Summary
שיטה שאינה שכותרתו, הלא-רדיו-איזוטרופי DNA פולימראז הגהה ואת וזמינותו תיקון של ה-DNA פותחה באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF ברזולוציה גבוהה ואסטרטגיה סיומת נוקלאוטיד יחיד. וזמינותו הוכיחה להיות מאוד ספציפי, פשוט, מהיר וקל לבצע הגהה ותיקון טלאים קצר מ 9-נוקלאוטידים.
Abstract
שמירה על הגנום ושכפול הנאמן שלה הוא בעל חשיבות עליונה לשימור מידע גנטי. כדי להעריך שכפול דיוק גבוה, פיתחנו פשוטה שאינה שכותרתו, השיטה הלא-רדיו-איזוטרופי באמצעות יינון desorption של מטריצה בסיוע לייזר עם הזמן-של-טיסה (MALDI-TOF) מסה ספקטרומטר (MS) ניתוח של מחקר ההגהה. כאן, על ה-DNA פולימראז [למשל, הרסיס Klenow (KF) של Escherichia coli DNA פולימראז אני (pol אני) במחקר זה] בנוכחות כל ארבע dideoxyribonucleotide triphosphates משמש לעיבוד דופלקס פריימר תואמים-תבנית. פריימר לא תואמת זה ואז הגהה/מורחב, נתון MALDI-TOF MS. המוצרים נבדלים על ידי השינוי המונית של ומהצמיגים עד וריאציות נוקלאוטיד יחיד. חשוב, הגהה גם ניתן לקבוע לאי-התאמות רווקה פנימי, אף על פי-יעילות שונות. אי-התאמות ממוקם ב 2-4-נוקלאוטידים (nt) מקצה 3' היו ביעילות בצע הגהה על-ידי pol, והראה אי-התאמה בחמש nt שהמסוף פריימר תיקון חלקי בלבד. הגהה לא אירעה לאי-התאמות פנימי הממוקם ב 6-9 nt מסוף 3' פריימר. בשיטה זו ניתן גם ליישם מבחני תיקון ה-DNA (למשל, הערכת תיקון בסיס-הנגע של סובסטרטים עבור מסלול תיקון אנדו V). תחל המכיל 3' deoxyinosine הלפני אחרון (dI) נגעים יכול יתוקן על ידי pol אני. אכן, T הלפני אחרון-אני, G-שאני, א-אני סובסטרטים היה האחרון שלהם נוקלאוטידים המכילות dI 2 טוחנות ידי pol אני לפני הוספת של ddN נכונה 5'-monophosphate (ddNMP) תוך C הלפני אחרון-אני אי-התאמות היו נסבל על ידי pol אני, המאפשר את המפתח להאריך ללא תיקון, הממחיש הרגישות ואת הרזולוציה של MS assay כדי למדוד את תיקון ה-DNA.
Introduction
הפונקציות ההגהה של ה-DNA polymerases במהלך שכפול ה-DNA חיוניים על מנת להבטיח את אמינות גבוהה של מידע גנטי שצריך להעביר רומא1,2,3,4, 5,6,7. היכולת להעריך את תרומתם של פולימראז הגהה exonucleases להבהיר את מנגנוני שמירה על יציבות גנטית.
תיוג radioisotope, מבוסס על ג'ל מבחני בשילוב עם ניתוח densitometric של autoradiograms או זרחן-9,8,-דימות-10 באופן מסורתי שימש כדי לזהות פעילות ההגהה של דנ א polymerases. בעוד פונקציונליים, מבחני אלה הם מפרך, יקר, לא נוטה תבניות תפוקה גבוהה. בנוסף, רדיואיזוטופים סובלים סוגיות בטיחות כולל לסילוק פסולת. לחלופין, יש פעילויות ההגהה נותחו על ידי טכניקות fluorometric. לדוגמה, 2-aminopurine (2-AP) ניתן לשלב מוצרים להרחבת במהלך במבחנה פולימראז הגהה מבחני לייצר אות ניאון11,12. למרבה הצער, גישות אלה סובלים ירידה לפרטים נמוך, מאז 2-AP ניתן לשייך עם תימין וגם ציטוזין. גישות עדכניות יותר כוללים מכשיר רגיש G-quadruplex מבוססי זורח מתג-על בדיקה עבור פולימראז 3' - 5' אקסונוקלאז assay13 , כמו גם בדיקה פלורסנט שכותרתו ביחידים עבור פולימראז הגהה assay מתגבר על חלק החסרונות הנ ל14. להתלהבות שיטות fluorometric אלה פוחתת עקב הצורך תיוג ספציפית של ה-DNA סובסטרטים.
לעומת זאת, MS MALDI-TOF עבור ניתוח הדנ א ננקטה וזמינותו לאתר במדויק, שבו התגובות הארכת תחל עם תווית ddNTPs 4 יכול לשמש כדי לזהות פולימורפיזמים בגיל16,15,לוקוס נתון17 ו אומצה באופן נרחב ביישומים רפואיים עבור גילויים מוטציה, סרטן המאבחן18. באמצעות עקרונות בסיסיים אלה, יצרנו assay ללא תווית מצפני במבחנה DNA פולימראז הגהה פעילות מנצלים ברזולוציה גבוהה, ירידה לפרטים גבוה, ופוטנציאל תפוקה גבוהה של גב' MALDI-תוף שימוש אי קולי DNA פולימראז אני Klenow קטע כמו אנזים מודל, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) כפי סובסטרטים יכולים לקחת את "snapshot" של הגהה מוצרים לאחר נוקלאוטיד יחיד סיומת ויה MALDI-TOF MS (איור 1).
באופן דומה, שיטה זו גם פותחה עבור assay תיקון ה-DNA איפה תחל המכיל 3' dI הלפני אחרון נגעים ותוחלת של פול פוט שאתקן assay intermediates תיקון V עצור אשר מחקה אנדו. אמנם לא לגמרי מובן, מסלול תיקון אנדו V הוא מערכת תיקון היחיד הידוע להעסיק את פול פוט אני הגהה אקסונוקלאז פעילות הנגע כריתה19,20. באמצעות MALDI-TOF MS, נראה טלאי תיקון מוגדרים בבירור איפה אפשר להוציא dI ידי pol אני מתי המתרחשים את ה 2 האחרונים nt של פריימר לפני הוספת נוקלאוטיד המלווים את הנכון.
לצורך המחקר הגהה ותיקון דנ א, שיטה זו מייגעת פחות מאשר שיטות קודמות ומהירה והיא מספקת מידע נוסף לכיוון מנגנון ותפקוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פריימר/תבנית הכנה
- עיצוב תחל/תבניות עם תוכן G + C מאוזנת בין 40% ל-60% כמו רצף או עיצוב תחל ה-PCR. השתמש תחל של 18-21 nt של חישול המתאים ואת אותות MS טובים יותר.
- עיצוב התבנית על-ידי הגדרת 50 ° C כמו המינימום נמס בטמפרטורה עבור האזור דופלקס לפחות 7 nt של 5'-הבליטה כדי להפריד את האותות בין תחל את התבנית.
הערה: לדוגמה, עבור המצע P21/T28 טבלה1, 21-nt ומהצמיגים מזווג עם תבנית 28-nt. אפשרות: השימוש של חומצות גרעין חלופיים כגון אגרות חוב עמידים נוקלאז phosphorothioate להחליף את הקשרים phosphodiester ל4 בקצה 3' של התבנית יכול למנוע הפרעות אפשריות על-ידי שאינם ספציפיים 3' סוף הפירוק של התבניות ( למשל, T28S4, טבלה 1), אם כי זה יוסיף כמה עלות עבור הכנת תבנית. - שימוש oligonucleotides desalted רגיל ללא טיהור נוספות הוא משביע רצון במחקר זה. השתמש oligonucleotide תחל/תבניות-ריכוז של 100 pmol/µL H2O כמו מניה ואחסן אותו ב-20 ° C. בדקו את האיכות ואת הטוהר של צבעי יסוד, תבניות על-ידי הפעלת את oligonucleotides על MALDI-TOF MS (שלבים 4-7) כדי להבטיח שיא ייחודי אותות אות לרעש יחס טוב.
- לקבוע יחסי MALDI-TOF MS אות עוצמות (שלב 7) תחל טוחנת שווה הרצפים הרלוונטיים בעקבות התגובות עבור נרמול כיול וריכוז (איור 2).
2. הגהה תגובות
הערה: באותו מצב התגובה ההגהה ואת פרוטוקול חלה על תיקון ה-DNA של A-אני, G-אני, C-אני, ו- T-אני.
- באמצעות התאמה T-G של מצע P21/T28 להגהת טבלה 1 כדוגמה, לדלל פריימר P21, תבנית T28 12.5 pmol/µL עם H2O; ואז להעביר µL 12 של ומהצמיגים מדולל, µL 12 של התבנית מדולל לרכבת התחתית microcentrifuge סטיריליים 1.5-mL.
הערה: כמות תבנית/פריימר מיקס מספיקה עבור תגובות 2; פרופורציונלית להגדיל את הנפח של ריאגנטים בהתאם לתגובות מרובים. - סגור את הצינור בחוזקה. דגירה זה במשך 30 דקות באמבט מקורה 65-° C מים, ואחריו 30 דקות בתוך אמבט מים 37-° C, ולבסוף על קרח כדי להבטיח ריפוי תקין.
- לרכבת התחתית microcentrifuge סטיריליים 1.5-mL, להוסיף µL 8 של פריימר, תבנית מיקס (50 pmol), 2 µL של 10 x הגהה התגובה מאגר, µL 4 של מיקס 4 ddNTPs (2 מ מ של כל dNTPs 4), ו- H2O עד 18 µL. לסתור את הצינור כדי לערבב.
הערה: 1 x ההגהה התגובה המאגר מכיל 50 מ"מ NaCl, 10 מ מ MgCl2, dithiothreitol 1 מ"מ ו- 10 מ"מ טריס-HCl (pH 7.9 25 ° c). ראה את הטבלה של חומרים עבור המקור מסחרי של 10 x הגהה מאגר התגובה. הריכוז הסופי של כל ddNTP ב התגובה הוא 0.1 מ מ. - לדלל DNA פולימראז 1 קרה כקרח x הגהה התגובה מאגר לריכוז הרצוי [למשל, כדי צינור 1.5-mL microcentrifuge, להוסיף 4 µL 1 x הגהה התגובה מאגר ו- 1 µL של 5-U פולימראז Klenow ממקור מסחרי (טבלה של Materials)]. אחסן את האנזים מדולל על קרח בכל עת.
הערה: כמות מדולל DNA פולימראז מספיקה עבור תגובות 2; פרופורציונלית להגדיל את הנפח של האנזימים בהתאם לתגובות מרובים. נפח של µL 2.0, המכילה יחידות 2.0 של פולימראז Klenow, ניתן בצע הגהה יותר ממחצית pmol 50 של T-G מסוף תואמים P21/T28 ב 5 דקות. - Prewarm ברכבת התחתית microcentrifuge עם המיקס המצע מהשלב 2.3 לטמפרטורה התגובה הרצויה (לדוגמה, בדרך כלל 37 ° C עבור Klenow פולימראז ו- 25 ° C עבור T4 DNA פולימראז). לאחר מכן העברה µL 2.0 של פולימראז מדוללת ה-DNA מ שלב 2.4 לתערובת המצע prewarmed, קפיצי צינור כדי לערבב את תוכנו.
- Centrifuge הצינורות עם אנזים, המצע למשך כמה שניות ב g x 3,200 בטמפרטורת הסביבה לסובב את הרכיבים של התגובות. להעביר מיד את התגובה בלוק חימום או באמבט מים בטמפרטורה הרצויה הדגירה כמו שלב 2.5.
-
לסיים את התגובה
- הוסף אמצעי שווה של פנול במאגר, לערבב את זה על-ידי vortexing לכמה שניות, centrifuge זה ב microcentrifuge ב g x 3,200 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- להעביר את פאזה מימית צינור נקי microcentrifuge, להוסיף אמצעי שווה של כלורופורם, לערבב את זה על-ידי vortexing במשך כמה שניות ולהעביר צנטריפוגה אותו microfuge ב g x 3,200 בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות השלב מימית כדי צינור נקי microfuge ב cubate זה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; אז במקום זה על קרח.
התראה: פנול כלורופורם הינם כימיקלים מסוכנים. סילוק פסולת ועל לטיפול פעל על פי תקנות מוסדיים.
- להעביר את פאזה מימית צינור נקי microcentrifuge, להוסיף אמצעי שווה של כלורופורם, לערבב את זה על-ידי vortexing במשך כמה שניות ולהעביר צנטריפוגה אותו microfuge ב g x 3,200 בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות השלב מימית כדי צינור נקי microfuge ב cubate זה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; אז במקום זה על קרח.
- לחלופין, השתמש חומצת שכבתה פרוטוקול. בשביל זה, להוסיף 2 µL של HCl M 1 כדי לעצור את התגובה על קרח במשך 6 דקות, ולאחר מכן להוסיף 0.64 µL של 1 מ' diethanolamine (DEA) כדי לנטרל את ה-pH של תערובת התגובה ואת דגירה זה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; אז במקום זה על קרח.
- הוסף אמצעי שווה של פנול במאגר, לערבב את זה על-ידי vortexing לכמה שניות, centrifuge זה ב microcentrifuge ב g x 3,200 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
3. שרף תוספת לחסל זיהום מלח
- באמצעות הסיפור שרף בלבד desalting מסחרית קיט (ראה את הטבלה של חומרים), לקחת שרף מספיק כדי לכסות את הגומות של צלחת גומת חן שרף 384-גומת חן, 6 מ ג.
- פזר השרף על פני כל גומות הן באופן שווה (6 מ ג/גומת חן) על ידי גירוד לרוחב החלק העליון של הלוח. שחזור שרף עודף ולהחליף אותו בבקבוק.
- להעביר את המוצרים התגובה האחרונה מ צעד 2.7 מן הצינורות microfuge צלחת 384-. טוב. לוותר על µL 16 של H2O כדי לדלל את המוצרים תגובה סופית מכל קידוח ואז לאטום את הצלחת, centrifuge זה כדי להסיר את כל הבועות.
- להסיר את החותם, להפוך את הצלחת 384-ובכן עם המוצרים תגובה הפוך כדי לכסות את הצלחת גומת חן מלא שרף.
- להפוך את הכריך טוב-כדי-גומת חן צלחות ולתת בקפידה השרף לתוך הצלחת 384-טוב (ודא הצלחת 384-ובכן מיושר נגד יתדות מתכת על הצלחת גומת חן מלא שרף).
- הסר את לוחית גומת חן על העליונה, לאטום את הצלחת 384-ובכן המכיל את תערובות של המוצרים התגובה, שרף, בקצרה centrifuge זה ב g 3,200 x כדי להסיר את כל הבועות ומניחים אותו על rotator לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר במשך desalting את תוכנו.
- לאחר הניקוי שרף, centrifuge את הצלחת 384-ובכן-g 3,200 x עבור 5 דקות כדי לדחוס השרף לתחתית הבארות.
4. להעביר את התגובה מוצרים ל צ'יפ מטריקס
- הניח את הצלחות מדגם במתקן nanoliter (nanodispenser, לראות את הטבלה של חומרים).
- לשים צ'יפ המטריקס (ראה את הטבלה של חומרים) של צלחת 384-ובכן מהסעיף 3.7 במגש המתאימים.
- להפעיל את nanodispenser כדי לזהות את המוצרים התגובה לשבב; לחצו על הכפתור הפעל במסך המגע של nanodispenser להתחיל.
- הסימון בתמונה שנלכדה אוטומטית נקודות דגימה המכיל מידע רוויה על המסך כדי להבטיח את אמצעי האחסון המאותר הכללי על השבב הוא סביב 5-10 nL. חזור על הדגימה את סיכוייכם אם אמצעי האחסון אינו מספיק.
5. הגדרת המידע וזמינותו ספקטרומטר מסה
- להכין קובץ בתבנית. xls המכילה את המידע אות הצפויה עבור ייבוא. לדוגמה, השתמש בהגדרה של "P21_T28.xls" (טבלה 2) עבור התגובה ההגהה של P21/T28 שלבים 2, 3 ו- 4.
- ליצור ולהגדיר וזמינותו חדש בתוכנית היישום (ראה את הטבלה של חומרים) על ידי לחיצה ימנית על קבוצת Assay ייבוא בתבנית מעצב ובחר את קובץ xls (למשל, "P21_T28.xls" מ שלב 5.1).
- לקבוע את היעד assay צלחת דרך העץ באפשרות הלקוח: פרוייקט: צלחת בצד שמאל של המסך על ידי לחיצה ימנית על החלק העליון של העץ. ולתת אותו שם קובץ (למשל, "CTT20171201" מייצג את קוד assay והתאריך).
- בחר את סוג 384-ובכן צלחת ולחץ על אישור; צלחת ריקה תופיע.
- בחר את הבדיקה המתאימה (לדוגמה, P21_T28) בצד שמאל של המסך.
- להקצות וזמינותו הנבחר (למשל, P21_T28) עבור כל דגימה הבחין מיקום הדגימה את השבב על ידי הדגשת הבאר ואת לחיצה ימנית כדי לבחור להוסיף ה-Plex.
- הכינו רשימה העבודה של כל הבדיקות על השבב בתבנית. xlsx עם אין כותרת (למשל, 1201.xlsx של טבלה 3). יבא את העבודה ברשימה באמצעות האפשרות להוסיף פרוייקט מדגם חדש .
- להקצות לכל תפקיד של וזמינותו P21_T28 הבדיקה ברשימת העבודה (למשל, מ- 1201.xlsx), לבחור על ידי לחיצה ימנית.
6. MALDI-TOF MS מבצע
- לקשר את ספקטרומטר מסה השבב באמצעות תוכנית היישום (ראה את הטבלה של חומרים).
- בחר את הגדרת ברירת המחדל בצד ימין של המסך.
- מלאו את השם assay מהשלב 5.3 (למשל, CTT20171201), צ'יפ מזהה בפינה של השבב, ושמור את ההגדרות.
- הפעלת התוכנית שליטה MS (ראה את הטבלה של חומרים).
- לחץ על לחצן וצ'ק אאוט , להוציא את הצלחת הצופים. מקם את השבב הבחין מהשלב 4.4 לצלחת הצופים ולחץ על לחצן וצ'ק אאוט עבור השבב הבחין להזין את ספקטרומטר מסה.
- לחץ על הלחצן ייבוא של תוכנית היישום (ראה הטבלה של חומרים) כדי להתחיל את ספקטרומטר מסה ולרכוש נתונים.
7. ניתוח נתונים
- פתח את התוכנית עבור ניתוח הנתונים (ראה טבלה של חומרים).
- לעיין בעץ של מסד הנתונים על הפינה השמאלית העליונה, בחר את מזהה שבב מ שלב 6.3. פתח את קובץ הנתונים בצד ימין של המסך.
- לחץ על הסמל ' ספקטרום ' כדי להציג את הספקטרום המוני. כדי לחתוך טווח מסוים של m/z, לחץ לחיצה ימנית בחר הדו-שיח התאמה אישית , בחלון חדש לחץ על ציר ה-x ואת הגדרת הגבול העליון והתחתון הרצוי ולחץ אישור כדי להציג את טווח שצוין של הספקטרום.
- לייצא את הספקטרום עבור שמירת בלחיצה ימנית לייצארשומות.
הערה: באמצעות סרגל יחידת רוחב/1,200 1,600 הוא גודל סביר עבור בדיקת הנתונים על גבי מסך מחשב.- בחר את סוג הקובץ JPEG, לחץ על היעד, בחר דיסק עיון (למשל, דיסק פלאש: E), הקלד את שם הקובץ (לדוגמה, 1201-1.jpg) ולאחר ולאחר מכן לחץ על ייצוא.
- עבור כימות הנתונים, השתמש הסמן ולחץ על הפסגה להראות את גובה שיא בפינה השמאלית העליונה.
- לחלופין, להדפיס קובץ JPEG המיוצאת ומדידת הגובה שיא עם סרגל באופן ידני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תבניות, תחל:
באמצעות ההליך שהוצגו כאן, שווים oligonucleotide סינתטי טוחנת תבניות וכל תחל הרצפים הרלוונטיים שהושג ממקורות מסחריים שנבדקו טוהר והאיכות שלהם (איור 3A; הערה שהסימנים מתאימים המסה המיועד ואת הרקע נמוך) כמו גם עבור הקשר בין עוצמת שיא המסה analyte (איור 2 א). הגולן השיא היו מדודים ומחושבים (איור 2B) עבור נירמול הנתונים MS.
התגובה ספקטרה בתנאי והמסה:
השימוש של פריימר בסיס יחיד סיומת תגובות בשילוב עם MALDI-TOF MS עבור genotyping בעבר הוכח להיות ריאלי באמצעות מחסלים ddNTPs תקן17. וזמינותו ההגהה באמצעות תקן ddNTPs דומה לתגובה singleplex של genotyping אך היא הרבה יותר פשוטה וקלה מאוד שיש לבצע כדי להשיג תוצאות נקייה ואמינה.
ספקטרום MS כיסו את כל הסימנים המופקים תחל והן תבניות (איור 3). העיצוב הנכון של צבעי יסוד, תבניות שנוצרו פרופיל אות מופרדים היטב עבור התבניות את והן את צבעי יסוד (איור 3). לפי הערך מ/z, אותות תבניות ומוצרים שאינם ספציפיים השפלה חלקית שלהם (מ/z > 7,000) היו מופרדים היטב מ תחל לא תואמת ולעשות הגהה על מוצרים (מ/z < 7,000 באיור3). במידת הצורך, היכרות עם עמיד נוקלאז phosphorothioate אג ח כדי להחליף את הקשרים phosphodiester ל4 בקצה 3' של התבנית (טבלה 1; T28S4/P21) יכולים להפחית שאינם ספציפיים תבנית הידרוליזה (איור 3G; d27).
בהיעדר dNTPs, KF של החזקה 3'-אקסונוקלאז, הוא מסוגל משפילים את המפתח וגם את תבנית במבחנה21. כמו dNTPs 4, יליד התוספת של ddNTPs 4 מונע 3' סוף הפירוק על ידי KF (איור 3C ו- 3E). כנ ל, סיומת נוקלאוטיד אחד של 3'-. הקצוות-מוסיף יציבות מוגברת פריימר. באמצעות pol הגהה תנאים כאמור שתיארתי20 עם 10 U (46 pmol) KF, יותר מ- 80% מצעים 50-pmol לא תואמים תוקנו ב 5 דקות (איור 3C, 3Eו- 3g).
Intermediates וניתוח מנגנון:
רזולוציה MALDI-TOF MS יכול להיות בסדר כמו דלתון 1; אכן, כל סובסטרטים, מוצרים ו- intermediates בשינויים בנפח גדול בהתגובה ניתן לפתור בספקטרום MS זהה של הטווח הנבחר. לדוגמה, ב- T-G מסוף חוסר התאמה, G לא תואמת התחנה הסופית פריימר תוקנה עם שילוב של ddA עם הפרשי מ/z רק בן 32. כזה הבדל מ/z ניתן לזהות בקלות על הספקטרום MS בטווח מ/z מ 5,000 לגובה 7,000 (איור 4A). השינוי של כל אות בודדים יכול להיות מחושב על ידי סיכום כל אותות ומהצמיגים תואמים, intermediates כריתה, ולעשות הגהה על המוצרים כ- 100%. לדוגמה, ב- T-G התגובה ההגהה, המוצר המתוקן יחסית המוצר כריתה היה 23% לעומת 17% ב- 5 דקות, 31% לעומת 18% ב- 10 דקות ו 69% לעומת 14% ב- 20 דקות (איור 4A).
מתי אי-התאמה T-G הלפני אחרון קיים פריימר, את ה 2 האחרונים nt צריך להוציא ואחריו תוספת ddA כדי להשלים את התיקון. אכן, המוצרים הנכונים גדל עם הזמן של 12% ב- 5 דקות, 28% ב- 10 דקות, עד 45% ב 20 דקות של התגובה. בנוסף, שתי צורות של מוצרים כריתה T-G הלפני אחרון הגהה, המוצרים כריתה ביניים ו- 2-nt 1-nt כריתה, היו בקלות לזיהוי (איור 4B).
הגהה קינטיקה עם dNTP יחיד:
עבור e. coli DNA pol, ddNTPs אינם מתאימים מצעים ולא צריך להיחשב מעכבי22. לחלופין, באמצעות dNTP 'הנכון' יחיד של התגובה ההגהה במקום ישמיט גם שאינם ספציפיים אקסונוקלאז פעילות 3' - 5' של הדור של נוקלאוטיד יחיד סיומת מוצרים מתאימים לניתוח MS (איור 5B). שיעור ההגהה המתקבל תגובות המכילות dCTP יחיד הוא בערך שני פעמים גבוה יותר מאשר תגובות המכילות את ddNTPs 4 (איור 5A, 5B, ו- 5 C). לפיכך, השימוש dNTP 'הנכון' יחיד ב וזמינותו ההגהה מניבה תוצאה טובה יותר ללא תופעות המעכבת של ddNTPs. גישה זו צריך לספק רגישות להגהת ניתוחים קינטי.
הגהה של אי-התאמות פנימיים:
MS הגהה מבחני באמצעות KF אי-התאמות הפנימיים וזיהוי של מוצרים הגהה הם פשוט (כלומר, ההגהה אקסונוקלאז excises נוקלאוטידים מסוף 3' כדי ההתאמה הפנימית של תחל), ואחריו תוספת של ddNMP מתאימים כריתה מוצרים באמצעות יצירת פונקציה פולימראז הגהה מוצרים קצר יותר סובסטרטים פריימר (איור 6). נצפתה מגמה ברורה של הגהה יעילות, איפה KF ביעילות הגהה אי-התאמות האחרון, הלפני, 3rd ו 4 נוקלאוטידיםth מקצה 3' תחל (איור 6; MM1, 2, 3 ו- 4). התאמות-5 nt מקצה 3' ומהצמיגים תוקנו באופן חלקי עם < 15% של תיקון אי התאמה, > 15% מן המפתח הראה סיומת ללא הגהה (איור6; מודל MM5). KF נכשל לבצע הגהה אי-התאמות מוצב 6, 7, 8 ו- 9 nt מקצה 3' פריימר (איור 6; MM6, 7, 8 ו 9) אבל עדיין מורחב חלק ניכר מצעים (איור 6; PE של MM6, 7, 8 ו 9).
תיקון של הנגע deoxyinosine:
ב- e. coli, deoxyinosine בדנ א מעובד בעיקר על ידי20,23מסלול תיקון אנדו V. V אנדו יוזם את התגובה על ידי חתך-השני קשר פוספודיאסטרי 3' של הנגע dI. מעבר סטרנד שנוצר הוא האמין להיות בשימוש על ידי pol אני עבור כריתה של הנגע עוקבות ו- DNA resynthesis24. הליך זה היה מוחל על מבחן pol אתקן סובסטרטים המכיל dI באתר 3' הלפני אחרון (טבלה 1; -אני, C-אני, G-אני, ו- T-אני) כדי לאמת את השערה זו. התיקון של 3' די הלפני אחרון הוא אנלוגי לאופרטור הגהה לחוסר ההתאמה T-G הלפני אחרון (איור 4B ו- 6; ערך MM2), שבו את ה 2 האחרונים nt אמור להיות מוסר שהופעלו על ידי תוספת של ddNMP הנכון כדי להשלים את התיקון. דפוסי MS הראו בבירור pol תיקנתי heteroduplexes של A-אני, G-אני, ו- T-אני, אמנם עם יעילות שונות (איור 7; RP אותות). עם זאת, C-אני המצע היה דברים מעוותים פול פוט אתקן (טבלה 1 , איור 7D , 7-אי; RP נמוך מאוד) הדגימו את הארכת תחל במידה רבה (איור 7D; אות PE).
איור 1 . מודל המערכת להגהת assay. פריימר תואמים היה annealed כמצוין לתבנית ויוצרים חוסר התאמה מסוף (מודגש). הגהה אקסונוקלאז של ה-DNA פולימראז לזהות ולהסיר את נוקלאוטיד תואמים ויוצרים מוצר כריתה. בנוכחות של ה-DNA פולימראז ddNTPs ארבעה, המוצר כריתה מורחב על ידי בסיס יחיד משלים האתר הקודם לא תואמת. כאשר נתון MALDI-תוף, ההבדל במסה בין תחל לא תואמת את המוצרים כריתה, המוצרים proofread ניתן לפתור. (נתון זה ממאמרו של סו. et al. 25 בעלי הרשאה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . עוצמת שיא, oligonucleotide מסצ'וסטס Oligonucleotides 8 מ 17-24 nt עם רצפי משלימים 3' בסוף T28 (טבלה 1) נבדקו. (א) A תערובת של pmol 50 של כל oligonucleotide 40-µL פתרונות היה נתון לניתוח MS. Nt (B) גובה הפסגה 17 שימש 100% עבור החישוב. עוצמת האות יחסית עבור כל oligonucleotide הממוצע של שישה האישושים, קווי השגיאה לייצג סטיית תקן 1. (נתון זה ממאמרו של סו. et al. 25 בעלי הרשאה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . השפעת עיצוב תבנית שונים. תגובות ההגהה היו העריכו עם ומהצמיגים P21 ויוצרים חוסר התאמה מסוף T-G עם תבניות שונות. וזמינותו ההגהה בוצעה עם 10 U (43 pmol) Klenow פולימראז, המצע pmol 50, 4 ddNTPs ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק (A) לוח זה מציג את מצע P21/T32 T-G ללא אנזים. (B) לוח זה מציג סיומת פריימר של מצע א-P21/T32 על ידי 3' אקסונוקלאז לקוי Klenow. PE = פריימר הרחבת המוצר. (ג) לוח זה מראה על הגהה של המצע P21/T32 T-G. PP = מוצר ההגהה; d26, d27, d28 = 3' תבנית מושפל-סוף. (ד) לוח זה מציג את מצע P21/T28 T-G ללא אנזים. (E) לוח זה מראה על הגהה של המצע P21/T28 T-G. PP = מוצר ההגהה; d26, d27 = 3' תבנית מושפל-סוף. (F) לוח זה מציג את מצע P21/T28S4 T-G ללא אנזים. (G) לוח זה מראה על הגהה של המצע P21/T28S4 T-G. PP = מוצר ההגהה; EP = כריתה מוצרים; d27 = תבנית השפלה נילווה. (נתון זה ממאמרו של סו. et al. 25 בעלי הרשאה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . הגיע הזמן קורס ניתוח כריתה מוצרים ומוצרים ההגהה. מבחני ההגהה בוצעו עם 2 U (8.6 pmol) KF ותערובות pmol 50 כפי שמתואר בפרוטוקול. התגובות היו מתרצה הצביעו פעמים. (א) לוח זה מראה על הגהה של 3' מסוף T-G אי-התאמה; EP = מוצר כריתה ההגהה; d18 & d19 = עודף כריתה תוצרי לוואי; PP = מוצרים ההגהה; P21 = פריימר לא תואמת. (B) לוח זה מראה על הגהה של אי-התאמה T-G 3'-הלפני; EI-1 = כריתה ביניים; EP-2 = מוצרים כריתה ההגהה; d18 = לוואי כריתה עודף; PP = מוצרים ההגהה; P21 = פריימר תואמים; נה = נתרן יון מאוגד נוקלאוטידים. (נתון זה ממאמרו של סו. et al. 25 בעלי הרשאה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . הגהה התגובה עם 4 ddNTPs לעומת dNTP יחיד. מבחני ההגהה בוצעו עם 0.1 U (0.43 pmol) KF ותערובות pmol 50 כפי שמתואר בפרוטוקול. התגובות היו מתרצה הצביעו פעמים. (א) לוח זה מראה על הגהה של 3' מסוף G-G חוסר התאמה עם 4 ddNTPs; EP = מוצר כריתה ההגהה; PP = מוצרים resynthesis ההגהה; P21G = פריימר לא תואמת. (B) לוח זה מראה על הגהה של 3' מסוף G-G חוסר התאמה עם dCTP; PP = מוצרים resynthesis ההגהה; P21G = פריימר לא תואמת. (ג) התיקון רמות הממוצע של שלוש האישושים, קווי השגיאה מייצגים סטיית תקן 1. נה+ = נתרן יון מאוגד נוקלאוטידים. (נתון זה ממאמרו של סו. et al. 25 בעלי הרשאה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . הגהה של אי-התאמות פנימי. מבחני ההגהה בוצעו עם 2 U (8.6 pmol) Klenow פולימראז ותערובות pmol 50 ב- 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, כמפורט בפרוטוקול. ריק = אנזים ריק של מצע MM1. MM1 = מצע P21/T28 T-G; MM2 כדי MM9 = מצעים עם הבדלים פנימיים, המספרים מציינים את המיקום אי התאמה ביחס קצה 3'. P21 = תחל תואמים; יחסי ציבור = הגהה מוצרים; PE = תחל המורחבת; d19 ו d20 = תוצר לוואי של עודף כריתה, המספרים מייצגים את הגודל של נוקלאוטידים. (נתון זה ממאמרו של סו. et al. 25 בעלי הרשאה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 . תיקון נגעים deoxyinosine הלפני אחרון 3'- תיקון מבחני בוצעו עם 2 U Klenow פולימראז ותערובות pmol 50 ב- 37 מעלות צלזיוס, כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 2.3. התגובות היו מתרצה הצביעו פעמים. מראות אלו תגובות עם (A) T-אני המצע; (B) G-אני המצע; (ג) A-אני המצע; ו- (ד) ג-אני המצע. RP = תיקון מוצרים; EP = כריתה מוצרים; PE = פריימר סיומת מוצרים, Na+ = נתרן יון adducts. רמות (E) התיקון עבור T-אני, G- ואני א-הייתי הממוצע של שלוש האישושים ומייצגים קווי השגיאה סטיית תקן 1. רמות תיקון עבור C-הייתי הממוצע של שני האישושים. (נתון זה ממאמרו של סו. et al. 25 בעלי הרשאה.) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מצעים | רצפים | תיקון יעילות (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17.3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18.4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22.9 | |
| MM1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16.9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| מודל MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| א-אני | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-אני | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-אני | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15.4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-אני | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16.6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
טבלה 1. הגהה סובסטרטים ויעילות תיקון על ידי שבר Klenow. טבלה זו מציגה את מודגש 4-נוקלאוטידים בקצה 3'-של תבנית המכילה שינויים phosphorothioate. זוגות בסיס תואמים הן באותיות מודגשות. מבחני ההגהה בוצעו עם 2 U (8.6 pmol) Klenow פולימראז, המצע pmol 50 ו- 4 ddNTPs ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות * ערכים אלה הם גבולות התחתון עבור רמת ההגהה כי רעשי הרקע מונע הערכות מדויקות של < 1% אותות המוני הכולל שנצפו. (נתון זה ממאמרו של סו. et al. 25 בעלי הרשאה.)
| . טוב | המונח | SNP_ID | 2-PCRP | 1-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | Tm | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | נה | נה | נה | נה | נה | נה | נה | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | נה | נה | נה | נה | נה | נה | נה | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
בטבלה 2. קובץ T28_P21.xlsx. ההגדרה שימשו דמות תלת-ממד, 3E, 4Aו- 5A.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
בטבלה 3. קובץ 1201.xlsx. ההגדרה שימש במשך 7 תגובות ב איור 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר המתואר וזמינותו שלב אחר שלב פעילות ההגהה נותחו על ידי הכלי המסחרי הנבחר (ראה את הטבלה של חומרים) באמצעות MS MALDI-TOF. היתרונות הגדולים כוללים פריימר ואת תבנית הם תווית חינם וקל לביצוע, המאפשרות גמישות רבה יותר בתכנון ניסויים. זרם-לימון שלם עיבוד של 30 הגהה בדיקות ייקח 4h, כולל 3 h לביצוע באופן ידני את התגובות ההגהה ולוקח ניקוי שלהם, בזמן הבדיקות MALDI-TOF MS באמצעות הפרוטוקול הנ ל h 1 כדי להשלים. החיסרון העיקרי של שיטה זו היא כמות המצע הדרושות וזמינותו. כדי לקבל אותות חזקים ותוצאות עקביות, השתמשנו pmol 50 של ה-DNA מצע בתגובה 20-µL; לכן, הסכום של ה-DNA הוא הרבה יותר גבוה מאשר עם radiolabeled DNA ניסויים8,9,10. להפחית את אמצעי האחסון ואת גודל המדגם ולכוונן את הפעולה MS יכול להפחית את כמות המצע הנדרש.
Oligonucleotides סינתטי שהושג ממקורות מסחריים יכול לשמש לצורך המחקר ההגהה ישירות ללא טיהור נוספות או טיפול. עם זאת, מומלץ לבדוק את טוהר ואת האיכות של ה-DNA על-ידי MS MALDI-TOF. הקשרים phosphorothioate הוכנסו כדי להחליף את הקשרים 4 phosphodiester האחרון בקצה 3' של התבנית (טבלה 1) כדי להפחית את השפלה שאינם ספציפיים של סטרנד תבנית (איור 3G), גם אם במחיר גבוה יותר עבור דגימה. מעניין, אותות מן התבנית פריימר DNA ניתן טוב להפריד על-ידי MS מעצם השוני בגודלם; לכן, שינוי phosphorothioate זה אינו נדרש. ב- איור 3E, למשל, כל המוצרים אפשרי את הארכת תחל P21 ההגהה כריתה ואת resynthesis היו פחות מ 22 nt (מ/z < 7,000), בעוד כל השברים השפלה מתבנית T28 היה גדול מ- 24 nt (מ/z > 7,000 ). התוצאות באיור 4A היו אותו P21/T28 דופלקס להגדיר לאלה 3E איור. חלון מוגדל של 6,000 – 7,000 מ/z מציג רק אותות ומהצמיגים הדנ א ללא סימנים מבלבלים מהתבנית.
האסטרטגיה של באמצעות תחל עם סיומת ddNMP נוכחו להיות יציב מאוד, ויש, לפיכך, מוצרים המכילים ddNMP אינדיקטורים טובים עבור וזמינותו ההגהה. התוספת של ddNMP למוצרים כריתה "להקפיא" את המוצרים ההגהה במדינה לניתוח מיד לאחר כריתה. לחלופין, באמצעות dNTP הנכונה יחיד (איור 5B) במקום 4 ddNTPs כדי לדכא את פעילות hydrolytic שאינם ספציפיים אקסונוקלאז ההגהה היא גם אפשרית.
עוצרים את התגובות עם הליך שאיבת פנול רגיל/כלורופורם הוכיחה להיות האמצעים הטובים ביותר עבור סיום התגובה שכן, בשלב אחד, זה מאפשר את התגובות צריך לעצור בעת גם הסרת כל הפרעה חלבון. לחלופין, חומצה שכבתה, אשר נוטה אוטומציה, ואז מנוטרל על ידי-מטאל אלקליין ללא הפרדה שלב, גם הפגינו תוצאות אמינות. יון נתרן adducts (Na+ , איור 4, 5ו- 7) הם של דאגה, שכן הם יכולים להגדיל את הרקע ומסבכים את האפליה אות. שימוש נאות של שרף נקי. המצמצמים הפרעה כזו; עדיין, אפילו כאשר כגון adducts נוכחים, הם בדרך כלל יש פסגות הרבה יותר קטן באופן יחסי ההורה-האות שלהם, מאפיין זה יכול לשמש כדי להבחין ביניהם (איור 4, 5ו- 7). באופן כללי, שיא הגובה של נתרן adducts היה פרופורציונליים להפסגות הגדולות; הכללה או אי הכללה של נתרן adducts ב החישוב לא להשפיע באופן משמעותי על התוצאות כמת. לכן, עבור כימות, השתמשנו הגובה פסגה רצינית רק עבור החישוב.
ההגהה הניסויים המתוארים כאן ניצל של אי-התאמות פנימי כדי להדגים את חשיבותה של אקסונוקלאז תחום מחיצה וזמינותו של KF26 ופולימראז מפורט את הדנ א אני יכולת לבצע ביעילות הגהה ההתאמה-למעלה 4 nt במעלה הזרם פריימר 3'-אנד (איור 5, MM1 - 4) כנראה עקב היציבות בשיוך בסיס-צמתי פריימר-תבנית27. בנוסף, מחקר זה משמש גם תחל המכיל נגעים deoxyinosine הלפני אחרון ללמוד עניין של המשטרה שאני תיקון intermediates תיקון V-עצור אנדו. התוצאות הראו כי T-אני תוקן באופן יעיל יותר א- ו -G-; עם זאת, C-הייתי דברים מעוותים פול פוט אתקן (טבלה 1 , איור 7). תוצאות אלו לאשר כי ניתוח MALDI-TOF MS יכול להיות מאוד שימושי עבור קצר שונים-תיקון והגהה מבחני ה-DNA תיקון28 עקב שלה ברזולוציה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים המתקן ליבה NCFPB משולב גנומיקה תפקודית (טאיפיי, טייוואן), המעבדה Pharmacogenomics NRPB (טאיפיי, טייוואן) לתמיכה טכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר קרן בריאות טייוואן (L-אינטרלוקין) ואת משרד המדע הטכנולוגיה, ROC, טאיוואן, [ביותר 105-2320-B-002-047] עבור ווי-יאו הו, [ביותר 105-2628-B-002-051-MY3] קאנג-יי סו [ MOST-105-2320-B-002-051-MY3] בליאנג לין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
