Summary
En ikke-mærket, ikke-radio-isotopiske metode for DNA polymerase korrekturlæsning og en DNA reparation assay blev udviklet ved hjælp af høj opløsning MALDI-TOF-massespektrometri og en enkelt nukleotid udvidelse strategi. Analysen viste sig at være meget specifikke, enkel, hurtig og let at udføre for korrekturlæsning og reparation patches kortere end 9-nukleotider.
Abstract
Vedligeholdelse af genomet og dens trofaste replikering er altafgørende for at bevare genetisk information. For at vurdere high fidelity replikering, vi har udviklet en simpel, ikke-mærket og ikke-radio-isotopiske metode ved hjælp af en matrix assisted laser desorption ionisering med time-of-flight (MALDI-TOF) masse massespektrometri (MS) analyse for en korrekturlæsning undersøgelse. Her, en DNA-polymerase [fx Klenow fragment (KF) af Escherichia coli DNA polymerase jeg (pol jeg) i denne undersøgelse] i overværelse af alle fire dideoxyribonucleotide triphosphates bruges til at behandle en uoverensstemmelse mellem primer-skabelon duplex. Den forkerte primer er derefter læse korrektur/forlænget og underkastes MALDI-TOF MS. Produkterne er kendetegnet ved en masse ændring af primer ned til enkelt nucleotid variationer. Vigtigere er, kan en korrekturlæsning også bestemmes for interne indre uoverensstemmelser, omend på forskellig virkningsgrader. Mismatchproblemer beliggende på 2-4-nukleotider (nt) fra 3' enden var effektivt korrekturlæst af pol, og en uoverensstemmelse på 5 nt fra primer terminus viste kun en delvis korrektion. Ingen korrekturlæsning opstod for interne uoverensstemmelser ligger på 6-9 nt fra primer 3' enden. Denne metode kan også anvendes til DNA reparation assays (f.eks. vurdering af en base-læsion reparation af substrater for endo V reparation pathway). Primere som indeholder 3' næstsidste deoxyinosine (dI) læsioner kunne korrigeres ved pol jeg. Faktisk, næstsidste T-jeg, G-jeg, og A-jeg substrater havde deres sidste 2 dI-holdige nukleotider skåret ud af pol jeg før du tilføjer en korrekt ddN 5'-monophosphate (ddNMP) mens næstsidste C-jeg uoverensstemmelser blev tolereret af pol jeg tillader primer udvides uden reparation, demonstrerer følsomhed og opløsning af MS analyse for at måle DNA reparation.
Introduction
DNA polymeraser under DNA replikation korrekturlæsning funktioner er afgørende for at sikre high fidelity af genetiske oplysninger, der skal overføres til afkom1,2,3,4, 5,6,7. At være i stand til at vurdere bidragene fra polymerase korrekturlæsning exonucleases ville afklare mekanismerne sikre genetisk stabilitet.
Radioisotop mærkning og gel-baserede assays i kombination med densitometric analyser af autoradiograms eller fosfor imaging8,9,10 har traditionelt været brugt til at registrere korrekturlæsning aktivitet af DNA polymeraser. Mens funktionelle, er disse assays besværligt, dyrt og ikke indstillet til høj overførselshastighed formater. Derudover lider radioisotoper sikkerhedsspørgsmål, herunder bortskaffelse af affald. Alternativt, korrekturlæsning aktiviteter er blevet analyseret af fluorometriske teknikker. For eksempel, kan 2-aminopurine (2-AP) indarbejdes i forlængelse produkter under in vitro- polymerase korrekturlæsning assays for at producere en fluorescerende signal11,12. Desværre, disse tilgange lider af en lav specificitet, da 2-AP kan parre med både thymin og cytosin. Nyere tilgange omfatter en følsom G-quadruplex-baserede selvlysende Tænd sonden for en polymerase 3' - 5' exonuclease assay13 samt en enkeltvis mærket fluorescerende sonden for en polymerase korrekturlæsning assay, der overvinder nogle af de ovennævnte ulemper14. Begejstring for disse fluorometriske metoder er formindsket på grund af behovet for den specifikke mærkning af DNA substrater.
Derimod en MALDI-TOF MS for DNA-analyse har været ansat i PinPoint assay, hvor primer udvidelse reaktioner med umærkede 4 ddNTPs kan bruges til at identificere polymorfier på en given locus15,16,17 og har været udbredt i kliniske applikationer for mutation opdagelser og cancer diagnoser18. Brug disse grundlæggende principper, har vi skabt en etiket-fri assay til in vitro- bestemmelse af DNA polymerase korrekturlæsning aktivitet at udnytte høj opløsning, høj specificitet og høj overførselshastighed potentiale af MALDI-TOF MS. med E. coli DNA polymerase jeg Klenow fragment som en model enzym, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) som substrater kan tage et "snapshot" af korrekturlæsning produkter efter en enkelt nukleotid udvidelse via MALDI-TOF MS (figur 1).
Ligeledes, denne metode blev også udviklet til en DNA reparation assay hvor primere indeholdende 3' næstsidste dI læsioner er udsat for en pol jeg reparere analyse som efterligner endo V hakker reparation mellemprodukter. Mens ikke fuldt forstået, er endo V reparation vej den eneste reparation system kendt at ansætte pol jeg korrekturlæsning exonuclease aktivitet for læsion excision19,20. Bruger MALDI-TOF MS, vi vise et klart defineret reparation patch hvor dI kan være skåret ud af pol jeg når forekommer i de sidste 2 nt primer før du tilføjer den rigtige suppleret nukleotid.
Til undersøgelse af korrekturlæsning og DNA reparation, denne metode er hurtigere og mindre besværligt end tidligere metoder og giver yderligere oplysninger mod mekanisme og funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer/skabelon forberedelse
- Design primere/skabeloner med en afbalanceret G + C indhold mellem 40% og 60% som en sekvensering eller PCR primer design. Bruge primere 18 til 21 nt for en passende udglødning og bedre MS signaler.
- Designskabelon ved 50 ° C som minimum smeltende temperatur for regionen duplex med mindst 7 nt af 5'-overhæng at adskille signaler mellem primeren og skabelonen.
Bemærk: For eksempel, til substratet P21/T28 i tabel 1, 21-nt primer er parret med en 28-nt skabelon. Indstilling: brugen af alternative nukleinsyrer som nukleasen-resistent phosphorothioate obligationer til at erstatte de sidste 4 fosfodiesterbindinger i 3'-slutningen af skabelonen kan forhindre mulige indblanding af en ikke-specifik 3' enden nedbrydning af skabeloner ( f.eks., T28S4 i tabel 1), selvom dette vil tilføje nogle omkostninger for skabelon forberedelse. - Ved hjælp af standard afsaltede oligonukleotider uden yderligere rensning er tilfredsstillende for denne undersøgelse. Bruge oligonukleotid primere/skabeloner i en koncentration på 100 pmol/µL i H2O som en materiel og opbevar den ved-20 ° C. Kontrollere kvaliteten og renheden af primere og skabeloner ved at køre oligonukleotider på MALDI-TOF MS (trin 4-7) til at sikre unikke peak signaler og et godt signal til støjforhold.
- Bestemme de relative MALDI-TOF MS signal intensiteter (trin 7) af de lige kindtand primere af de relevante sekvenser i reaktion for kalibrering og koncentration normalisering (figur 2).
2. korrekturlæsning reaktioner
Bemærk: Samme korrekturlæsning reaktion tilstand og protokollen gælder for en DNA reparation af A-I, G-I, C-I, og T-jeg.
- Ved hjælp af en T-G misforhold af substrat P21/T28 for korrekturlæsning i tabel 1 som et eksempel, fortyndes primer P21 og skabelon T28 til 12,5 pmol/µL med H2O; derefter overføre 12 µL af de fortyndede primer og 12 µL af de fortyndede skabelon til en 1,5 mL steriliseret microcentrifuge tube.
Bemærk: Mængden af skabelon/primer mix er tilstrækkelig for 2 reaktioner; forholdsmæssigt øge mængden af reagenserne i overensstemmelse hermed for flere reaktioner. - Luk røret stramt. Inkuber i 30 min i en overdækket 65 ° C vandbad, som er efterfulgt af 30 min. i et 37 ° C vandbad, og endelig på isen for at sikre en ordentlig udglødning.
- En 1,5 mL steriliseret microcentrifuge rør, tilføje 8 µL af primer og skabelon mix (50 pmol), 2 µL af 10 x korrekturlæsning reaktion buffer, 4 µL af 4 ddNTPs mix (2 mM af hver 4 dNTP'er) og H2O op til 18 µL. svirp røret til mix.
Bemærk: 1 x korrekturlæsning reaktion buffer indeholder 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol og 10 mM Tris-HCl (pH 7,9 ved 25 ° C). Se Tabel af materialer til den kommercielle kilde til 10 x korrekturlæsning reaktion buffer. Den endelige koncentration af hver ddNTP i reaktionen er 0.1 mM. - Fortynd DNA polymerase i iskold 1 x korrekturlæsning reaktion buffer til den ønskede koncentration [f.eks., at en 1,5 mL microcentrifuge rør, tilføje 4 µL 1 x korrekturlæsning reaktion buffer og 1 µL af 5-U Klenow polymerase fra en kommerciel kilde (tabel af Materials)]. Gemme den fortyndede enzym på is på alle tidspunkter.
Bemærk: Mængden af fortyndet DNA polymerase er tilstrækkelig for 2 reaktioner; proportionalt øger mængden af enzymer i overensstemmelse hermed for flere reaktioner. Et volumen på 2,0 µL, der indeholder 2,0 Klenow polymerase, kan læse korrektur på mere end halvdelen af 50 pmol af T-G terminal uoverensstemmende P21/T28 for i 5 min. - Prewarm microcentrifuge tube med substrat mix fra trin 2.3 til den ønskede reaktion temperatur (f.eks., typisk 37 ° C for Klenow polymerase og 25 ° C for T4 DNA polymerase). Derefter overføre 2,0 µL af de fortyndede DNA polymerase fra trin 2.4 til forvarmet substrat blandingen og svip rør for at blande indholdet.
- Der centrifugeres rør med enzym og substrat i et par sekunder på 3.200 x g ved omgivende temperatur at spin ned komponenter af reaktioner. Straks overføre reaktion på en varme blok eller et vandbad ved den ønskede inkubation temperatur som i trin 2,5.
-
Opsige reaktionen
- Tilføje et lige saa stort volumen af buffered phenol, bland det med vortexing i et par sekunder og centrifugeres det i en microcentrifuge på 3.200 x g omgivende temperatur i 5 min.
- Overføre den vandige fase til en ren microcentrifuge tube og tilføje et lige saa stort volumen af chloroform, bland det med vortexing i et par sekunder og centrifugeres det i en mikrofuge på 3.200 x g ved stuetemperatur i 3 min. overføre den vandige fase til en ren mikrofuge tube og i cubate det ved 95 ° C i 5 min; derefter placere den på is.
Forsigtig: Phenol og kloroform er farlige kemikalier. Håndtering og affald bortskaffelse bør følge institutionelle bestemmelser.
- Overføre den vandige fase til en ren microcentrifuge tube og tilføje et lige saa stort volumen af chloroform, bland det med vortexing i et par sekunder og centrifugeres det i en mikrofuge på 3.200 x g ved stuetemperatur i 3 min. overføre den vandige fase til en ren mikrofuge tube og i cubate det ved 95 ° C i 5 min; derefter placere den på is.
- Alternativt kan du bruge en syre quenching protokol. For dette, Tilføj 2 µL 1 M HCl at stoppe reaktionen på isen i 6 min., derefter tilføje 0,64 µL 1 M diethanolamin (DEA) til at neutralisere pH-værdien af reaktionsblandingen og inkuberes ved 95 ° C i 5 min; derefter placere den på is.
- Tilføje et lige saa stort volumen af buffered phenol, bland det med vortexing i et par sekunder og centrifugeres det i en microcentrifuge på 3.200 x g omgivende temperatur i 5 min.
3. harpiks tilsætning at fjerne Salt forurening
- Ved hjælp af harpiks scoop fra de kommercielle afsaltning kit (Se Tabel af materialer), tage tilstrækkelig harpiks til at dække smilehuller af 384-dimple, 6-mg harpiks dimple plade.
- Distribuere harpiks på tværs af alle smilehuller jævnt (6 mg/dimple) ved at skrabe på tværs af toppen af pladen. Genoprette eventuelle overskydende resin og erstatte det i flasken.
- Overføre de endelige reaktionsprodukter fra trin 2.7 fra mikrofuge rør til en 384-godt plade. Dispensere 16 µL af H2O at fortynde de endelige reaktionsprodukter i hver brønd og derefter forsegle pladen og centrifugeres den for at fjerne eventuelle bobler.
- Fjern forseglingen, drej den 384-godt plade med reaktionsprodukter hovedet til at dække harpiks-fyldt dimple plade.
- Vend godt til dimple plader sandwichen og omhyggeligt Lad harpiks slip til 384-godt plade (være sikker på den 384-godt plade er flush mod den metal pind på harpiks-fyldt dimple plade).
- Fjern dimple plade ovenpå, forsegle 384-godt plade der indeholder blandinger af produkterne, reaktion og harpiks, kort centrifugeres det 3.200 x g ved at fjerne eventuelle bobler og placere den på en rotator i mindst 15 min. ved stuetemperatur til afsaltning dens indhold.
- Efter oprydning harpiks der centrifugeres 384-godt pladen på 3.200 x g for 5 min til kompakt harpiks til bunden af brøndene.
4. overdragelsen reaktionsprodukter til en Matrix Chip
- Indstille prøve pladerne i nanoliter dispenser (nanodispenser, se Tabel af materialer).
- Læg matrixen chip (Se Tabel af materialer) og 384-godt plade fra punkt 3.7 i den tilhørende skuffe.
- Drive nanodispenser for at spotte reaktionsprodukter chip; trykke på knappen Kør på berøringsskærmen af nanodispenser til at starte.
- Check automatisk billedet af prøven steder indeholdende mætning oplysninger på skærmen for at sikre den samlet plettet volumen på chippen er omkring 5-10 nL. Gentage prøven spotting hvis lydstyrken er utilstrækkelig.
5. opsætning Assay oplysninger på den massespektrometri
- Forberede en fil i .xls-format, som indeholder de forventede signal oplysninger til import. For eksempel bruge indstillingen af "P21_T28.xls" (tabel 2) for korrekturlæsning reaktion af P21/T28 i trin 2, 3 og 4.
- Oprette og definere en ny analyse i brugerprogram (Se Tabel af materialer) ved at højreklikke på Import Assay gruppe i Designer Format og vælge .xls-fil (f.eks"P21_T28.xls" fra trin 5.1).
- Etablere den indskyde assay plade via Kunde: projekt: plade indstilling træ på venstre side af skærmen ved at højreklikke på toppen af træet og give den et navn (f.eks., "CTT20171201" repræsenterer assay kode og dato).
- Vælg den 384-godt plade type og tryk på OK; der vises en tom tallerken.
- Vælg den passende assay (f.eks.P21_T28) i venstre side af skærmen.
- Tildele de valgte assay (f.eks.P21_T28) for hver prøve spottet prøve position på chippen ved at fremhæve godt og at højreklikke for at vælge Tilføj Plex.
- Forberede en arbejdende liste over alle testene på chip i .xlsx-format med ingen header (fx, 1201.xlsx til tabel 3). Importere den arbejdende liste via indstillingen Tilføj ny eksempelprojektet .
- Tildel test på listen arbejde (f.eks.fra 1201.xlsx) til hver position af P21_T28 analysen og vælge ved at højreklikke.
6. MALDI-TOF MS drift
- Link til massespektrometer til chippen ved hjælp af brugerprogram (Se Tabel af materialer).
- Vælg standardindstillingen på højre side af skærmen.
- Udfylde navnet assay fra trin 5.3 (f.eks.CTT20171201), chip-ID på hjørnet af chip, og Gem indstillingerne.
- Starte programmet MS kontrol (Se Tabel af materialer).
- Tryk på knappen In/Out og tegne spejder plade. Placer den plettede chip fra trin 4.4 på spejder pladen og tryk på knappen In/Out for den plettede chip til at indtaste den massespektrometer.
- Klik på knappen erhverve af brugerprogram (Se Tabel af materialer) for at starte den massespektrometri og erhverve data.
7. dataanalyse
- Åbn programmet for data-analyse (Se Tabel af materialer).
- Gennemse træet af databasen i det øverste venstre hjørne og vælg chip-ID fra trin 6.3. Åbn datafilen på højre side af skærmen.
- Klik på ikonet spektrum for at få vist den masse spektrum. Hvis du vil beskære et bestemt interval af m/z, højreklik for at vælge Tilpasning Dialog og i det nye vindue skal du klikke på x-aksen og indstille den ønskede øvre og nedre grænse og tryk på OK for at vise det angivne område af spektret.
- Eksportere spektrum for registrering ved at højreklikke på eksport.
Bemærk: Ved hjælp af en skala fra 1600 bredde/1.200 enhed er en rimelig størrelse for data inspektion på en computerskærm.- Vælg filtype JPEG, klik på Destination, Vælg Gennemse disken (fxflash disk E:), skal du skrive filnavnet (f.eks., 1201-1.jpg), og klik derefter på Eksporter.
- For data kvantitering, bruge markøren og klikke på peak til at vise tophøjde på øverste venstre hjørne.
- Alternativt kan du udskrive en eksporterede JPEG-fil og måle peak højde med en lineal manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skabeloner og primere:
Ved hjælp af den procedure, der er præsenteret her, lige kindtand syntetiske oligonukleotid skabeloner og primere relevante sekvenser fra kommercielle kilder blev kontrolleret for deres renhed og kvalitet (figur 3A, Bemærk signalerne, der matchede den udpegede masse og lave baggrunden) samt for forholdet mellem den maksimale intensitet og analysanden massen (figur 2A). Tophøjder blev målt og beregnet (figur 2B) for MS datanormalisering.
Reaktion tilstand og masse spektre:
Brugen af enkelt base primer udvidelse reaktioner kombineret med MALDI-TOF MS for genotypebestemmelse har tidligere vist sig at være muligt ved hjælp af standard ddNTPs terminators17. Korrekturlæsning analysen ved hjælp af standard ddNTPs svarer til en singleplex reaktion fra genotypebestemmelse men er meget enklere og meget let at udføre for at opnå resultater, ren og pålidelig.
MS-spektre dækket alle signaler genereret fra både primere og skabeloner (figur 3). Den passende design af primere og skabeloner genereret et godt adskilt signal profil for både skabelonerne og primere (figur 3). Ifølge m/z-værdi, signaler fra skabeloner og deres ikke-specifikke delvis nedbrydningsprodukter (m/z > 7.000) var godt adskilt fra de forkerte primere og læse korrektur på produkter (m/z < 7.000 i figur 3). Hvis det er nødvendigt, at indføre nukleasen resistente phosphorothioate obligationer til at erstatte de sidste 4 fosfodiesterbindinger ultimo 3' skabelon (tabel 1; T28S4/P21) kan reducere ikke-specifik skabelon hydrolyse (figur 3 g; d27).
I mangel af dNTP'er, KF har en robust 3'-exonuclease og er i stand til i nedværdigende både primeren og skabelon in vitro-21. Ligesom de oprindelige 4 dNTP'er forhindrer tilsætning af de 4 ddNTPs en 3' enden nedbrydning af KF (figur 3 c og 3E). Ligeledes, en et nukleotid udvidelse af 3'-ender tilføjer øget stabilitet til primeren. Ved hjælp af pol jeg korrekturlæsning betingelser som tidligere beskrevet20 med 10 U (46 pmol) KF, mere end 80% af de 50-pmol uoverensstemmende substrater blev korrigeret i 5 min (figur 3 c, 3Eog 3 G).
Mellemprodukter og mekanisme analyse:
MALDI-TOF MS beslutning kan være så fint som 1 dalton; Ja, alle substrater, produkter og mellemprodukter med masse ændringer i reaktionen kan løses i det markerede område samme MS-spektrum. For eksempel, i en terminal T-G uoverensstemmelse, blev den forkerte G på primer endestation korrigeret med inkorporering af Doha-udviklingsdagsordenen med en m/z forskel på kun 32. Sådan en m/z forskel kan let identificeres på MS-spektrum i en m/z spænder fra 5.000 til 7.000 (figur 4A). Ændringen af hver enkelte signal kan beregnes ved at addere op alle signaler fra den forkerte primer, excision mellemprodukter, og Korrekturlæs produkter som 100%. For eksempel, i T-G korrekturlæsning reaktion var den korrigerede produkt i forhold til produktets excision 23% versus 17% på 5 min, 31% versus 18% på 10 min og 69% versus 14% på 20 min (figur 4A).
Når en næstsidste T-G uoverensstemmelse er til stede i primer, de sidste 2 nt bør være skåret ud, efterfulgt af en ddA tilføjelse at fuldføre korrektionen. Faktisk, de korrekte produkter steget med tiden fra 12% på 5 min, 28% på 10 min, til 45% på 20 min reaktion. Desuden var to former for excision produkter til en næstsidste T-G korrekturlæsning, 1-nt excision mellemliggende og 2-nt excision produkter, let opløselige (figur 4B).
Korrekturlæsning kinetik med enkelt dNTP:
For E. coli DNA pol, ddNTPs ikke egnede substrater og bør betragtes som hæmmere22. Alternativt, ved hjælp af en enkelt "korrekt" dNTP i korrekturlæsning reaktionen i stedet vil også undertrykke uspecifikke 3' - 5' exonuclease aktivitet og generationen af enkelt nucleotid udvidelse produkter egnet til MS analyse (figur 5B). Den korrekturlæsning fremstillet af reaktioner der indeholder en enkelt dCTP er omkring to gange højere end reaktioner indeholdende de 4 ddNTPs (figur 5A, 5Bog 5 C). Således giver brug af en enkelt "korrekt" dNTP i korrekturlæsning analysen et bedre resultat uden de hæmmende effekter af ddNTPs. Denne tilgang bør give større følsomhed for korrekturlæsning kinetiske analyser.
Korrekturlæsning af interne uoverensstemmelser:
MS korrekturlæsning assays bruger KF for interne uoverensstemmelser og identifikation af korrekturlæse produkter er ligetil (dvs, den korrekturlæsning exonuclease punktafgifter nukleotider fra 3' enden at den interne uoverensstemmelse i primere), efterfulgt af den tilsætning af matchede ddNMP til excision produkter via polymerase funktion generere korrekturlæst produkter kortere end primer substrater (figur 6). En klar tendens til korrekturlæsning effektivitet blev observeret, hvor KF effektivt korrekturlæst uoverensstemmelser på sidst, næstsidste, 3rd og 4th nukleotider i 3' slutningen af primere (figur 6; 1, 2, 3 og 4). Mismatches på 5 nt fra 3'-enden af primeren var korrigeret delvist med < 15% af uoverensstemmelse korrektion og > 15% af primer viste en udvidelse uden korrekturlæsning (figur6; MM5). KF undlod at korrekturlæse mismatchproblemer placeret på 6, 7, 8 og 9 nt fra 3'-enden af primer (figur 6; MM6, 7, 8 og 9) men stadig udvidet en betydelig del af substrater (figur 6; PE af MM6, 7, 8 og 9).
Reparation af deoxyinosine læsion:
I E. colibehandles deoxyinosine i DNA primært af endo V reparation pathway20,23. Endo V initierer reaktionen ved et snit på den anden phosphodiester bond 3' af dI læsion. Strand pausen genereret menes at blive brugt af pol I for en efterfølgende læsion excision og DNA genopbygningen24. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at teste pol jeg reparere substrater indeholdende dI på 3' næstsidste site (tabel 1; En-I, C-I, G-jeg, og T-jeg) at validere denne hypotese. Reparation af 3' næstsidste-dI er analog til korrekturlæsning af den næstsidste T-G uoverensstemmelse (figur 4B og 6; Mm2 post), hvor de sidste 2 nt skal være fjernet efterfulgt af en tilføjelse af en korrekt ddNMP til at udføre reparationen. MS mønstre viste tydeligt pol jeg rettede heteroduplexes af A-I, G-jeg, og T-jeg, omend med forskellig virkningsgrader (figur 7; RP signaler). Men C-jeg substrat er refraktære over for pol jeg reparere (tabel 1 og figur 7 d og 7E; meget lav RP) og viste primer forlængelsen i stor udstrækning (figur 7 d; PE signal).
Figur 1 . Model system for korrekturlæsning assay. En uoverensstemmelse mellem primer var udglødet som angivet til skabelonen danner en terminal uoverensstemmelse (fed). Korrekturlæsning exonuclease af DNA polymerase ville opdage og fjerne den forkerte nukleotid danner en excision produkt. En DNA-polymerase og fire ddNTPs, er produktets excision udvidet med en enkelt base supplement til de tidligere forkerte websted. Når de udsættes for MALDI-TOF, kan forskel i masse mellem den forkerte primer, excision produkter og korrekturlæse produkter løses. (Dette tal er tilpasset fra Su et al. 25 med tilladelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Peak intensitet og oligonukleotid Mass Otte oligonukleotider fra 17 til 24 nt med sekvenser komplementære til 3'-enden af T28 (tabel 1) blev testet. (A) A blanding af 50 pmol af hver oligonukleotid i 40 µL løsninger blev udsat for en MS analyse. (B) tophøjde af 17 nt blev brugt som 100% for beregningen. Relative signal intensiteten for hver oligonukleotid var gennemsnittet af seks målinger og fejllinjer udgør 1 standardafvigelse. (Dette tal er tilpasset fra Su et al. 25 med tilladelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Effekten af forskellige skabelondesign. Korrekturlæsning reaktioner blev vurderet med P21 primer danner en terminal T-G uoverensstemmelse med forskellige skabeloner. Korrekturlæsning analysen blev udført med 10 U (43 pmol) Klenow polymerase, 50 pmol substrat, og 4 ddNTPs ved 37 ° C i 5 min. (A) dette panel viser P21/T32 T-G substrat uden enzym. (B) dette panel viser en primer udvidelse af P21/T32 Thulstrup substrat af 3' exonuclease mangelfuld Klenow. PE = primer forlængelse produkt. (C) dette panel viser en korrekturlæsning af P21/T32 T-G substrat. PP = korrekturlæsning produkt; d26, d27, d28 = 3' enden-forringet skabelon. (D) dette panel viser P21/T28 T-G substrat uden enzym. (E) dette panel viser en korrekturlæsning af P21/T28 T-G substrat. PP = korrekturlæsning produkt; d26, d27 = 3' enden-forringet skabelon. (F) dette panel viser P21/T28S4 T-G substrat uden enzym. (G) dette panel viser en korrekturlæsning af P21/T28S4 T-G substrat. PP = korrekturlæsning produkt; EP = excision produkter; D27 = skabelon nedbrydning biprodukt. (Dette tal er tilpasset fra Su et al. 25 med tilladelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Gang kursus analyse for excision produkter og korrekturlæsning. Korrekturlæsning assays blev udført med 2 U (8.6 pmol) KF og 50 pmol substrater som beskrevet i protokollen. Reaktionerne var slukket på de angivne tidspunkter. (A) dette panel viser en korrekturlæsning af 3' terminal T-G uoverensstemmelse; EP = korrekturlæsning excision produkt; D18 & d19 = overskydende excision biprodukter; PP = korrekturlæsning produkter; P21 = uoverensstemmende primer. (B) dette panel viser en korrekturlæsning af 3'-næstsidste T-G uoverensstemmelse; EI-1 = excision mellemliggende; EP-2 = korrekturlæsning excision produkter; D18 = overskydende excision biprodukt; PP = korrekturlæsning produkter; P21 = uoverensstemmende primer; Na = natrium ion bundet nukleotider. (Dette tal er tilpasset fra Su et al. 25 med tilladelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Korrekturlæsning reaktion med 4 ddNTPs versus et enkelt dNTP. Korrekturlæsning assays blev udført med 0,1 U (0,43 pmol) KF og 50 pmol substrater som beskrevet i protokollen. Reaktionerne var slukket på de angivne tidspunkter. (A) dette panel viser en korrekturlæsning af 3' terminal G-G uoverensstemmelse med 4 ddNTPs; EP = korrekturlæsning excision produkt; PP = korrekturlæsning genopbygningen produkter; P21G = uoverensstemmende primer. (B) dette panel viser en korrekturlæsning af 3' terminal G-G uoverensstemmelse med dCTP; PP = korrekturlæsning genopbygningen produkter; P21G = uoverensstemmende primer. (C) korrektionen niveauer er gennemsnittet af tre målinger og fejllinjer udgør 1 standardafvigelse. Na+ = natrium ion bundet nukleotider. (Dette tal er tilpasset fra Su et al. 25 med tilladelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Korrekturlæsning af interne uoverensstemmelser. Korrekturlæsning assays blev udført med 2 U (8.6 pmol) Klenow polymerase og 50 pmol substrater i 37 ° C i 20 min. som beskrevet i protokollen. Tomt = enzym Tom af en 1 substrat. 1 = P21/T28 T-G substrat; Mm2 til MM9 = substrater med indre uoverensstemmelser, tallene angiver positionen uoverensstemmelse i forhold til 3' enden. P21 = uoverensstemmende primere; PR = korrekturlæse produkter; PE = udvidede primere; D19 og d20 = overskydende excision biprodukter, tal repræsenterer størrelsen af nukleotider. (Dette tal er tilpasset fra Su et al. 25 med tilladelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . Reparation af 3' næstsidste deoxyinosine læsioner. Reparation assays blev udført med 2 U Klenow polymerase og 50 pmol substrater i 37 ° C, som beskrevet i protokollen trin 2.3. Reaktionerne var slukket på de angivne tidspunkter. Disse paneler viser reaktioner med (A) T-jeg substrat; (B) G-jeg substrat; (C)-Jeg substrat; og (D) C-jeg substrat. RP = reparation produkter; EP = excision produkter; PE = primer udvidelse produkter, Na+ = natrium ion adukter. (E) korrektionen niveauer for T-jeg, G-jeg, og A-jeg var gennemsnittet af tre målinger og fejllinjer udgør 1 standardafvigelse. Korrektion niveauer for C-jeg var gennemsnittet af to bestemmelser. (Dette tal er tilpasset fra Su et al. 25 med tilladelse.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Substrater | Sekvenser | Korrektion effektivitet (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17.3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18,4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22,9 | |
| 1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16,9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| LMX | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-JEG | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-JEG | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1,0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-JEG | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15,4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-JEG | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16.6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
Tabel 1. Korrekturlæsning substrater og korrektion effektivitet af Klenow fragment. Denne tabel viser de fed 4-nukleotider i 3'-slutningen af den skabelon, der indeholder phosphorothioate ændringer. De forkerte basepar er i fed skrift. Korrekturlæsning assays blev udført med 2 U (8.6 pmol) Klenow polymerase, 50 pmol substrat og 4 ddNTPs ved 37 ° C i 10 min. * disse værdier er de lavere grænser for korrekturlæsning niveau fordi baggrundsstøjen forhindrer nøjagtige skøn over < 1% af den samlede masse signaler observeret. (Dette tal er tilpasset fra Su et al. 25 med tilladelse.)
| GODT | SIGT | SNP_ID | 2.-PCRP | 1.-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | TM | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
Tabel 2. T28_P21.xlsx fil. Indstillingen blev brugt til figur 3D, 3E, 4Aog 5A.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
Tabel 3. 1201.xlsx fil. Indstillingen blev brugt til 7 reaktioner i figur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse beskrev en trinvis korrekturlæsning aktivitet assay analyseres ved den valgte kommercielle instrument (Se Tabel af materialer) ved hjælp af MALDI-TOF MS. De store fordele omfatter er primer og skabelon etiket gratis og nem at udføre, giver mulighed for større fleksibilitet i at designe eksperimenter. En stream-lime komplet behandling af 30 korrekturlæsning tests ville tage 4 h, herunder 3 h for manuelt udfører korrekturlæsning reaktioner og deres oprydning, mens MALDI-TOF MS analyser ved hjælp af den ovennævnte protokol tager 1 time at fuldføre. Den primære ulempe ved denne metode er mængden af substrat kræves for analysen. For at opnå stærke signaler og ensartede resultater, brugte vi 50 pmol af DNA substrat i en 20-µL reaktion; således er er mængden af DNA langt højere end med radiolabeled DNA eksperimenter8,9,10. Reduktion af mængderne og stikprøvestørrelse og finjustering MS operationen kan nedsætte mængden af substrat kræves.
Syntetisk oligonukleotider fra kommercielle kilder kan anvendes til korrekturlæsning undersøgelsen direkte uden yderligere rensning eller behandling. Det er dog tilrådeligt at kontrollere renhed og kvalitet af DNA af MALDI-TOF MS. Phosphorothioate obligationer blev indført for at erstatte de sidste 4 fosfodiesterbindinger i 3'-slutningen af skabelonen (tabel 1) til at reducere ikke-specifikke nedbrydningen af skabelon strand (figur 3 g), om end til en højere pris pr. prøve. Interessant, kan signaler fra skabelon og primer DNA være godt adskilt af MS i kraft af deres forskelle i størrelse; således, denne phosphorothioate ændring er ikke påkrævet. I figur 3E, for eksempel, alle mulige produkter af primer P21 udvidelse og korrekturlæsning excision og genopbygningen var mindre end 22 nt (m/z < 7.000), mens alle nedbrydning fragmenter fra skabelon T28 var større end 24 nt (m/z > 7.000 ). Resultaterne i figur 4A var fra den samme P21/T28 duplex indstillet som i figur 3E. En udvidet vindue m/z 6.000-7.000 viser kun signaler fra primer DNA uden nogen forstyrrende signaler fra skabelonen.
Strategi ved hjælp af primere med filtypenavnet ddNMP viste sig for at være meget stabile, og dermed ddNMP indeholdende produkter er gode indikatorer for korrekturlæsning analysen. Tilsætning af ddNMP til excision produkter kan 'fryse' korrekturlæsning produkterne i tilstanden for analyse umiddelbart efter excision. Alternativt, ved hjælp af en enkelt korrekte dNTP (figur 5B) i stedet for 4 ddNTPs til at undertrykke uspecifikke hydrolytisk aktivitet af den korrekturlæsning exonuclease er også muligt.
Stoppe reaktioner med en standard fenol/chloroform ekstraktionsmetode viste sig for at være det bedste middel til reaktion opsigelse da i ét trin, det giver reaktioner skal stoppes mens du også fjerner enhver indblanding af protein. Alternativt, syre quenching, som er indstillet til automation, så neutraliseret af ikke-metal alkalisk uden en faseadskillelse, også vist pålidelige resultater. Natrium ion adukter (Na+ i figur 4, 5og 7) er til bekymring, da de kan øge baggrund og komplicere signal forskelsbehandling. En korrekt anvendelse af ren harpiks kan reducere sådan indblanding; endnu, selv når sådanne adukter er til stede, de har normalt meget mindre toppe i forhold til deres forældre-signal, og denne egenskab kan bruges til at skelne mellem dem (figur 4, 5og 7). Generelt, tophøjde af natrium adukter var proportional med de store toppe; optagelse eller udelukkelse af natrium adukter i beregningen ikke væsentligt påvirkede kvantificering resultater. Derfor, for kvantificeringen brugte vi den store tophøjde kun for beregningen.
Korrekturlæsning eksperimenter beskrevet her benyttede sig af interne uoverensstemmelser til at demonstrere betydningen af exonuclease domæne partition assay af KF26 og den detaljerede DNA polymerase jeg evne til effektivt korrekturlæst uoverensstemmelse på op 4 nt opstrøms fra primer 3'-enden (fig. 5, 1 - 4) muligvis på grund af base-parring stabiliteten på primer-skabelon vejkryds27. Desuden, brugt denne undersøgelse også primere indeholdende næstsidste deoxyinosine læsioner til at studere en pol jeg reparere af endo V-hakker reparation mellemprodukter. Resultaterne viste, at T-jeg blev repareret mere effektivt end A- og G-; men C-jeg er refraktære over for pol jeg reparere (tabel 1 og figur 7). Disse resultater bekræfter, at en MALDI-TOF MS analyse kan være meget nyttigt for korrekturlæsning og forskellige kort-patch DNA reparation-undersøgelser vedrørende28 på grund af sin høje opløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker NCFPB integreret Core facilitet for funktionel genomforskning (Taipei, Taiwan) og NRPB farmakogenomforskning Lab (Taipei, Taiwan) for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af forskningstilskud fra Taiwan Health Foundation (L-I.L.) og ministeriet for videnskab og teknologi, Taipei, Taiwan, ROC [mest 105-2320-B-002-047] af Wei-Yao Hu, [mest 105-2628-B-002-051-MY3] for Kang-Yi Su og [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] for Liang-i Lin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A.
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M.
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
