Summary

בחיי עיר טכניקות הכלאה פרפין-מוטבע דגימות אלמוגים למבוגרים

Published: August 31, 2018
doi:

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לבצע הכלאה בחיי עיר על דגימות אלמוגים מבוגרים שמוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. זוהי שיטה איכותי המשמש כדי להמחיש את הביטוי המרחבי לווין אנטי-חוש RNA ברקמות פרפין-מוטבע.

Abstract

אלמוגים הם אוקיינוס חשוב חסרי חוליות קריטית לבריאות הכללית של האוקיינוס, כמו גם בריאות האדם. עם זאת, בשל בהשפעה האנושית כגון עליית הטמפרטורות התחמצות, אלמוגים הם יותר ויותר תחת איום. כדי להתמודד עם האתגרים הללו, ההתקדמות התא וביולוגיה מולקולרית הוכיחו להיות חיונית לאבחון הבריאות של אלמוגים. שינוי כמה מן הטכניקות הנפוצות ברפואה האנושית יכולה לשפר באופן ניכר של חוקרים היכולת לטפל ולשמור אלמוגים. כדי לטפל בבעיה זו, עבור בחיי עיר הכלאה בעיקר בשימוש ברפואה האנושית וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית פרוטוקול כבר מותאם לשימוש באלמוגים למבוגרים תחת לחץ.

מטרת שיטה זו היא להמחיש את הביטוי המרחבי של בדיקה RNA ברקמת האלמוג למבוגרים יש כבר מוטבע פרפין, למחלקה על גבי מדרון זכוכית. שיטה זו מתמקדת הסרת פרפין, התייבשות של המדגם, רעלני לדוגמה כדי להבטיח חדירות של המדגם, הכלאה קדם דגירה, הכלאה של המכשיר RNA, הפריט החזותי של המכשיר RNA. זוהי שיטה חזקה בעת שימוש אורגניזמים שאינם-דגם לגלות שבו באים לידי ביטוי גנים ספציפיים, הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות עבור אורגניזמים אחרים שאינם-מודל. עם זאת, השיטה זו מוגבלת כי זהו בעיקר איכותיים, כי עוצמת הביטוי יכול להשתנות בהתאם כמות הזמן בשימוש במהלך השלב חזותי וריכוז של המכשיר. יתר על כן, סבלנות נדרשת, כמו פרוטוקול זה יכול לקחת עד 5 ימים (וגם במקרים רבים, ארוכים יותר) בהתאם המכשיר בשימוש. לבסוף, צביעת הרקע שאינם ספציפיים שכיחה, אך ניתן להתגבר על מגבלה זו.

Introduction

האלמוגים הם בוני המערכת האקולוגית קריטי וחשוב עבור מגוון ביולוגי האוקיינוס ובריאות האדם-1,2,3. הם תחת איום בשל שינויי האקלים ואת שאר גורמי אנתרופוגניים, אלמוג מינים רבים נחשבים בסכנת הכחדה חמורה. לפיכך, יש צורך בכלים תאית ומולקולרית לאבחן אלמוגים תחת לחץ משמעותי. בנוסף, יש קצת מובנת על שבו גנים מבוטאים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים, ולכן מעט הבנה של הפונקציות של גנים אלה. כדי לטפל בבעיה זו, אנחנו הסתגלו בחיי עיר הכלאה (איש) הפרוטוקול, נפוץ האנושי רפואה וביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, לשימוש על דגימות רקמה פרפין-מוטבע של אלמוגים למבוגרים. טכניקה זו היא עוצמתי ביותר כאשר משתמשים באלמוגים מבוגרים שעברו אירוע מלחיץ כגון חשיפה עומס חום. עם זאת, טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של רקמות, שלבי החיים באלמוגים, אינה מוגבלת רק אלמוגים הדגיש חום4,6,7. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו על רקמות או תאים של כל metazoan כל עוד יש cDNA רצף מידע זמין.

מטרת שיטה זו היא להמחיש RNA הגששים בתוך רקמת האלמוג למבוגרים יש כבר נשמר, המוטבעות פרפין, למחלקה על שקופיות. שיטה זו היא כלי אבחון רב עוצמה המאפשר הפריט החזותי של חומצות גרעין בתוך רקמת האלמוג למבוגרים. בתחילה שיטה זו פותחה עבור אבחון רפואי, זה ומאז הפך להיות כלי פופולרי בתחומים כגון ביולוגיה התפתחותית ביולוגיה אבולוציונית התפתחותית8,9,10. איש גם שיטה קריטי, במיוחד במערכות שאינן-דגם, כאשר גנומית, transcriptomic רצף נתונים זמינים אך דפוסי ביטוי מרחבי הגן אינם ידועים. לעבודה האבחון במערכות שאינן-דגם, טכניקה זו היא חזקה כי זה יכול לציין אילו תאים ורקמות אקספרס הגן עניין והוא יכול להוביל יותר ממוקד גישות טיפוליות8,9,10, 11,12. לבסוף, טכניקה זו היא חזקה יותר כאשר יחד עם נתונים של ביטוי כמותי ג’ין11וכמותיים.

הגישה המתוארים במאמר זה יהיה עניין החוקרים כבר עיצבו את digoxigenin (מחדירים)-הנקרא RNA בדיקה (הגיוני והן antisense הגששים) והם עכשיו מוכן לבצע בחיי עיר הכלאה של הגששים מדגם. כדי לבצע בשיטה זו, יהיה צורך שני מקטעי רקמה פרפין אלמוג טורי עבור כל בדיקה הנבדקת. מקטע אחד ישמש עבור המכשיר הגיוני והשני עבור המכשיר antisense. החללית הגיוני יהיה פקד כדי לציין מחייב שאינם ספציפיים. אם צביעת הוא ציין את הגשוש הגיוני, ואז המכשיר antisense אינה ספציפית הרנ א עניין. הגששים יכולים מיועד לכל הגן בא לידי ביטוי. פרוטוקול זה, מספר דוגמאות משמשים שנמצאו קודם לכן לבוא לידי ביטוי במהלך עומס חום באלמוגים: FBJ אוסטאוסרקומה מאתר אונקוגן ויראלי homolog B (פוס-B), מפעיל חלבון (AP1), גידול נקרוזה מקדם קולטן 41 (TNFR 41)11. איש באמצעות התווית על-ידי החפירה RNA הגששים היא עדיפה על שימוש רדיואקטיבי הגששים כי הטיפול הוא הרבה יותר בטוח10. בנוסף, טכניקה זו היא רגישה מאוד, ניתן לבצע מגוון רחב של רקמות העוברים מעבר חום הדגיש אלמוגים למבוגרים13,14,15,16.

Protocol

1. הסרת פרפין שים לב: בצע את השלבים הבאים תחת ברדס fume. Dewax דק-למחלקה פרפין-מוטבע השקופיות. עם 100% קסילן מתחת למכסה המנוע בצנצנות זכוכית Coplin למשך 10 דקות. אל תשתמש/י צנצנות פלסטיק Coplin, כפי קסילן נמס פלסטיק. לעקר את הצנצנות Coplin ב החיטוי לפני השימוש. הכינו ארבע צנצנות זכוכי?…

Representative Results

לאחר השלמת פרוטוקול זה, זיהוי של תאים ורקמות כי הם ביטוי החללית RNA עניין תושג. התוצאות נציג עבור פרוטוקול זה מיועדות AP-1, FosB ו- TNFR41. התוצאות, שפורסמו קודם לכן על ידי טריילור-נואלס. et al. 11, הצג ביטוי מרחבי של RNA רגשים על אלמוגים למבוגרים זה נחשפו עומס חום. שתי דו…

Discussion

השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה השתנה מהעבודה הקודמת מחקר התפתחותי רפואי ואבולוציוני8,9,10,12,17. פרוטוקול זה מתמקד הניואנסים של הכלאה בחיי עיר גשש אנטי-תחושה RNA התווית על-ידי לחפור על מבוגרים אלמוגים, א?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומן על ידי פרס אין. OCE-1323652 דרך no.1012629 הלאומי למדע קרן האוקיינוס המדע בתר ופרס מתוכנית בורוז Wellcome קרן פוסט-דוקטורט העשרה.

Materials

Denhardt's solution Affymetrix 70468 50 ML
Bioworld Alkaline phosphatase buffer Fisher 50-198-724
Slide mailers Fisher 12-587-17B
Bioworld Alkaline phosphatase buffer Fisher 50-198-724
50 mL Falcon tubes Fisher 14-959-49A
UltraPure Salmon Sperm DNA solution Invitrogen 15632-011
PBS – Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Invitrogen AM9625
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL Invitrogen 10977-023
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water, 10 x 500 mL Invitrogen 10977-023
UltraPure Salmon Sperm DNA solution Invitrogen 15632-011
Slide white apex superior adhesive Leica Biosystems 3800080
PBS solution, pH 7.4 Life Technologies 10010072
Proteinase K, Molecular Grade, 2 mL New England Biolabs P8107S
Super Pap Pen Liquid Blocker Promega 22309
DIG Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments Roche 11093274910
BM Purple, 100 mL Roche 11442074001
DIG Wash and Block Buffer Set Roche 11585762001
NBT/BCIP Roche 11681451001
Formaldehyde solution, 500 mL size Sigma-Aldrich 252549-500ML
SSC Buffer 20X concentration Sigma-Aldrich S6639-1L
Acetic Anhydride Sigma-Aldrich 320102-100ML
Formamide Sigma-Aldrich 47670-250ML-F
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279-100ML
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
Xylenes, AR (ACS), For Histological Use VWR MK866806
Ethanol VWR EM-EX0276-4S
TE buffer VWR PAV6232
hybridization oven VWR 97005-252, 97005-254
Orbital shaker VWR 89032-088

References

  1. Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933 (2003).
  2. Chen, P. -. Y., Chen, C. -. C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
  3. Hoegh-Guldberg, O., et al. Coral Reefs Under Rapid Climate Change and Ocean Acidification. Science. 318 (5857), 1742 (2007).
  4. Grasso, L. C., et al. Microarray analysis identifies candidate genes for key roles in coral development. BMC Genomics. 9 (1), 540 (2008).
  5. Miller, D. J., et al. The innate immune repertoire in Cnidaria – ancestral complexity and stochastic gene loss. Genome Biology. 8 (4), R59 (2007).
  6. Shinzato, C., Iguchi, A., Hayward, D. C., Technau, U., Ball, E. E., Miller, D. J. Sox genes in the coral Acropora millepora: divergent expression patterns reflect differences in developmental mechanisms within the Anthozoa. BMC Evolutionary Biology. 8 (1), 311 (2008).
  7. Anctil, M., Hayward, D. C., Miller, D. J., Ball, E. E. Sequence and expression of four coral G protein-coupled receptors distinct from all classifiable members of the rhodopsin family. Gene. 392 (1-2), 14-21 (2007).
  8. Darby, I. A., Hewitson, T. D. . In situ hybridization protocols. , (2006).
  9. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization. , (1987).
  10. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  11. Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals. Journal of Experimental Biology. 220 (10), (2017).
  12. Wolenski, F. S., Layden, M. J., Martindale, M. Q., Gilmore, T. D., Finnerty, J. R. Characterizing the spatiotemporal expression of RNAs and proteins in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. Nature Protocols. 8, 900 (2013).
  13. Schnitzler, C. E., Simmons, D. K., Pang, K., Martindale, M. Q., Baxevanis, A. D. Expression of multiple Sox genes through embryonic development in the ctenophore Mnemiopsis leidyi is spatially restricted to zones of cell proliferation. EvoDevo. 5 (1), 15 (2014).
  14. Traylor-Knowles, N. G., Kane, E. G., Sombatsaphay, V., Finnerty, J. R., Reitzel, A. M. Sex-specific and developmental expression of Dmrt genes in the starlet sea anemone, Nematostella vectensis. EvoDevo. 6 (1), (2015).
  15. Barry, S. N., Crow, K. D. The role of HoxA11 and HoxA13 in the evolution of novel fin morphologies in a representative batoid (Leucoraja erinacea). EvoDevo. 8 (1), 24 (2017).
  16. Sharma, P. P., Gupta, T., Schwager, E. E., Wheeler, W. C., Extavour, C. G. Subdivision of arthropod cap-n-collar expression domains is restricted to Mandibulata. EvoDevo. 5 (1), 3 (2014).
  17. Piatigorsky, J., Kozmik, Z. Cubozoan jellyfish: an Evo/Devo model for eyes and other sensory systems. The International Journal of Developmental Biology. 48 (8-9), 719-729 (2004).

Play Video

Cite This Article
Traylor-Knowles, N. In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples. J. Vis. Exp. (138), e57853, doi:10.3791/57853 (2018).

View Video