Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

Published: June 19, 2018 doi: 10.3791/57862
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children's Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

Не помечены, Радио изотопный метод ДНК-полимеразы корректуры и пробирного ремонта ДНК была разработана с помощью стратегии расширения единичных нуклеотидных и разрешением MALDI-TOF масс-спектрометрии. Assay доказал, чтобы быть очень конкретные, простой, быстрый и легко выполнять проверки правописания и ремонт патчи короче, чем 9-нуклеотидов.

Abstract

Поддержание генома и его верным репликации имеет первостепенное значение для сохранения генетической информации. Чтобы оценить высокой верности репликации, мы разработали простой-меченых и радио изотопный метод, с помощью матрицы помощь лазерная ионизация десорбции с время полета (MALDI-TOF) массового спектрометрия (МС) анализ для изучения корректура. Здесь, ДНК-полимеразы [например, фрагменты фрагмент ДНК-полимеразы кишечной палочки (KF) я (Поль я) в этом исследовании] присутствии всех четырех dideoxyribonucleotide трифосфаты используется для обработки дуплекс несоответствие грунт шаблон. Несоответствие грунтовка затем корректировать/расширенный и подвергается MALDI-TOF MS. Продукция отличается изменения массы грунта до единичных нуклеотидных вариации. Главное корректура также может определяться для внутреннего одного несоответствия, хотя и в разных эффективности. Несоответствия, расположенный в 2-4-нуклеотидов (nt) от 3' конца были эффективно корректируемый Поль я, и несоответствие в 5 nt от грунтовки terminus показал только частичное исправление. Не корректура произошло для внутренних несоответствий, расположенный на 6-9 nt от грунт 3' конца. Этот метод может также применяться для ремонта анализов ДНК (например, оценки базы поражения ремонт субстратов для ремонта пути Эндо V). Грунты, содержащие 3' предпоследний deoxyinosine (dI) поражения могут быть исправлены путем Поль я. Действительно предпоследний T-I, G-I и A-я субстратов был их последний 2 ди содержащих нуклеотидов подакцизным, Поль я перед добавлением правильный ddN 5'-монофосфат (ddNMP) во время предпоследнего C-я несоответствия были мириться Пол I, позволяя грунт, чтобы быть продлен без ремонт, демонстрируя, что чувствительность и разрешение MS анализа для измерения репарации ДНК.

Introduction

Корректура функции ДНК полимеразы во время репликации ДНК важны для обеспечения высокоточной генетической информации, которая должна быть передана потомству1,2,3,4, 5,6,7. Возможность оценить вклад полимеразы, корректура экзонуклеаз бы уточнить механизмы защиты генетической стабильности.

Радиоизотопные маркировки и гель на основе анализов в сочетании с денситометрических анализ autoradiograms или фосфора изображений8,9,10 традиционно использовались для выявления корректура активность ДНК полимеразы. Хотя функциональные, эти анализы являются трудоемкий, дорого и не поддаются форматов высокой пропускной способности. Кроме того радиоизотопов страдают вопросы безопасности, включая удаление отходов. В качестве альтернативы корректура мероприятия были проанализированы флуориметрический методов. Например 2-aminopurine (2-AP) могут включаться в расширение продуктов во время в vitro полимеразы корректура анализов производить флуоресцентного сигнала11,12. К сожалению эти подходы страдают от низкой специфичности, так как 2-AP можно спарить с тимин и цитозин. Более поздние подходы включают чувствительные основанные на G-четырехместных светящиеся переключатель на зонд для полимеразы 3' - 5' при exonuclease пробирного13 , а также индивидуально меченых флуоресцентного зонда для полимеразы, корректура assay который преодолевает некоторые из вышеупомянутые недостатки14. Энтузиазм для этих методов флуориметрический уменьшается из-за необходимости конкретных маркировки ДНК субстратов.

В противоположность этому, MALDI-TOF MS для анализа ДНК был нанят в assay PinPoint, где грунт расширения реакции с неподписанных 4 ddNTPs может использоваться для идентификации полиморфизмов данного Локус15,16,17 и была широко принята в клинических приложений для обнаружения мутаций и диагнозов рака18. Используя эти основные принципы, мы создали ярлык бесплатно пробирного в vitro определения ДНК-полимеразы, корректура активности, высокое разрешение, высокая специфичность и высок объём потенциал использование MALDI-TOF г-жа е. Коли ДНК-полимеразы, я фрагменты фрагмент как модель фермента, dideoxyribonucleotide трифосфаты (ddNTPs), как подложки могут принимать «моментальных снимков» корректуры продуктов после единичных нуклеотидных расширение через MALDI-TOF MS (рис. 1).

Кроме того этот метод также был разработан для assay ремонта ДНК где грунты, содержащий 3' предпоследний ди поражения подвергаются ГСМ, которую я ремонт assay который имитирует Эндо V порезал ремонт интермедиатов. Хотя не поняты, путь ремонт Эндо V является единственной системой ремонт известный нанимать Пол я корректура деятельность при exonuclease для поражения иссечение19,20. С помощью MALDI-TOF MS, мы показываем патч четко определенные ремонт где ди может быть подакцизным, Поль я когда происходящих в последние 2 nt грунтовки перед добавлением правильно дополняет нуклеотидов.

Для изучения корректуры и репарации ДНК этот метод быстрее и менее трудоемким, чем предыдущие методы и предоставляет дополнительную информацию к механизму и функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка грунт/шаблон

  1. Грунты/шаблоны со сбалансированным содержанием G + C между 40% и 60% как в последовательности или конструкции праймера PCR дизайна. Используйте праймеры от 18 до 21 nt лучше MS сигналов и соответствующие отжига.
  2. Дизайн шаблона, установив 50 ° C как минимум плавления температура для региона дуплекс с по крайней мере 7 nt 5'-навеса для разделения сигналов между грунтом и шаблон.
    Примечание: например, за P21/T28 в таблице 1субстрата, 21-nt грунт в паре с шаблоном 28-nt. Вариант: использование альтернативных нуклеиновых кислот таких облигаций нуклеиназы устойчивостью фосфоротиоат заменить последние 4 Фосфодиэфирная облигации на 3' концу шаблон может предотвратить возможные помехи неспецифической 3' конца деградация шаблонов ( например, T28S4 в таблице 1), хотя это будет добавить некоторые стоимость подготовки шаблона.
  3. С помощью стандартных олигонуклеотидов обессоленной без каких-либо дальнейших очистки является удовлетворительным для этого исследования. Использование праймеров олигонуклеотида/шаблоны в концентрации 100 пмоль/мкл в H2O как запас и хранить его при-20 ° C. Проверьте качество и чистоту грунтовки и шаблонов, запустив олигонуклеотиды на MALDI-TOF MS (шаги 4-7) для обеспечения уникальных пик сигналов и хорошее соотношение сигнал-шум.
  4. Определите относительную интенсивность сигнала MALDI-TOF MS (шаг 7) праймеров одинаковый молярный соответствующих последовательностей в реакции для калибровки и концентрации нормализации (рис. 2).

2. корректура реакции

Примечание: Же корректура реакция состояния и Протокол применяется к репарации ДНК а-I, G-I, C-I и T-я.

  1. С помощью T-G несоответствие субстрата P21/T28 для корректуры в таблице 1 в качестве примера, разбавляют грунтовка P21 и шаблон T28 12,5 пмоль/мкл с H2O; Затем перенесите 12 мкл разбавленного праймера и 12 мкл разбавленного шаблон стерилизованные microcentrifuge 1,5 мл трубки.
    Примечание: Количество смеси шаблон/грунт достаточно для 2 реакции; пропорционально соответствующим образом увеличить объем реагентов для нескольких реакций.
  2. Плотно закройте трубку. Инкубируйте 30 мин в крытой 65 ° C водяной бане, следуют 30 мин на водяной бане 37 ° C и наконец на льду для обеспечения надлежащего отжига.
  3. Стерилизованные microcentrifuge 1,5 мл пробирку 8 мкл грунтовка и шаблон микс (50 пмоль), 2 мкл 10 x корректура буфер реакции, 4 мкл 4 ddNTPs смеси (2 мм каждая 4 дНТФ) и H2O до 18 мкл. Флик трубки смешивать.
    Примечание: 1 x корректура реакции буфер содержит 50 мм NaCl, MgCl 10 мм2, Дитиотреитол 1 мм и 10 мм трис-HCl (рН 7,9 при 25 ° C). Смотрите Таблицу материалов для коммерческого источника 10 x корректура реакции буфера. Конечная концентрация каждого ddNTP в реакции составляет 0,1 мм.
  4. Разбавить ДНК-полимеразы в ледяной 1 x корректура буфер реакции к желаемой концентрации [например, microcentrifuge 1,5 мл пробирку, мкл 4 1 x корректура буфер реакции и 1 мкл полимеразы фрагменты 5-U от коммерческого источника (таблицы из Materials)]. Храните разбавленные фермента на льду во все времена.
    Примечание: Объем разреженных ДНК-полимеразы достаточно для 2 реакции; пропорционально соответствующим образом увеличить объем ферменты для нескольких реакций. Объем 2.0 мкл, содержащий 2.0 единицы полимеразы фрагменты, можно корректировать более половины 50 пмоль T-G терминала несоответствие P21/T28 в 5 мин.
  5. Prewarm microcentrifuge трубка с субстрата микс из шага 2.3 до требуемой реакции температуры (например, обычно 37 ° C для фрагменты полимеразы и 25 ° C для T4 ДНК-полимеразы). Затем передача 2.0 мкл разбавленного полимеразы дна от шаг 2.4 в подогретую субстрата смесь и Флик трубки смешать ее содержимое.
  6. Центрифуга трубки с фермента и субстрата на несколько секунд на 3200 x g при температуре окружающего воздуха в спину вниз компоненты реакции. Сразу передача реакция на Отопление блока или на водяной бане при температуре инкубации желаемого как шаг 2,5.
  7. Прекратить реакции
    1. Добавить одинаковый объем буферизации фенола, смешать его с vortexing на несколько секунд и центрифуги в microcentrifuge на 3200 x g при комнатной температуре в течение 5 мин.
      1. Перенесите водяной участок чистой microcentrifuge трубки и добавить равное количество метилхлороформа, смешать его с vortexing за несколько секунд и центрифуги в отцентрифугировать на 3200 x g на 3 мин при температуре окружающего воздуха для передачи водяной участок чистой отцентрифугировать трубки и в cubate он на 95 ° C за 5 мин; затем поместите его на льду.
        Предупреждение: Фенола и хлороформа являются опасными химическими веществами. Обработка и удаление отходов утилизации должны следовать институциональные правила.
    2. Кроме того использование кислоты, закалки протокол. Для этого добавьте 2 мкл HCl 1 M, остановки реакции на льду за 6 минут, а затем 0,64 мкл 1 М Диэтаноламина (DEA) для нейтрализации рН реакционной смеси и Инкубируйте на 95 ° C за 5 мин; затем поместите его на льду.

3. смола дополнение к ликвидации загрязнения соли

  1. С помощью смолы совок из коммерческих обессоливания комплекта (см. Таблицу материалы), принять достаточно смолы для покрытия ямочки пластину ямочка 384-ямка, 6 мг смолы.
  2. Равномерно распределите все ямочки смолы (6 мг/ямка) соскабливания в верхней части плиты. Восстановить любые излишки смолаа и заменить его в бутылки.
  3. Перенесите продукты окончательной реакции от шага 2.7 из трубок отцентрифугировать 384-ну пластины. Лунки 16 мкл H2O разбавить окончательной реакции продуктов в каждой скважине печать пластину и центрифуги его, чтобы удалить любые пузыри.
  4. Удалить уплотнение, поверните пластину 384-колодец с продуктов реакции вверх дном, чтобы крышка смолы заполнены лунки.
  5. Переверните хорошо ямка пластин сэндвич и тщательно пусть падение в пластину 384-ну смолы (убедитесь, что плита 384-ну заподлицо с металлической колышек на пластину смолы заполнены ямочка).
  6. Удалить пластину ямочка на вершине, печать пластину 384-Ну, содержащие смеси продуктов реакции и смолы, кратко центрифуги на 3200 x g, чтобы удалить любые пузыри и поместите его на вращателе по крайней мере 15 минут при комнатной температуре для обессоливания его содержимое.
  7. После очистки смолы центрифуга 384-ну пластины на 3200 x g за 5 мин до компактных смолы в нижней части скважины.

4. Передача продуктов реакции матрицы микросхемы

  1. Установить пластины образца в дозатор nanoliter (nanodispenser, см. Таблицу материалов).
  2. Положите матрица чип (см. Таблицу материалы) и 384-ну пластина из раздел 3.7 в соответствующий лоток.
  3. Действуют nanodispenser на месте продуктов реакции на чип; на сенсорном экране nanodispenser чтобы начать, нажмите кнопку запустить .
  4. Проверьте автоматизированная образ образца пятна, содержащие насыщения информацию на экране, чтобы обеспечить общий объем пятнистый на чипе около 5-10 nL. Повторите образца, кровянистые выделения, если объем недостаточен.

5. Установка Assay информацию о масс-спектрометрия

  1. Подготовьте файл в формате xls, содержащий сведения о ожидаемого сигнала для импорта. Например используйте параметр «P21_T28.xls» (Таблица 2) для корректуры реакции P21/T28 в шагах 2, 3 и 4.
  2. Создание и определение новых пробирного в прикладной программе (см. Таблицу материалы), щелкните правой кнопкой мыши Группу Assay импорта в формате конструктор и выберите xls-файл (например, «P21_T28.xls» от шага 5.1).
  3. Установить целевой пробирного плита через Клиента: проект: плита параметр дерево в левой части экрана, щелкните правой кнопкой мыши в верхней части дерева и давая ему имя файла (например, «CTT20171201» представляет код пробирного и дата).
  4. Выберите тип 384-ну пластины и нажмите OK; появится пустая печатная форма.
  5. Выберите соответствующую пробу (например, P21_T28) в левой части экрана.
  6. Назначьте выбранный пробу (например, P21_T28) для каждого образца, пятнистый образца позиции на фишку, выделив колодец и щелкнув правой кнопкой мыши, выберите Добавить Plex.
  7. Подготовьте рабочий список всех тестов на чип в формате XLSX без заголовка (например, 1201.xlsx в таблице 3). Импорт рабочих список через параметр Добавление нового образца проекта .
  8. Назначить тест в списке рабочие (например, от 1201.xlsx) для каждой позиции P21_T28 пробирного и выбрать, щелкнув правой кнопкой.

6. MALDI-TOF MS операция

  1. Ссылка масс-спектрометр на чип с помощью прикладной программы (см. Таблицу материалов).
  2. Выберите параметр по умолчанию в правой части экрана.
  3. Заполните имя пробирного из шага 5.3 (например, CTT20171201), ID чипа на углу чип и сохранить настройки.
  4. Запустить программу управления MS (см. Таблицу материалов).
  5. Нажмите на кнопку In/Out и вынуть пластину разведчик. Место пятнистый чип от шага 4.4 на пластину разведчик и нажмите на кнопку In/Out для пятнистый чип, чтобы войти в масс-спектрометр.
  6. Нажмите кнопку получить прикладной программы (см. Таблицу материалы), чтобы начать масс-спектрометрии и получения данных.

7. анализ данных

  1. Откройте программу для анализа данных (см. Таблицу материалы).
  2. Просмотр дерева базы данных в левом верхнем углу и выберите чип идентификатор шага 6.3. Откройте файл данных на правой стороне экрана.
  3. Щелкните значок для отображения массовых спектр спектра. Чтобы обрезать определенного диапазона m/z, щелкните правой кнопкой мыши выберите Диалоговое окно настройки и в новом окне нажмите на оси x и задать требуемый верхний и нижний предел и нажмите OK для отображения указанного диапазона спектра.
  4. Экспортируйте спектра для учета, щелкнув правой кнопкой Экспорт.
    Примечание: Используя шкалу блока ширины/1200 1600 это подходящий размер для проверки данных на экране компьютера.
    1. Выберите тип файла JPEG, нажмите на пункт назначения, выберите Просмотр диска (например, флэш-диск E:), введите имя файла (например, 1201-1.jpg) и затем нажмите на Экспорт.
  5. Для данных количественный используйте курсор и нажмите на пик Показать пик высотой в верхнем левом углу.
    1. Кроме того распечатывать экспортированном файле JPEG и измерить высоту пика с правителем вручную.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Шаблоны и грунты:

С помощью процедуры, представленные здесь, равное Молярная синтетических олигонуклеотида шаблоны и грунтовки соответствующих последовательностей, получены из коммерческих источников были проверены на предмет их чистоты и качества (Рисунок 3А; Примечание сигналы соответствуют назначенный масса и низким фоном) а также для взаимоотношений между пиковой интенсивности и массы исследуемое вещество (рис. 2A). Пик высот были измерены и рассчитывается (рис. 2B) для нормализации данных MS.

Состояния и массы спектры реакции:

Ранее было показано, что использование единого базового грунтовка расширение реакций в сочетании с MALDI-TOF MS для генотипирования возможно, с использованием стандартных ddNTPs терминаторы17. Корректура анализа с помощью стандартных ddNTPs похож на singleplex реакции генотипирования, но гораздо проще и очень легко выполнить, чтобы получить чистые и надежные результаты.

МС спектры охватывает все сигналы, генерируемые грунты и шаблоны (рис. 3). Надлежащего дизайн шаблонов и капсюли созданный профиль хорошо разделенных сигнала для шаблонов и капсюли (рис. 3). Согласно значение m/z сигналы от шаблоны и их частичной деградации неспецифичные продукты (m/z > 7000) также были отделены от несоответствующих праймеры и корректировать товары (m/z < 7000 на рис. 3). При необходимости, представляя нуклеиназы устойчивостью фосфоротиоат облигаций заменить последние 4 Фосфодиэфирная облигации на 3' концу шаблона (Таблица 1; T28S4/P21) может уменьшить неспецифической шаблон гидролиз (Рисунок 3 g; d27).

В отсутствие дНТФ KF имеет надежный 3'-при exonuclease и способных разлагать грунтовка и шаблон в vitro21. Как родной дНТФ 4 Добавление 4 ddNTPs предотвращает 3' конец деградации KF (рис. 3 c и 3E). Аналогичным образом один нуклеотид расширение 3'-конца добавляет повышенную стабильность грунтовка. С помощью pol вычитка условия, ранее описанным20 с 10 U (46 пмоль) КФ, более чем 80% 50-пмоль несоответствующие субстратов были исправлены в 5 минут (рис. 3 c, 3Eи 3 G).

Промежуточные и механизм анализа:

MALDI-TOF MS резолюции может быть тонкая, как 1 Далтон; действительно все субстраты, продуктов и полупродуктов с массовые изменения в реакции может быть решена в том же МС спектр выбранного диапазона. Например терминал Т-G несовпадение, несоответствующие G в грунт terminus была исправлена с включением ДВР с разницей лишь 32 m/z. Такая разница m/z могут быть легко идентифицированы на МС спектра в диапазоне m/z от 5000 до 7000 (рис. 4A). Изменение каждого индивидуального сигнала можно рассчитать путем суммирования всех сигналов от несоответствующих грунт, иссечение интермедиатов и корректуру продуктов как 100%. Например в T-G корректура реакции, исправленный продукт относительно иссечение продукт был 23% по сравнению с 17% в 5 мин, 31% по сравнению с 18% в 10 мин и 69% против 14% в 20 мин (рис. 4A).

Когда в грунт, последние 2 присутствует несоответствие предпоследний T-G nt следует подакцизным следуют ДВР дополнение для завершения коррекции. Действительно правильные продукты увеличилась с временем от 12% в 5 мин, 28% в 10 мин, до 45% в 20 мин реакции. Кроме того две формы иссечение продуктов для предпоследнего T-G, корректура, 1-nt иссечение промежуточные и 2-nt иссечение продуктов, были легко различимыми (рис. 4В).

Корректура кинетика с одной dNTP:

Для Поль ДНК кишечной палочки , ddNTPs не являются подходящим субстратов и должно рассматриваться как ингибиторы22. Кроме того с помощью единого «правильного» dNTP в корректура реакции вместо этого будет также подавить неспецифической 3' - 5' деятельность при exonuclease и поколения единичных нуклеотидных расширение продуктов подходит для анализа MS (Рисунок 5B). Корректура курса, полученные от реакций, содержащий один дЦТФ примерно в два раза выше, чем реакции, содержащий 4 ddNTPs (Рисунок 5A, 5Bи 5 C). Таким образом использование единого «правильного» dNTP в корректура assay результатом будет лучше без тормозящее действие ddNTPs. Этот подход должен обеспечить большую чувствительность для корректуры кинетического анализа.

Корректура внутреннего несоответствия:

МС, корректура анализов с использованием KF для внутренних несоответствий и определение корректируемого продукты просты (т.е., корректура exonuclease акцизов нуклеотидов с 3' конца внутреннего несоответствия праймеры), следуют Добавление соответствует ddNMP для иссечения продуктов через полимеразы функция генерации корректируемый продуктов, короче, чем грунт субстратов (рис. 6). Наблюдалась четкая тенденция корректуры эффективности, где KF эффективно корректировать несоответствия в последний, предпоследний, 3rd и 4-й нуклеотидов с 3' конца грунтовки (рис. 6; ММ1, 2, 3 и 4). Не соответствует 5 nt от 3' конца праймера были исправлены частично с < 15% коррекции несоответствия и > 15% грунтовки, показал расширение без корректуры (рис.6; ММ5). KF не корректировать несоответствия, дислоцированные в 6, 7, 8 и 9 nt от 3' конца праймера (рис. 6; MM6, 7, 8 и 9) но все еще продлен значительную долю субстратов (рис. 6; PE MM6, 7, 8 и 9).

Ремонт deoxyinosine поражения:

В E. colideoxyinosine в ДНК обрабатывается главным образом Эндо V ремонт пути20,23. Эндо V инициирует реакцию, разрез на втором Фосфодиэфирная связь 3' ди поражения. Перерыва стренги созданы считается использоваться ГСМ для последующих поражений иссечение и ДНК ресинтеза24. Эта процедура была применена для тестирования Поль я ремонт субстраты, содержащие ди на 3' предпоследнем месте (Таблица 1; -Я, C-I, G-I и Т-я) для проверки этой гипотезы. Ремонт 3' предпоследний ди аналогична корректура предпоследнего несоответствие T-G (Рисунок 4B и 6; Запись в мм2), в котором последние 2 nt должны быть удалены следуют добавлением правильного ddNMP для завершения ремонта. Шаблоны MS ясно показали пол, я исправил heteroduplexes A-I, G-I и T-я, хотя и с различными эффективности (рис. 7; RP сигналов). Однако C-я субстрат был огнеупорные для ГСМ, я ремонт (Таблица 1 и рис. 7 d и 7E; очень низкой RP) и продемонстрировал выдвижение праймера в значительной степени (рис. 7 d; PE сигнал).

Figure 1
Рисунок 1 . Модель системы проверки правописания пробирного. Несоответствие грунт был отожженная как указано в шаблон, образуя несоответствие терминала (жирным шрифтом). Корректура exonuclease ДНК полимеразы будет обнаруживать и удалять несоответствующие нуклеотидов, образуя иссечение продукта. Присутствии ДНК-полимеразы и четыре ddNTPs иссечение продукта продлевается на единую базу дополняет предыдущий сайт несоответствие. Когда подвергается MALDI-TOF, разница в массе между несоответствие грунт, иссечение продуктов и корректируемого продуктов может быть решена. (Эта цифра приспособлен от Су и др. 25 с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Пика интенсивности и олигонуклеотида Массачусетс Восемь олигонуклеотиды от 17 до 24 nt с последовательностями в дополнение к 3' конца T28 (Таблица 1) были протестированы. (A) A смесь 50 пмоль каждого олигонуклеотида в 40 мкл решения был подвергнут анализу MS. (B) пик высотой 17 nt был использован как 100% для расчета. Интенсивности относительной сигнала для каждого олигонуклеотида был в среднем шесть определений и погрешностей представляют 1 стандартное отклонение. (Эта цифра приспособлен от Су и др. 25 с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Эффект различных шаблонов дизайна. Корректура реакции были оценены с праймером P21, образуя несоответствие терминал Т-G с разными шаблонами. Корректура assay была выполнена с 10 U (43 пмоль) фрагменты полимеразы, 50 пмоль субстрата и 4 ddNTPs при 37 ° C за 5 минут (A) Эта группа показывает подложке P21/T32 T-G без фермента. (B) Эта группа показывает выдвижение праймера P21/T32 T-A субстрата при exonuclease 3' несовершенным фрагменты. PE = грунт расширения продукта. (C) Эта панель показывает, корректура P21/T32 T-G субстрата. PP = корректура продукта; D26, d27, d28 = 3' конца деградировавших шаблон. (D) Эта группа показывает подложке P21/T28 T-G без фермента. (E) Эта панель показывает, корректура P21/T28 T-G субстрата. PP = корректура продукта; D26, d27 = 3' конца деградировавших шаблон. (F) Эта группа показывает подложке P21/T28S4 T-G без фермента. (G) Эта панель показывает, корректура P21/T28S4 T-G субстрата. PP = корректура продукта; EP = иссечение продукции; D27 = шаблон деградации побочным продуктом. (Эта цифра приспособлен от Су и др. 25 с разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Время курса анализ продуктов иссечение и корректура. Корректура анализы были проведены с 2 U (8.6 пмоль) КФ и 50 пмоль субстраты, как описано в протоколе. Реакции были закаленных в указанных раз. (A) группа показывает корректура 3' терминал Т-G несоответствия; EP = корректура иссечение продукта; D18 & d19 = избыток иссечение побочных продуктов; PP = корректура продукции; P21 = несоответствие грунтовка. (B) этой группы показывает, корректура несоответствие 3'-предпоследний T-G; EI-1 = иссечение промежуточных; EP-2 = корректура иссечение продукции; D18 = избыток иссечение побочный продукт; PP = корректура продукции; P21 = несоответствие грунт; Na = нуклеотидов связаны ион натрия. (Эта цифра приспособлен от Су и др. 25 с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 . Корректура реакции с 4 ddNTPs против одного dNTP. Корректура анализы были проведены с 0.1 U (0.43 пмоль) КФ и 50 пмоль субстраты, как описано в протоколе. Реакции были закаленных в указанных раз. (A) группа показывает корректура 3' терминал G-G несоответствие с 4 ddNTPs; EP = корректура иссечение продукта; PP = корректура ресинтеза продукции; P21G = несоответствие грунтовка. (B) этой группы показывает, корректура 3' терминал G-G несоответствие с дЦТФ; PP = корректура ресинтеза продукции; P21G = несоответствие грунтовка. (C) коррекции уровней в среднем трех определений и погрешностей представляют 1 стандартное отклонение. Na+ = нуклеотидов связаны ион натрия. (Эта цифра приспособлен от Су и др. 25 с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 . Корректура внутренних несоответствий. Корректура анализов были выполнены с 2 U (8.6 пмоль) фрагменты полимеразы и 50 пмоль субстратов в 37 ° C в течение 20 мин, как описано в протоколе. Пустой = пустой фермента MM1 субстрата. MM1 = подложке P21/T28 T-G; Мм2 до MM9 = субстратов с внутренних несоответствий, цифры указывают на несоответствие позиции относительно 3' конца. P21 = несоответствие грунты; PR = корректируемого продукции; PE = расширенный грунты; D19 и d20 = избыток иссечение побочных продуктов, числа представляют размер нуклеотидов. (Эта цифра приспособлен от Су и др. 25 с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 . Ремонт 3' предпоследний deoxyinosine поражений. Ремонт анализов были выполнены с 2 U фрагменты полимеразы и 50 пмоль субстратов в 37 ° C, как описано в шаге 2.3 протокол. Реакции были закаленных в указанных раз. Эти панели показывают реакции с (A) T-я субстрата; (B) G-я субстрата; (C) A-я субстрата; и (D) C-я субстрата. RP = ремонт продукции; EP = иссечение продукции; PE = грунт расширение продуктов, Na+ = натрия Ион аддукты. (E) коррекции уровней для T-I, G-I и A-я был в среднем трех определений и погрешностей представляют 1 стандартное отклонение. Коррекции уровней для C-я был в среднем двух определений. (Эта цифра приспособлен от Су и др. 25 с разрешения.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Субстраты Последовательности Коррекция эффективность (пмоль)
P21/T32 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 17.3
5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
P21/T28 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 18.4
5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
P21/T28S4 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 22,9
ММ1 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG
ММ2 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 13.5
5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA
ММ3 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 16,9
5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA
MM4 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 15.1
5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA
ММ5 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA 4.2
5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA
MM6 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < 0.5*
5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA
MM7 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < 0,5
5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA
MM8 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < 0,5
5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA
MM9 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA < 0,5
5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA
A-Я 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT 8.2
5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG
C-Я 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT 1.0
5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG
G-Я 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT 15.4
5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG
T-Я 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT 16,6
5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG

Таблицы 1. Корректура субстратов и эффективности коррекции, фрагменты фрагмент. Эта таблица показывает смелые 4 нуклеотидов в 3'-конце шаблон, содержащий фосфоротиоат изменения. Несовпадающими пар оснований выделены жирным шрифтом. Корректура анализы были проведены с 2 U (8.6 пмоль) фрагменты полимеразы, 50 пмоль субстрата и 4 ddNTPs при 37 ° C на 10 мин * эти значения являются нижних пределов для уровня корректура, потому что фоновый шум мешает точные оценки < 1% общей массы сигналов наблюдается. (Эта цифра приспособлен от Су и др. 25 с разрешения.)

КОЛОДЕЦ СРОК SNP_ID 2 PCRP 1 PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF TM PcGC PWARN UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_CALL EXT1_MASS
W1 iPLEX T28 NA NA NA NA NA NA NA F 8524.54 ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA
W1 iPLEX P21 NA NA NA NA NA NA NA F 6495.24 TACCAGTCAGGACGTTGGGAA

В таблице 2. Файл T28_P21.xlsx. Параметр используется для 3D рисунок, 3E, 4Aи 5A.

1201-1
1201-2
1201-3
1201-4
1201-5
1201-6
1201-7

В таблице 3. файл 1201.xlsx. Параметр используется для 7 реакций в рисунке 4A.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Это исследование описано пошаговое корректура деятельности пробирного анализируемой выбранного коммерческого инструмента (см. Таблицу материалы) с использованием MALDI-TOF MS. Основные преимущества включают, что грунт и шаблон, лейбл бесплатно и легко выполнять, позволяя большую гибкость в проектировании экспериментов. Полная обработка 30 корректура тестов будет принимать 4 ч, в том числе 3 h для выполнение вручную корректура реакций и их очистки, во время анализа MALDI-TOF MS, с использованием вышеупомянутого протокола занимает 1 час для завершения потока известь. Основным недостатком этого метода является количество субстрата, необходимых для анализа. Для получения сильных сигналов и последовательные результаты, мы использовали 50 пмоль субстрат ДНК в 20 мкл реакции; Таким образом количество ДНК намного выше, чем с radiolabeled дна эксперименты8,9,10. Сокращение объемов и размер выборки и тонкой настройки MS операция может снизить количество субстрата необходимых.

Синтетические олигонуклеотиды, получены из коммерческих источников может использоваться для корректуры исследования непосредственно без каких-либо дальнейших очистки или лечения. Однако желательно, чтобы проверить чистоту и качество дна, MALDI-TOF MS. Облигации фосфоротиоат были введены заменить последние 4 Фосфодиэфирная облигации на 3' концу шаблона (Таблица 1) для уменьшения деградации неспецифической стренги шаблон (рис. 3 g), хотя и в более высокой стоимости на сэмпл. Интересно, что сигналы от шаблона и грунтовка ДНК могут быть хорошо отделены MS в силу их различия в размерах; Таким образом эта модификация фосфоротиоат не требуется. В рисунке 3E, например, все возможные продукты выдвижение праймера P21 и корректура иссечение и ресинтеза были меньше чем 22 nt (m/z < 7000), а все фрагменты деградации из шаблона T28 были больше, чем 24 nt (m/z > 7000 ). Результаты в рисунке 4A были от же P21/T28 двухуровневый набор как в рисунке 3E. Увеличенные окна m/z 6000-7000 показывает только сигналы от грунтовки ДНК без каких-либо смешанные сигналы из шаблона.

Стратегия использования грунтовки с расширением ddNMP оказался весьма стабильным, и, таким образом, ddNMP продуктов, содержащих являются хорошими индикаторами для корректуры assay. Добавление ddNMP иссечение продуктов может «замораживание» корректура продукты в состоянии для анализа сразу после иссечения. Кроме того с помощью единого правильного dNTP (Рисунок 5B) вместо 4 ddNTPs для подавления неспецифической гидролитическая активность корректура exonuclease также возможно.

Остановки реакции с процедурой извлечения стандартного фенол/метилхлороформа оказалось наилучшим средством для прекращения реакции так как, в один шаг, он позволяет реакции останавливаемых устранив также протеина вмешательства. Кроме того тушения, кислоты, которая поддается автоматизации, то нейтрализованы неметаллических щелочной без разделение фаз, также продемонстрировали надежные результаты. Аддукты ионов натрия (Na+ на рис. 4, 5и 7) являются беспокойство, поскольку они могут увеличить фон и осложнить сигнала дискриминации. Правильное использование чистой смолы может уменьшить такого вмешательства; Тем не менее, даже когда такие аддукты присутствуют, они обычно имеют гораздо меньшие вершины по отношению к их родителей сигнал, и это свойство может использоваться для различия между ними (рис. 4, 5и 7). Как правило, пик высотой натрия аддукты был пропорционален основные пики; Включение или исключение натрия аддукты в расчет не влияет существенно на результаты количественной оценки. Таким образом для количественной оценки, мы использовали основных пик высотой только для расчета.

Корректура экспериментов описанных здесь воспользовался внутреннего несоответствия продемонстрировать важность при exonuclease раздела домена пробирного KF26 и подробные ДНК-полимераза я возможность эффективно корректировать несоответствия в вверх до 4 nt вверх по течению от грунт 3'-конца (рис. 5, MM1 - 4) возможно благодаря стабильности базы сопряжения на грунт шаблон развязок27. Кроме того это исследование также используется грунты, содержащие предпоследний deoxyinosine поражения для изучения ГСМ, которую я ремонт Эндо V-порезал ремонт интермедиатов. Результаты показали, что T-я отремонтировали более эффективно, чем A-I и G-I; Однако C-я был огнеупорные для ГСМ, я ремонт (Таблица 1 и рис. 7). Эти результаты подтверждают, что анализ MALDI-TOF MS может быть очень полезным для корректуры и различных коротких патч репарации ДНК assays28 из-за его высокого разрешения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим NCFPB комплексной основной объект для функциональной геномики (Тайбэй, Тайвань) и в NRPB Фармакогеномика лаборатории (Тайбэй, Тайвань) за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана научно-исследовательских грантов от министерства науки и технологии, Тайбэй, Тайвань, РПЦ [наиболее 105-2320-B-002-047] для Ху Вэй-Яо, Тайваньский фонд здоровья (L-и.л.) [наиболее 105-2628-B-002-051-MY3] для Су Кан-Йи и [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] для Линь Лян в.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligonucleotides Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment New England Biolabs, MA M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-) New England Biolabs, MA M0212L
NEBuffer 2.1 (10X) New England Biolabs, MA B7202S
2', 3' ddATP Trilink Biotechnologies, CA N4001
2', 3' ddGTP Trilink Biotechnologies, CA N4002
2', 3' ddTTP Trilink Biotechnologies, CA N4004
2', 3' ddCTP Trilink Biotechnologies, CA N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set Clubio, Taiwan CB-R0315
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA #01509
MassARRAY Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA #10145
Clean Resin Tool Kit Agena Bioscience, CA #08040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
  2. Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
  3. Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
  4. Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
  5. Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
  6. Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
  7. Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
  8. Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
  9. Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
  10. Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
  11. Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
  12. Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
  13. Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
  14. Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
  15. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  16. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
  17. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
  18. Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
  19. Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
  20. Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
  21. Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
  22. Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
  23. Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
  24. Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
  25. Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
  26. Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
  27. Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
  28. Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).

Tags

Биохимия выпуск 136 ДНК-полимеразы корректура репарации ДНК MALDI-TOF масс-спектрометрии единичных нуклеотидных расширение dideoxyribonucleotide трифосфат несоответствие ДНК ошибка репликации ДНК
Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Su, K. Y., Goodman, S. D., Lai, H.… More

Su, K. Y., Goodman, S. D., Lai, H. M., Yen, R. S., Hu, W. Y., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Fang, W. H. Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57862, doi:10.3791/57862 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter