl (PH 8,3), 19,2 mM Glycin und 20 % methanol | Mischen Sie 100 mL 10 x Tris/Glycin Puffer mit 200 mL Methanol und 700 mL DdH2O. |
| TBS-Puffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6) und 150 mM NaCl | Mischen Sie 100 mL 10 X TBS Puffer mit 900 mL DdH2O. |
| TBS-T Puffer | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl und 0,1 % Tween 20 | Mix 100 mL 10 X TBS Puffer mit 900 mL DdH2O und 1 mL Tween 20. |
| Puffer zu blockieren | 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20 und 5 % fettfreie Milch | Lösen Sie 5 g Promokatelnuju-Grade-Blockers in 100 mL TBS-T Puffer. |
| IP-Puffer | 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM NaCl, 20 % Glycerin, 0,2 % NP-40 und 1 X Proteaseinhibitor cocktail | Protease-Hemmer Cocktail unmittelbar vor der Anwendung hinzufügen. |
Tabelle 1: Vorbereitung der Lösung.
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Discussion
Der HIF-1-Komplex ist ein master Regulator der zellulären Sauerstoff Homöostase und regelt eine Vielzahl von Genen, die in verschiedenen zellulären adaptive Reaktionen auf Hypoxie. Identifizierung von neuen HIF-1 interagierenden Proteine ist wichtig für das Verständnis der hypoxischen Signaltransduktion. Co-Immunopräzipitation Experimente werden häufig für ppi Studien verwendet, um zelluläre Signalwege Transduktion zu umreißen. Allerdings Protein Überexpression ist immer noch weit verbreitet und dies kann zu experimentellen Artefakten führen. Darüber hinaus HIF-1α ist ein höchst instabilen Protein und Sauerstoffversorgung der Re11wird es rasch abgebaut. Darüber hinaus löst Hypoxie nuklearen Translokation von HIF-1-Komponenten in den Säugetieren Zelllinien. Herkömmliche co-Immunopräzipitation Protokolle müssen daher für die Identifizierung von physiologisch relevanten HIF-1 interagierenden Proteine nach Hypoxie Behandlung optimiert werden. Hier beschreiben wir eine modifizierte co-Immunopräzipitation-Protokoll, das verwendet wird, um die Interaktion zwischen HIF-1α und ARNT bei Hypoxie zu demonstrieren.
Um den Abbau von HIF-1α während Re Oxydation zu vermeiden, geerntet wurden die hypoxischen Zellen im Inneren der Kammer Verarbeitung der Inkubator Glovebox hypoxischen Bedingungen vorab equilibriert war. Die DPBS Waschpuffer wurde auch hypoxische Bedingungen vor Nutzung equilibriert. Für die Verarbeitung gibt es keine Hypoxie-Workstation, können die hypoxischen Zellen mit Pre äquilibriert hypoxischen DPBS gewaschen und danach schnell auf Eis geerntet. Bedenkt, dass Hypoxie die nukleare Translokation von HIF-1 Komponenten auslösen kann und Überexpression dieses Proteins artifizielle Ergebnisse induzieren kann, wurden endogene nuklearen Proteine in diesem Protokoll verwendet. Die Verwendung von nuklearen Extrakte in das co-Immunopräzipitation-Protokoll wurde auch von anderen20gemeldet. Es stellt einen technischen Vorteil für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen nuklearen Proteine, da sie die Chance, nuklearen Proteine aus, sich durch die gesamte Zelle Proteine verdünnt minimiert. Darüber hinaus kann die Verwendung von nuklearen Extrakte für die Reduktion der unspezifische Interaktionen, vor allem aus sehr reichlich irrelevant zytoplasmatischen Proteinen, und zur Verbesserung der nuklearen proteinstabilität hilfreich durch Minimierung der Exposition gegenüber Proteasen in das Zytoplasma vorhanden. Die Nutzung der endogenen nuklearen Auszüge statt ganze Zelle Extrakten für die co-Immunopräzipitation zeigt eine deutliche technische Verbesserung, da wir nur erkennen kann, das Zusammenspiel von HIF-1α und GABPα mit endogenen nuklearen Extrakte, aber nicht ganz mit Zelle extrahiert17.
In dem beschriebenen Protokoll können mehrere Bedingungen weiter optimiert werden, um die Ergebnisse zu verbessern. Wir induzierte Hypoxie in HEK293A Zellen durch Behandlung mit 1 % Sauerstoff für 4 h. Jedoch können der Sauerstoffgehalt und die Behandlungsdauer der Hypoxie variiert für verschiedene Zelltypen und die Ziele der Studie angepasst werden. Zum Beispiel kann HIF-1α und HIF-2α differentiell durch Hypoxie Zelle Art gezielt, reguliert werden unter Angabe ihrer unterschiedlichen Rollen in verschiedenen biologischen zusammenhängen. Es hat gezeigt, dass in den Neuroblastoma Zellen, HIF-1α aktivsten während kurzer Zeiträume von intensiv Hypoxie (1 % O2), während HIF-2α auch unter milde Hypoxie (5 % O2) aktiv ist und wird aktiver folgenden chronischen Hypoxie Behandlung (48-72 h hypoxische Exposition)21. 0 – 5 % O2 Ebenen sind gebräuchlich für in-vitro- Hypoxie-Behandlungen, wo 1 – 5 % O2, 0,1 – 1 % O2 und 0-0.1 % O2 gelten häufig als milde Hypoxie, Hypoxie und Sauerstoffmangel, bzw.22. Salzkonzentration ist ein weiterer Parameter, der Optimierung erfordert, zumal es eine entscheidende Rolle für die Ionischen Wechselwirkungen in ppi23 spielt. Nukleare Extrakte wurden in dieser Studie mit den nuklearen Proteinen, die in der Regel extrahiert mit einem Puffer, die hohe Konzentrationen des Salzes verwendet. Die nukleare Extrakte müssen daher vor der co-Immunopräzipitation Experimente entsalzt werden. Hier entsalzt wir die nukleare Extrakte mit ein Dialyse-Puffer mit 100 mM KCl, und vermischt die dialysierten Extrakte mit den IP-Puffer mit 180 mM NaCl proportional zu erreichen eine endgültige Salzkonzentration in der Nähe von 150 mM, das ist ähnlich wie physiologische intrazelluläre ppi-Bedingungen. Die endgültige Salzkonzentration kann je nach den Eigenschaften der PPI von Interesse geändert werden. In diesem Protokoll wurde GAPDH laden zur Kontrolle für die ganze Zelle Extrakten und zytoplasmatischen Brüche verwendet. Wir waren nicht darauf bedacht, signifikante Hypoxie-induzierten regulierende Wirkung auf GAPDH Ausdruck in den HEK293A Zellen. Jedoch GAPDH zuvor nachweislich hochreguliert werden durch Hypoxie in bestimmte Zelle Arten24. Mit diesem im Verstand, eventuell eine alternative ordnungsgemäße Beladung Kontrollen bei Bedarf verwenden25. Separat, beobachteten wir ein erhebliches Maß an Hintergrund signal aus Perlen oder Antikörper, die in das aktuelle Protokoll verwendet. Um den Hintergrund zu verringern, kann eine Waschschritte (10-15 min) zu verlängern oder führen Sie mehr als 3 Wäschen (5 – 10 mal). Alternativ kann auch die Ionenstärke der Waschpuffer erhöht werden, durch die Salzkonzentration von 150 bis 500 mM bei Wäschen titrieren. Die Lysates können auch vorab durch Inkubation mit Protein A/G Sepharose-Kügelchen für 1 h bei 4 ° C mit Rotation gelöscht werden.
Dieses Protokoll beschränkt sich auf nukleare Extrakte und als solche möglicherweise nicht geeignet für die Untersuchung von ppi in anderen zellulären Kompartimenten wie Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum. Ähnlich wie bei anderen konventionellen co-Immunopräzipitation Protokolle, kann diese Methode verwendet werden, PPI in Echtzeit zu studieren oder um festzustellen, ob die PPI direkt oder indirekt sind.
Zusammenfassend lässt sich sagen bieten wir eine modifizierte co-Immunopräzipitation-Protokoll für die Identifizierung von neuen physiologisch relevanten HIF-1 interagierenden Proteine. Dieses Protokoll eignet sich auch für die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulatoren unter hypoxischen Bedingungen. Obwohl dieses Protokoll speziell für die co-Immunopräzipitation Experimente unter Hypoxie Bedingungen vorgesehen ist, kann ein Teil der beschriebenen Protokoll für die normoxiezustand Kontrollzellen auch verwendet werden, der nuklearen ppi unter normoxiezustand Bedingungen zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Prof. Assoc. Sin Tiong Ong für die Nutzung der Hypoxie-Workstation. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die folgenden: Singapore Ministry of Education, MOE 1T1-02/04 und MOE2015-T2-2-087 (, Y.A), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Gründungshilfe M4230003 (um Sokolov), der schwedischen Forschungsrat der Erling Persson Familienstiftung, die Novo Nordisk Stiftung, die Stichting af Jochnick Foundation, die schwedische Diabetes Association, Scandia-Versicherungs-Gesellschaft, der Diabetes-Forschung und Wellness, Liegeplatz von Kantzow Stiftung, die Strategische Forschungsprogramm bei Diabetes am Karolinska Institutet, der ERC ERC-2013-AdG-338936-Betalmage, und Knut und Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
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