Summary
Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.
Abstract
De handhaving van het genoom en de trouwe replicatie is essentieel voor het behoud van de genetische informatie. Om te beoordelen HiFi replicatie, hebben we een eenvoudige niet-gelabeld en niet-radio-isotopische methode met behulp van een laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie met time-of-flight (MALDI-TOF) massa spectrometrie (MS) analyse voor een proeflezen studie. Hier, een polymerase van DNA [bijvoorbeeld het Klenow fragment (KF) van de polymerase van DNA van Escherichia coli ik (pol ik) in deze studie] in het bijzijn van alle vier dideoxyribonucleotide trifosfaat is gebruikt voor het verwerken van een niet-overeenkomende primer-template-duplex. De niet-overeenkomende primer is vervolgens proeflezen en verruimde en onderworpen aan de MALDI-TOF MS. De producten worden gekenmerkt door de massale verandering van de primer tot één nucleotide variaties. Nog belangrijker is, kan een proeflezen ook worden bepaald voor interne enkele problemen, zij het op verschillende efficiëntie. Gelegen op 2-4-nucleotiden (nt) van de 3'-eind incongruenties werden efficiënt Review door pol ik, en een mismatch op 5 nt van het eindstation van primer bleek slechts een gedeeltelijke correctie. Voor interne incongruenties gelegen op 6-9 nt vanaf de primer 3' einde plaatsvond geen proeflezen. Deze methode kan ook worden toegepast op DNA testen (bijvoorbeeld, beoordeling van de reparatie van een base-laesie van substraten voor de endo V reparatie pathway) reparatie. Inleidingen met 3' voorlaatste deoxyinosine (dI) laesies kunnen worden gecorrigeerd door pol ik. Inderdaad, voorlaatste T-ik, G-I, en A-ik substraten had hun laatste 2 dI-bevattende nucleotiden weggesneden door pol ik alvorens een juiste ddN 5'-monofosfaat (ddNMP) toe te voegen terwijl voorlaatste C-ik incongruenties werden getolereerd door pol I, waardoor de primer worden uitgebreid zonder herstellen, demonstreren dat de gevoeligheid en de resolutie van de MS assay voor het meten van de DNA-herstel.
Introduction
De proeflezen functies van de polymerase van DNA tijdens de DNA-replicatie zijn van essentieel belang om ervoor te zorgen de hifi van genetische informatie die moet worden overgedragen aan nakomelingen1,2,3,4, 5,6,7. Zijnde kundig voor het beoordelen van de bijdragen van polymerase proeflezen van exonucleases zou het verduidelijken van de mechanismen om genetische stabiliteit te waarborgen.
Isotoop labeling en gel gebaseerde testen in combinatie met densitometric analyses van autoradiograms of fosfor imaging8,9,10 zijn traditioneel gebruikt voor het detecteren van proeflezen activiteit van DNA polymerase. Hoewel functioneel, zijn deze tests arbeidsintensief, duur en niet vatbaar voor high-throughput formaten. Daarnaast lijden de radio-isotopen veiligheidskwesties met inbegrip van de verwijdering van afval. Anderzijds hebben proeflezen activiteiten zijn geanalyseerd door fluorimetrische technieken. 2-aminopurine (2-AP) kan bijvoorbeeld worden opgenomen in extensie producten tijdens in vitro polymerase proeflezen testen om te produceren een fluorescent signaal11,12. Helaas, deze benaderingen lijden onder een lage specificiteit, aangezien 2-AP met zowel thymine en cytosine koppelen kunt. Meer recente benaderingen omvatten een gevoelige G quadruplex-gebaseerde verlichte schakelaar-op sonde voor een polymerase van 3' - 5' exonuclease assay13 , alsmede een afzonderlijk-label fluorescente sonde voor een polymerase van proeflezen assay overwint enkele van de bovengenoemde nadelen14. Enthousiasme voor deze fluorimetrische methoden is verminderd als gevolg van de noodzaak van de specifieke etikettering van DNA substraten.
In tegenstelling, een MALDI-TOF MS voor DNA-analyse is werkzaam in de PinPoint-assay, waar de primer extensie reacties met labelloze 4 ddNTPs kunnen worden gebruikt voor het identificeren van polymorfismen bij een bepaald locus15,16,17 en grote schaal is goedgekeurd in klinische toepassingen voor mutatie detecties en kanker diagnoses18. Met behulp van deze fundamentele beginselen, hebben we een label-gratis test voor de bepaling in vitro van DNA-polymerase activiteit benutting van de hoge resolutie, hoge specificiteit en high-throughput potentieel van MALDI-TOF MS. gebruiken de E. proeflezen coli polymerase van DNA ik Klenow als een model-enzym, dideoxyribonucleotide trifosfaat (ddNTPs fragment) als substraten een "momentopname nemen kunnen" van proeflezen producten na een single nucleotide uitbreiding via MALDI-TOF MS (Figuur 1).
Ook werd deze methode ook ontwikkeld voor een DNA repair assay waar inleidingen met 3' voorlaatste dI laesies zijn onderworpen aan een pol die ik herstellen assay welke nabootsers endo V gejat reparatie tussenproducten. Hoewel niet volledig begrepen, is de endo V reparatie traject het enige reparatie systeem bekend om de pol in dienst ik proeflezen exonucleaseactiviteit voor laesie excisie19,20. Met behulp van MALDI-TOF MS, laten we zien een duidelijk omschreven reparatie patch waar dI kan worden weggesneden door pol ik wanneer die zich voordoen in de laatste 2 nt van de primer voordat u toevoegt de juiste aangevuld nucleotide.
Voor de studie van proeflezen en DNA-herstel, deze methode is sneller en minder arbeidsintensief dan eerdere methoden en biedt extra informatie naar mechanisme en functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. primer/sjabloon voorbereiding
- Ontwerpsjablonen inleidingen/met een evenwichtige G + C gehalte tussen 40% en 60% in een volgorde of PCR primer ontwerp. Gebruik van inleidingen van 18 tot en met 21 nt voor een passende gloeien en betere MS signalen.
- De ontwerpsjabloon door 50 ° C als het minimum smelttemperatuur voor de duplex regio met ten minste 7 nt van 5'-overhang om te scheiden van de signalen tussen de primer en de sjabloon.
Opmerking: bijvoorbeeld voor het substraat P21/T28 in tabel 1, de 21-nt primer is gekoppeld aan een 28-nt-sjabloon. Optie: het gebruik van alternatieve nucleic zuren zoals nuclease-resistente phosphorothioate obligaties ter vervanging van de laatste 4 phosphodiester banden aan de 3'-eind van de sjabloon kunt mogelijke storingen voorkomen door een aspecifieke 3' eind degradatie van de sjablonen ( bijvoorbeeld, T28S4 in tabel 1), hoewel dit sommige kosten voor de voorbereiding van de sjabloon toevoegen zal. - Met behulp van standaard ontzout oligonucleotides zonder verdere zuivering is bevredigend voor deze studie. Oligonucleotide primers/sjablonen gebruiken bij een concentratie van 100 pmol/µL in H2O als een voorraad en opslaan bij-20 ° C. Controleer de kwaliteit en zuiverheid van de inleidingen en sjablonen door de oligonucleotides waarop MALDI-TOF MS (stappen 4-7) om unieke piek signalen en een goede signaal / ruisverhouding.
- Het bepalen van de relatieve MALDI-TOF MS signaal intensiteiten (stap 7) van de gelijke molaire inleidingen van de relevante reeksen in de reactie voor kalibratie en concentratie normalisatie (Figuur 2).
2. proeflezen reacties
Opmerking: De dezelfde proeflezen reactie staat en het protocol is van toepassing op een DNA-herstel van A-I, G-I, C-I, en T-ik.
- Met behulp van een T-G mismatch van substraat P21/T28 voor het proeflezen in tabel 1 als voorbeeld, Verdun primer P21 en sjabloon T28 12,5 pmol/µL met H2O; 12 µL van de verdunde primer en 12 µL van de verdunde sjabloon vervolgens overbrengen naar een 1.5-mL gesteriliseerde microcentrifuge buis.
Nota: Het bedrag van de sjabloon/primer mix is voldoende voor 2 Reacties; proportioneel vergroten het volume van de reagentia dienovereenkomstig voor meerdere reacties. - Sluit de buis strak. Incubeer het 30 min in een overdekte 65-° C waterbad, gevolgd door 30 minuten in een waterbad 37 ° C, en ten slotte op het ijs om een juiste gloeien.
- Tot een gesteriliseerde microcentrifuge 1.5-mL koker, voeg 8 µL primer en sjabloon mix (50 pmol), 2 µL van 10 x proeflezen reactie buffer, 4 µL van 4 ddNTPs mix (2 mM van elk 4 dNTPs) en H2O tot 18 µL. Flick de buis te mengen.
Opmerking: 1 x proeflezen reactie buffer bevat 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, dithiothreitol van 1 mM en 10 mM Tris-HCl (pH 7,9 bij 25 ° C). Zie de Tabel van materialen voor de commerciële bron van 10 x proeflezen reactie buffer. De uiteindelijke concentratie van elke ddNTP in de reactie is 0.1 mM. - Verdun de polymerase van DNA in ijskoude 1 x proeflezen reactie buffer tot de gewenste concentratie [bijvoorbeeldnaar een 1.5-mL microcentrifuge buis, Voeg 4 µL 1 x proeflezen reactie buffer en 1 µL van 5-U Klenow polymerase van een commerciële bron (tabel van Materials)]. De verdunde enzym op ijs te allen tijde opslaan.
Opmerking: De hoeveelheid verdunde polymerase van DNA is voldoende voor 2 Reacties; proportioneel vergroten het volume van de enzymen dienovereenkomstig voor meerdere reacties. Een volume van 2.0 µL, met 2.0 eenheden van Klenow polymerase, kan meer dan de helft van de 50 pmol van T-G terminal niet-overeenkomende P21/T28 in 5 min proeflezen. - Prewarm de microcentrifuge-buis met de mix van het substraat vanaf stap 2.3 tot de gewenste reactie temperatuur (b.v., meestal 37 ° C voor Klenow polymerase en 25 ° C voor T4 DNA-polymerase). Vervolgens breng 2.0 µL van de verdunde polymerase van DNA van stap 2.4 aan het substraat voorverwarmde mengsel en flick de buis te mengen van de inhoud ervan.
- Centrifugeer de buizen met enzym en substraat voor een paar seconden bij 3200 x g bij omgevingstemperatuur te draaien naar beneden van de componenten van de reacties. Onmiddellijk overdracht de reactie op een blok van de verwarming of een waterbad op de gewenste incubatietemperatuur zoals in stap 2.5.
-
Beëindigen van de reactie
- Voeg een gelijk volume van gebufferde fenol, meng het door de vortexing voor een paar seconden en Centrifugeer het in een microcentrifuge bij 3200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- De waterfase overbrengen in een schone microcentrifuge buis en voeg een gelijke hoeveelheid chloroform toe, meng het door de vortexing voor een paar seconden en centrifuge in een microfuge bij 3200 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten aan een schone microfuge buis en in de waterfase overbrengen cubate het bij 95 ° C gedurende 5 minuten; plaats het dan op ijs.
Let op: Fenol en chloroform zijn gevaarlijke chemische stoffen. Behandeling en afval verwijdering moet institutionele regels volgen.
- De waterfase overbrengen in een schone microcentrifuge buis en voeg een gelijke hoeveelheid chloroform toe, meng het door de vortexing voor een paar seconden en centrifuge in een microfuge bij 3200 x g bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten aan een schone microfuge buis en in de waterfase overbrengen cubate het bij 95 ° C gedurende 5 minuten; plaats het dan op ijs.
- U kunt ook een zuur blussen protocol gebruiken Voor dit, voeg 2 µL van 1 M HCl zet de reactie stop op ijs voor 6 min, dan Voeg 0.64 µL van 1 M diethanolamine (DEA) te neutraliseren de pH van het reactiemengsel en na het bebroeden bij 95 ° C gedurende 5 minuten; plaats het dan op ijs.
- Voeg een gelijk volume van gebufferde fenol, meng het door de vortexing voor een paar seconden en Centrifugeer het in een microcentrifuge bij 3200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
3. hars toevoeging aan het elimineren van zout besmetting
- Met behulp van de lepel van de hars van de commerciële ontzouten kit (Zie de Tabel van materialen), neem voldoende hars ter dekking van de kuiltjes van de 384-kuiltje, 6-mg hars kuiltje plaat.
- De hars gelijkmatig verdelen over alle de kuiltjes (6 mg/kuiltje) door schrapen over de bovenkant van de plaat. Eventuele overtollige hars herstellen en vervangen in de fles.
- De uiteindelijke reactieproducten van stap 2.7 van de microfuge buizen naar een 384-well-plate overbrengen. Afzien 16 µL van H2O Verdun de uiteindelijke reactieproducten in elk putje afdichting van de plaat en centrifugeer te verwijderen alle bubbels.
- Verwijderen van de zegel, draai de 384-well plaat met de reactieproducten ondersteboven aan de hars gevulde kuiltje afdekplaat.
- Draai de goed-te-kuiltje platen sandwich en zorgvuldig laat de hars vallen de 384-well plaat (ben zeker de 384-well plaat is tegen de metalen pen op de plaat hars gevulde kuiltje).
- Verwijderen van de kuiltje plaat bovenop, verzegelen de 384-well plaat met de mengsels van de reactieproducten en hars, Centrifugeer het kort bij 3200 x g tot alle bubbels verwijderen en plaats deze op een rotator gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur voor het ontzouten van de inhoud ervan.
- Na het opruimen van hars, centrifugeer de 384-well plaat bij 3200 x g gedurende 5 min te comprimeren de hars naar de onderkant van de putten.
4. reactieproducten overbrengen in een Matrix-Chip
- Instellen van de monster-platen in de nanoliter dispenser (nanodispenser, zie de Tabel van de materialen).
- Zet de matrix chip (Zie de Tabel van materialen) en de plaat 384-well uit sectie 3.7 in de overeenkomstige lade.
- Bedienen van de nanodispenser om ter plaatse de reactieproducten naar de chip; Druk op de knop uitvoeren op het aanraakscherm van de nanodispenser om te beginnen.
- Check de automatische opname van de spots van de steekproef die verzadiging informatie op het scherm om het totale gevlekte volume op de chip rond is 5-10 nL. Herhaal de monster spotting als het volume onvoldoende is.
5. setup de Assay informatieover de Spectrometrie van de massa
- Een bestand in XLS-indeling met daarin de gegevens van de verwachte signaal voor het importeren van voorbereiden. Bijvoorbeeld, de instelling van "P21_T28.xls" (tabel 2) gebruikt voor het proeflezen reactie van P21/T28 in stap 2, 3 en 4.
- Maken en definiëren van een nieuwe bepaling in het toepassingsprogramma (Zie de Tabel van materialen) door met de rechtermuisknop op Assay-groep importeren in Designer-indeling en selecteer het xls-bestand (bijvoorbeeld"P21_T28.xls" uit stap 5.1).
- Stellen de doelgroep assay plaat via de boom optie Klant: Project: plaat aan de linkerkant van het scherm door met de rechtermuisknop op de top van de boom en geeft het een bestandsnaam (bijvoorbeeld, "CTT20171201" geeft de test code en datum).
- Selecteer het type 384-well plaat en druk op OK; Er verschijnt een leeg bord.
- Selecteer de juiste bepaling (bvP21_T28) aan de linkerkant van het scherm.
- Voor elk monster Monster positie op de chip gespot door te wijzen van de put en Schakel Plex toevoegenmet de rechtermuisknop op de geselecteerde assay (bvP21_T28) toewijzen
- Opstellen van een lijst van de werken van alle tests op de chip in de XLSX-indeling met geen header (b.v., 1201.xlsx van tabel 3). Importeer de werkende lijst via de Nieuwe voorbeeldproject toevoegen optie.
- De test in de lijst van werken (bijvoorbeeldvan 1201.xlsx) toewijzen aan elke positie van de bepaling van de P21_T28 en kies door rechts te klikken.
6. MALDI-TOF MS operatie
- De massaspectrometer koppelen aan de chip met behulp van het toepassingsprogramma (Zie de Tabel van de materialen).
- Selecteer de standaardinstelling aan de rechterkant van het scherm.
- Vul de naam van de bepaling uit stap 5.3 (bijvoorbeeldCTT20171201), chip-ID op de hoek van de chip, en sla de instellingen.
- Start het programma MS controle (Zie de Tabel van de materialen).
- Druk op de knop In/Out en neem uit de scout plaat. Plaats de gevlekte chip uit stap 4.4 op de scout plaat en druk op de knop In/Out voor de gevlekte chip te voeren de massaspectrometer.
- Klik op de knop van het verwerven van het toepassingsprogramma (Zie de Tabel van materialen) aan de start van de Spectrometrie van de massa en het verwerven van gegevens.
7. de gegevensanalyse
- Open het programma voor de data-analyse (Zie Tabel van materialen).
- Bladeren van de boom van de database bij de hogere linkerhoek en selecteer de ID chip in stap 6.3. Open het gegevensbestand aan de rechterkant van het scherm.
- Klik op het pictogram van de spectrum om de massaspectrum weer te geven. Als u wilt bijsnijden van een bepaald paginabereik m/z, klik met de rechtermuisknop om te de Customization dialoogvenster selecteren en in het nieuwe venster klikt u op de x-as en instellen van de gewenste bovenste en onderste grenswaarden en druk op OK om de Toon van het opgegeven bereik van het spectrum.
- Exporteer het spectrum voor het bijhouden van een register door te rechtsklikken op exporteren.
Opmerking: Met een kleurenschaal van 1.600 breedte/1.200 eenheid is een redelijke grootte voor inspectie van de gegevens op een computerscherm.- Selecteert u het JPEG-bestandstype, klikt u op bestemming, selecteer Bladeren Disc (bijvoorbeeldflash schijf E:), typt u de bestandsnaam (bijvoorbeeld, 1201-1.jpg) en klik vervolgens op exporteren.
- Voor de kwantificatie van de gegevens, gebruik de cursor en klik op de piek te tonen de piekhoogte op de linker bovenhoek.
- U kunt ook uitprinten van een geëxporteerde JPEG-bestand en de piekhoogte meten met een liniaal handmatig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sjablonen en inleidingen:
Met behulp van de procedure voorgesteld hier, gelijke molaire synthetische oligonucleotide sjablonen en inleidingen van relevante sequenties die zijn verkregen uit commerciële bronnen werden gecontroleerd voor hun zuiverheid en kwaliteit (figuur 3A; opmerking dat de signalen gematched de aangewezen massa en de laag achtergrond) evenals voor de relatie tussen de intensiteit van de piek en de massa van de analyt (figuur 2A). De piekhoogten werden gemeten en berekend (figuur 2B) voor de MS gegevens normalisatie.
De toestand en de massa spectra reactie:
Het gebruik van enkele basis primer extensie reacties MALDI-TOF MS wordt gekoppeld voor genotypering is eerder haalbaar met behulp van standaard ddNTPs afsluitweerstanden17aangetoond. De proeflezen bepaling met behulp van de standaard ddNTPs is vergelijkbaar met een singleplex reactie van genotypering, maar is veel eenvoudiger en zeer gemakkelijk uit te voeren om schone en betrouwbare resultaten te verkrijgen.
De MS-spectra bedekt alle signalen gegenereerd op basis van zowel primers en sjablonen (Figuur 3). Het juiste ontwerp van de inleidingen en sjablonen gegenereerd een goed gescheiden signaal-profiel voor zowel de sjablonen en de inleidingen (Figuur 3). Volgens de waarde van m/z, signalen van sjablonen en hun niet-specifieke gedeeltelijke afbraakproducten (m/z > 7.000) werden goed gescheiden van de niet-overeenkomende inleidingen en proeflezen producten (m/z < 7.000 in Figuur 3). Indien nodig, de invoering van de nuclease resistente phosphorothioate obligaties ter vervanging van de laatste 4 phosphodiester banden aan de 3'-eind van de sjabloon (tabel 1; T28S4/P21) niet-specifieke sjabloon hydrolyse (Figuur 3 g; d27) kan verminderen.
Bij gebrek aan dNTPs, KF heeft een robuuste 3'-exonuclease en is in staat zowel de primer en de sjabloon in vitro21vernederende. Zoals de inheemse 4 dNTPs, de toevoeging van de 4 ddNTPs voorkomt u dat een einde degradatie 3' door KF (Figuur 3 c en 3E). Ook voegt een één nucleotide-verlenging van de 3'-einden verhoogde stabiliteit aan de primer. Met behulp van pol ik proeflezen voorwaarden zoals eerder beschreven20 met 10 U (46 pmol) KF, meer dan 80% van de 50-pmol mismatched substraten in 5 min (Figuur 3 c, 3E, en 3 G) werden gecorrigeerd.
Tussenproducten en mechanisme analyse:
Resolutie van de MALDI-TOF MS kunnen zo fijn als 1 dalton; inderdaad, alle substraten, producten en tussenproducten met een massale veranderingen in de reactie kunnen worden opgelost in hetzelfde MS spectrum van het geselecteerde bereik. Bijvoorbeeld in een terminal T-G-mismatch, werd de niet-overeenkomende G bij het eindstation van primer gecorrigeerd met de opneming van de ontwikkelingsagenda van Doha met een m/z-verschil van slechts 32. Dergelijk een verschil van de m/z kan gemakkelijk worden geïdentificeerd op het spectrum van de MS in een m/z-bereik van 5.000 tot 7.000 (figuur 4A). De wijziging van elke individuele signaal kan worden berekend door optelling van alle signalen van de niet-overeenkomende primer, excisie tussenproducten, en proeflezen producten als 100%. Bijvoorbeeld in de T-G proeflezen reactie was de gecorrigeerde product ten opzichte van het product van de besnijdenis 23% versus 17% op 5 min, 31% versus 18% op 10 min en 69% versus 14% op 20 min (figuur 4A).
Wanneer een voorlaatste T-G-mismatch is aanwezig in de primer, de laatste 2 nt moet worden weggesneden, gevolgd door een toevoeging van de ddA te voltooien de correctie. Inderdaad, de juiste producten verhoogd met de tijd van 12% op 5 min, 10 min, 28% tot 45% op 20 min van de reactie. Daarnaast waren de twee vormen van besnijdenis producten voor een voorlaatste T-G proeflezen, de 1-nt excisie intermediaire en 2-nt excisie producten, gemakkelijk omgezet (figuur 4B).
Proeflezen kinetiek met één dNTP:
Voor E. coli DNA pol ik, ddNTPs zijn niet geschikt substraten en moet worden beschouwd als remmers22. U kunt ook zal met behulp van een enkele 'correct' dNTP in de proeflezen reactie in plaats daarvan ook onderdrukken aspecifieke 3' - 5' exonucleaseactiviteit en de generatie van één nucleotide extensie producten geschikt voor MS analyse (figuur 5B). Het proeflezen tarief verkregen reacties met een enkele dCTP is ongeveer twee keer hoger dan de reacties met de 4 ddNTPs (figuur 5A, 5Ben 5 C). Dus, het gebruik van een enkele 'correct' dNTP in de proeflezen assay levert een beter resultaat zonder de remmende effecten van ddNTPs. Deze aanpak dient een grotere gevoeligheid voor proeflezen kinetische analyses.
Proeflezen van interne incongruenties:
MS proeflezen van testen met behulp van KF voor interne afstemming van de vaardigheden en de identificatie van Review producten eenvoudig zijn (dat wil zeggen, de proeflezen exonuclease accijnzen nucleotiden van 3' eind aan de interne wanverhouding van de inleidingen), gevolgd door de toevoeging van gecompenseerde ddNMP aan de besnijdenis producten via het genereren van de functie van de polymerase proeflezen producten korter is dan de primer substraten (Figuur 6). Een duidelijke trend geconstateerd door een taalprogramma efficiëntie werd waargenomen, waar KF efficiënt proeflezen incongruenties op de laatste, voorlaatste, 3rd en 4th nucleotiden van 3' eind van de inleidingen (Figuur 6; MM1, 2, 3 en 4). Incongruenties op 5 nt van 3' eind van de primer gedeeltelijk werden gecorrigeerd met behulp van < 15% van wanverhouding correctie en > 15% van de primer toonde een uitbreiding zonder proeflezen (figuur6; MM5). KF mislukt om te proeflezen incongruenties gepositioneerd op 6, 7, 8 en 9 nt van 3' eind van de primer (Figuur 6; MM6, 7, 8 en 9) maar nog steeds uitgebreid een aanzienlijk deel van substraten (Figuur 6; PE van MM6, 7, 8 en 9).
Reparatie van de deoxyinosine laesie:
Bij E. coli, wordt deoxyinosine in DNA hoofdzakelijk verwerkt door de endo V reparatie traject20,23. Endo V start de reactie door een insnijding in de tweede phosphodiester band 3' van de laesie dI. Het einde van de strand gegenereerd wordt verondersteld te worden gebruikt door pol I voor een latere laesie excisie en DNA resynthesis24. Deze procedure wordt toegepast om te testen van pol ik herstellen substraten met dI op de 3' voorlaatste site (tabel 1; Een-ik, C-I, G-I, en T-ik) voor het valideren van deze hypothese. De reparatie van de voorlaatste dI 3' is analoog aan het proeflezen van de voorlaatste T-G wanverhouding (figuur 4B en 6; Mm2 vermelding), waarin de laatste 2 nt moet worden gevolgd door een toevoeging van een juiste ddNMP te voltooien de reparatie verwijderd. MS patronen duidelijk gebleken pol ik gecorrigeerd heteroduplexes van A-I, G-I, en T-ik, zij het met verschillende efficiëntie (Figuur 7; RP signalen). Echter, de C-ik substraat vuurvaste de Pol ik de reparatie was (tabel 1 en figuur 7D en 7E; zeer lage RP) en aangetoond dat de uitbreiding van de primer voor een groot deel (figuur 7D; PE signaal).
Figuur 1 . Model systeem voor proeflezen assay. Een niet-overeenkomende primer was gegloeid zoals aangegeven aan een sjabloon vormen een terminal mismatch (vet). Proeflezen van DNA Taq exonuclease zouden detecteren en verwijderen van de niet-overeenkomende nucleotide vormen een excisie product. In aanwezigheid van een polymerase van DNA en vier ddNTPs, is het product van de besnijdenis uitgebreid door een aanvulling op de vorige niet-overeenkomende site één voet. Wanneer onderworpen aan de MALDI-TOF, kan het verschil in massa tussen de niet-overeenkomende primer, de producten van de besnijdenis en de Review producten worden opgelost. (Dit bedrag wordt aangepast van Su et al. 25 met toestemming.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Piek intensiteit en oligonucleotide mass. Acht oligonucleotides van 17 tot en met 24 nt met sequenties complementair aan de 3'-eind van T28 (tabel 1) werden getest. (A) A mengsel van 50 pmol van elke oligonucleotide in 40-µL oplossingen werd onderworpen aan een MS-analyse. (B) de piekhoogte van 17 nt werd gebruikt als 100% voor de berekening. De relatieve signaalsterkte voor elke oligonucleotide was het gemiddelde van zes vaststellingen en de foutbalken vertegenwoordigen 1 standaarddeviatie. (Dit bedrag wordt aangepast van Su et al. 25 met toestemming.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Effect van verschillende sjabloonontwerp. Proeflezen reacties werden beoordeeld met de vorming van een terminal T-G mismatch met verschillende sjablonen P21-primer. De proeflezen test werd uitgevoerd met 10 U (43 pmol) Klenow polymerase, 50 pmol substraat, en 4 ddNTPs bij 37 ° C gedurende 5 min. (A) dit paneel toont een P21/T32 T-G-substraat zonder enzym. (B) dit paneel toont een primer uitbreiding van een substraat P21/T32 T-A door exonuclease 3' tekort Klenow. PE = primer extensie product. (C) dit paneel toont een herlezing van het substraat P21/T32 T-G. PP = proeflezen product; D26, d27, d28 = 3' eind-beschadigde sjabloon. (D) dit paneel toont een P21/T28 T-G-substraat zonder enzym. (E) dit paneel toont een herlezing van het substraat P21/T28 T-G. PP = proeflezen product; D26, d27 = 3' eind-beschadigde sjabloon. (F) dit paneel toont een P21/T28S4 T-G-substraat zonder enzym. (G) dit paneel toont een herlezing van het substraat P21/T28S4 T-G. PP = proeflezen product; EP = excisie producten; D27 = sjabloon afbraak bijproduct. (Dit bedrag wordt aangepast van Su et al. 25 met toestemming). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Cursus analyse tijd voor excisie en proeflezen produkten. Proeflezen tests werden uitgevoerd met 2 U (8.6 pmol) KF en 50 pmol substraten als beschreven in het protocol. De reacties waren uitgeblust op de aangegeven tijden. (A) dit paneel toont een herlezing van een 3' terminal T-G mismatch; EP = proeflezen excisie product; D18 & d19 = overtollige excisie bijproducten; PP = proeflezen producten; P21 = niet-overeenkomende primer. (B) dit paneel toont een herlezing van een 3'-voorlaatste T-G mismatch; EI-1 = excisie tussenliggende; EP-2 = proeflezen excisie producten; D18 = overtollige excisie bijproduct; PP = proeflezen producten; P21 = niet-overeenkomende primer; Na = natrium ion gebonden nucleotiden. (Dit bedrag wordt aangepast van Su et al. 25 met toestemming.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Proeflezen reactie met 4 ddNTPs versus een enkele dNTP. Proeflezen tests werden uitgevoerd met 0,1 U (0,43 pmol) KF en 50 pmol substraten als beschreven in het protocol. De reacties waren uitgeblust op de aangegeven tijden. (A) dit paneel toont een herlezing van een 3' terminal G-G mismatch met 4 ddNTPs; EP = proeflezen excisie product; PP = proeflezen resynthesis producten; P21G = niet-overeenkomende primer. (B) dit paneel toont een herlezing van een 3' terminal G-G mismatch met dCTP; PP = proeflezen resynthesis producten; P21G = niet-overeenkomende primer. (C) de correctie niveaus zijn het gemiddelde van drie vaststellingen en de foutbalken vertegenwoordigen 1 standaarddeviatie. NB+ = natrium ion gebonden nucleotiden. (Dit bedrag wordt aangepast van Su et al. 25 met toestemming.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Proeflezen van interne incongruenties. Proeflezen tests werden uitgevoerd met 2 U (8.6 pmol) Klenow polymerase en 50 pmol substraten in 37 ° C gedurende 20 minuten, zoals beschreven in het protocol. Leeg = enzym leeg van een MM1 substraat. MM1 = een P21/T28 T-G-substraat; MM2 naar MM9 = substraten met interne afstemming van de vaardigheden, de aantallen wijzen op de mismatch positie ten opzichte van 3' eind. P21 = niet-overeenkomende inleidingen; PR = Review producten; PE = uitgebreide inleidingen; D19 en d20 = overtollige excisie bijproducten, de nummers staan voor het aantal nucleotiden. (Dit bedrag wordt aangepast van Su et al. 25 met toestemming.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 . Reparatie van 3' voorlaatste deoxyinosine laesies. Reparatie-tests werden uitgevoerd met 2 U Klenow polymerase en 50 pmol substraten in 37 ° C, zoals beschreven in protocol stap 2.3. De reacties waren uitgeblust op de aangegeven tijden. Deze panelen Toon reacties met (A) T-ik substraat; (B) G-ik substraat; (C) A-ik substraat; en (D) C-ik substraat. RP = reparatie producten; EP = excisie producten; PE = primer extensie producten, nb+ = natrium ion adducten. (E) de correctie niveaus voor T-ik, G-I, en A-ik het gemiddelde van drie vaststellingen en de foutbalken vertegenwoordigen 1 standaarddeviatie. De niveaus van de correctie voor C-ik was het gemiddelde van twee vaststellingen. (Dit bedrag wordt aangepast van Su et al. 25 met toestemming.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Substraten | Sequenties | Correctie-efficiëntie (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17.3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18.4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22,9 | |
| MM1 | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16,9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0.5* | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-IK | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-IK | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-IK | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15,4-inch | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-IK | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16,6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
Tabel 1. Proeflezen van substraten en correctie efficiëntie door Klenow fragment. Deze tabel toont de vet 4-nucleotiden aan de 3'-eind van de sjabloon met phosphorothioate wijzigingen. De niet-overeenkomende basenparen zijn vetgedrukt. Het proeflezen tests werden uitgevoerd met 2 U (8.6 pmol) Klenow polymerase, 50 pmol substraat en 4 ddNTPs bij 37 ° C gedurende 10 minuten * deze waarden zijn de lagere limieten voor het proeflezen niveau omdat de achtergrondgeluiden nauwkeurige schattingen van < 1% van voorkomt de totale massa signalen waargenomen. (Dit bedrag wordt aangepast van Su et al. 25 met toestemming.)
| GOED | TERMIJN | SNP_ID | 2E-PCRP | 1E-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | TM | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NB | NB | NB | NB | NB | NB | NB | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NB | NB | NB | NB | NB | NB | NB | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
Tabel 2. T28_P21.xlsx bestand. De instelling werd gebruikt voor figuur 3D, 3E, 4Aen 5A.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
Tabel 3. 1201.xlsx bestand. De instelling werd gebruikt voor 7 reacties in figuur 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze studie beschreven een stapsgewijze proeflezen activiteit assay geanalyseerd door de gekozen commerciële instrument (Zie de Tabel van materialen) met behulp van MALDI-TOF MS. De grote voordelen zijn dat de primer en de sjabloon label gratis en eenvoudig uit te voeren zijn, meer flexibiliteit bij het ontwerpen van experimenten. Een stream-kalk volledige verwerking van 30 proeflezen proeven zou duren 4 h, met inbegrip van 3 h voor het handmatig uitvoeren van de proeflezen reacties en hun opruimen, terwijl de MALDI-TOF MS analyses met behulp van het genoemde protocol neemt 1 h om te voltooien. Het primaire nadeel van deze methode is de hoeveelheid substraat nodig zijn voor de bepaling. Voor het verkrijgen van sterke signalen en consistente resultaten, gebruikten we 50 pmol van DNA substraat in een 20-µL reactie; Dus, de hoeveelheid DNA is veel hoger dan bij radiolabeled DNA experimenten8,9,10. Vermindering van de hoeveelheden en de grootte van de steekproef en de MS-operatie "fine-tuning" kunnen verlagen de hoeveelheid substraat nodig.
Synthetische oligonucleotides verkregen uit commerciële bronnen kunnen worden gebruikt voor het proeflezen studie direct zonder verdere reiniging of behandeling. Het is echter aan te raden om te controleren de zuiverheid en de kwaliteit van het DNA door MALDI-TOF MS. De phosphorothioate-obligaties werden geïntroduceerd ter vervanging van de laatste 4 phosphodiester banden aan de 3'-eind van de sjabloon (tabel 1) om de niet-specifieke afbraak van het onderdeel van de sjabloon (Figuur 3 g), zij het op een hogere kosten per monster. Interessant is dat kunnen de signalen van de sjabloon en de primer DNA worden goed gescheiden door MS op grond van hun verschillen in grootte; deze wijziging van de phosphorothioate is dus niet vereist. In figuur 3E, bijvoorbeeld, waren alle mogelijke producten van de primer P21-uitbreiding en het proeflezen excisie en resynthesis minder dan 22 nt (m/z < 7.000), terwijl alle fragmenten van de afbraak van sjabloon T28 waren groter dan 24 nt (m/z > 7.000 ). De resultaten in figuur 4A waren afkomstig uit de dezelfde P21/T28 dubbelzijdig instellen als die in figuur 3E. Een uitgebreide venster van m/z 6.000-7.000 toont alleen signalen van de primer DNA zonder geen storende signalen uit de sjabloon.
De strategie voor het gebruik van inleidingen met de extensie ddNMP bleek te zijn zeer stabiel, en, dus, met producten van ddNMP zijn goede indicatoren voor de proeflezen assay. De toevoeging van ddNMP aan besnijdenis producten kon 'bevriezen' de proeflezen producten in de Braziliaanse p.a. onmiddellijk na excisie. Anderzijds is het ook mogelijk met behulp van een enkele juiste dNTP (figuur 5B) in plaats van 4 ddNTPs te onderdrukken de aspecifieke Hydrolytische activiteit van het proeflezen exonuclease.
Stoppen van de reacties met een standaard fenol/chloroform extractiemethode bleek te zijn de beste manier voor de beëindiging van de reactie omdat, in één stap, hierdoor de reacties worden gestopt terwijl ook het verwijderen van elke inmenging van eiwit. U kunt ook zuur blussen, vatbaar voor automatisering, is dan geneutraliseerd door niet-metalen alkalisch zonder een fase-separatie zichtbaar, ook blijk gegeven van betrouwbare resultaten. Natrium-ion adducten (nb+ in Figuur 4, 5en 7) zijn van belang omdat ze kunnen achtergrond verhogen en de signaal-discriminatie bemoeilijken. Een correct gebruik van de schone hars kan verminderen dergelijke storingen; nog, zelfs wanneer dergelijke adducten aanwezig zijn, ze hebben normaal gesproken veel kleinere pieken ten opzichte van hun bovenliggende-signaal en deze eigenschap kan worden gebruikt om te onderscheiden tussen hen (Figuur 4, 5en 7). In het algemeen de piekhoogte van natrium adducten evenredig was aan de grote toppen; de insluiting of uitsluiting van natrium adducten de berekening beïnvloedde niet aanzienlijk de kwantificering resultaten. Daarom, voor de kwantificering, we de grote piekhoogte alleen gebruikt voor de berekening.
Het proeflezen experimenten beschreven hier profiteerde van interne incongruenties om aan te tonen het belang van de exonuclease domeinpartitie assay van KF26 en de gedetailleerde polymerase van DNA ik vermogen om efficiënt proeflezen de mismatch op omhoog tot en met 4 nt stroomopwaarts van de primer 3'-eind (Figuur 5, MM1 - 4) mogelijk te wijten aan de stabiliteit van base-paring bij de primer-template kruispunten27. Bovendien, deze studie ook gebruikt met voorlaatste deoxyinosine laesies voorstrijkmiddelen te bestuderen van een pol die ik van endo V-gejat reparatie tussenproducten herstellen. De resultaten toonden aan dat T-Ik was gerepareerd efficiënter dan A-ik en G-I; echter, C-ik was vuurvaste de Pol ik herstellen (tabel 1 en Figuur 7). Deze resultaten bevestigen dat een MALDI-TOF MS-analyse kan zeer nuttig zijn voor proeflezen en verschillende korte-patch DNA-herstel testen28 toe te schrijven aan zijn hoge resolutie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de NCFPB geïntegreerde Core faciliteit voor functionele genomica (Taipei, Taiwan) en de NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door onderzoekssubsidies van de Taiwan Health Foundation (L-I.L.) en het ministerie van wetenschap en technologie, Taipei, Taiwan, ROC [meest 105-2320-B-002-047] voor Wei-Yao Hu, [meest 105-2628-B-002-051-MY3] voor Kang-Yi Su en [ Most-105-2320-B-002-051-MY3] voor Liang-In Lin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A.
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M.
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
