Summary
Une méthode non marqué, non-radio-isotopiques pour la relecture de l’ADN polymérase et un test de réparation de l’ADN a été développée à l’aide de haute résolution spectrométrie de masse MALDI-TOF et une stratégie d’extension de nucléotide. Le test s’est avéré être très précis, simple, rapide et facile à réaliser pour la relecture et réparer les correctifs inférieure à 9-nucléotides.
Abstract
Le maintien du génome et sa reproduction fidèle est primordial pour la conservation des données génétiques. Pour évaluer la réplication haute fidélité, nous avons mis au point un simple non marqué et méthode non-radio-isotopique avec une désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) temps de vol de masse analyse de spectrométrie (SM) pour une étude de relecture. Ici, une ADN polymérase [par exemple, le fragment de Klenow d’ADN polymérase d’Escherichia coli (KF) j’ai (pol je) dans cette étude] en présence de tous les quatre dideoxyribonucleotide triphosphates est utilisé pour traiter un duplex modèle primer ne correspondent pas. L’apprêt ne correspondent pas est puis relire/étendu et soumis à MALDI-TOF MS. Les produits sont distinguent par la variation de la masse du primaire vers le bas pour des variations nucléotidiques. Ce qui est important, une relecture peut aussi être déterminé pour inadéquation unique interne, quoiqu’à des rendements différents. Incompatibilités situées à 2-4-nucléotides (nt) de l’extrémité 3' ont été efficacement corrigé par pol I et une incompatibilité à 5 nt depuis le terminus de l’apprêt a montré seulement une correction partielle. Aucune relecture s’est produite pour les non-correspondances internes situés au 6-9 nt de l’extrémité 3' apprêt. Cette méthode peut également être appliquée aux dosages de réparation d’ADN (par exemple, évaluer une réparation de base-lésion de substrats pour la voie de réparation endo V). Amorces contenant 3' avant-dernier désoxyinosine (dI) lésions pourraient être corrigées par pol j’ai. En effet, avant-dernier T-I, G-I et A-j’ai les substrats présentaient leurs derniers 2 nucléotides contenant dI excisés par pol I avant d’ajouter un ddN correct 5'-monophosphate (ddNMP) tout en avant-dernière C-j’ai incompatibilités ont été tolérées par pol I, ce qui permet l’amorce d’étendre sans réparation, démontrant que la sensibilité et la résolution de la MS d’analyse permettant de mesurer la réparation de l’ADN.
Introduction
Les fonctions de relecture des polymérases d’ADN au cours de la réplication de l’ADN sont essentielles pour garantir la haute fidélité de l’information génétique qui doit être transférée aux descendants1,2,3,4, 5,6,7. Être en mesure d’évaluer les contributions de la polymérase relecture exonucleases préciserait les mécanismes de sauvegarde de la stabilité génétique.
Radio-isotope étiquetage et gel à base de tests en combinaison avec des analyses densitométriques des autoradiogrammes ou phosphore d’imagerie8,9,10 ont traditionnellement été utilisées pour détecter les activités de relecture de l’ADN polymérases. Bien que fonctionnel, ces tests sont laborieux et coûteux ne se prêtent pas à des formats de haut débit. En outre, radio-isotopes souffrent de problèmes de sécurité, y compris l’élimination des déchets. Alternativement, relecture des activités ont été analysées par des techniques de dosage fluorimétrique. Par exemple, 2-aminopurine (2-AP) peut être incorporé dans les produits d’extension au cours de la polymérisation in vitro en relecture d’épreuves pour produire un signal fluorescent11,12. Malheureusement, ces approches souffrent d’une faible spécificité, puisque 2-AP peut appairer avec thymine et cytosine. Des approches plus récentes incluent une base G-quadruplexe luminescente marche sonde sensible pour une polymérase 3' - 5' exonucléase dosage13 ainsi qu’une sonde fluorescente marquée individuellement pour une polymérase relecture analyse qui surmonte certaines de la les inconvénients susmentionnés14. L’enthousiasme pour ces méthodes fluorimétrique est diminuée en raison de la nécessité pour l’étiquetage précis de substrats de l’ADN.
En revanche, une MALDI-TOF-MS pour l’analyse de l’ADN a été utilisée dans l’essai de PinPoint, où les réactions d’extension amorce avec 4 ddNTPs sans étiquette peuvent être utilisées pour identifier des polymorphismes à un locus donné15,16,17 et a été largement adopté dans des applications cliniques pour la détection de la mutation et cancers diagnostiqués18. À l’aide de ces principes de base, nous avons créé un test exempte d’étiquette pour la détermination in vitro de l’ADN polymérase relecture activité exploitant la haute résolution, haute spécificité et haut débit potentiel de MALDI-TOF Mme utilisant la E. coli DNA polymérase I Klenow fragment comme enzyme modèle, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) comme substrats peuvent prendre un « instantané » de relecture des produits après un nucléotide simple extension par MALDI-TOF MS (Figure 1).
De même, cette méthode a été également développée pour un test de réparation de l’ADN où amorces contenant 3' avant-dernier dI lésions font l’objet d’un PPS que j’ai réparer dosage qui imite endo V entaillé réparation intermédiaires. Bien que pas entièrement compris, la voie de réparation endo V est le seul système de réparation connu pour employer la pol I correction activité exonucléasique pour lésion excision19,20. À l’aide de MALDI-TOF MS, nous montrons un patch de réparation clairement défini où dI peut être excisé par pol I quand survenant dans les 2 dernières nt de l’apprêt avant d’ajouter le nucléotide correctement complété.
Pour l’étude de la relecture et la réparation de l’ADN, cette méthode est plus rapide et moins laborieux que les méthodes précédentes et fournit des informations supplémentaires vers le mécanisme et la fonction.
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Protocol
1. préparation d’amorce/modèle
- Créer des amorces/modèles avec une teneur en G + C équilibrée entre 40 % et 60 % comme un séquençage ou la conception d’amorces PCR. Utiliser les amorces de 18 à 21 nt pour un recuit approprié et de meilleurs signaux MS.
- Concevoir le modèle en définissant les 50 ° C étant le minimum de température pour la région de duplex au moins 7 de fusion nt du 5'-porte-à-faux pour séparer les signaux entre le primaire et le modèle.
NOTE : par exemple, pour le substrat P21/T28 dans le tableau 1, l’amorce de 21-nt est couplé avec un modèle 28-nt. Option : l’utilisation d’autres acides nucléiques comme les obligations phosphorothioate nucléase-résistante pour remplacer les 4 dernières liaisons phosphodiester à l’extrémité 3' du modèle peut empêcher les interférences possibles par une dégradation non spécifique 3' extrémité des modèles ( par exemple, T28S4 dans le tableau 1), bien que cela va ajouter quelques frais pour la préparation du modèle. - En utilisant des oligonucléotides de morue dessalées standards sans toute autre purification est satisfaisante pour cette étude. Utiliser des oligonucléotide amorces/modèles à une concentration de 100 pmol/µL en H2O comme un stock et conserver à-20 ° C. Vérifier la qualité et la pureté des amorces et les modèles en exécutant les oligonucléotides sur MALDI-TOF MS (étapes 4 à 7) pour assurer des signaux de pointe unique et un bon rapport signal sur bruit.
- Déterminer les intensités relatives du signal MALDI-TOF MS (étape 7) des amorces molaires égales des séquences pertinentes dans la réaction à la normalisation de l’étalonnage et la concentration (Figure 2).
2. réactions de relecture
Remarque : La même condition de réaction relecture et le protocole s’applique à une réparation de l’ADN de l’A-I, G-I, C-I et T-je.
- À l’aide d’un décalage de T-G du substrat P21/T28 pour la relecture dans le tableau 1 , à titre d’exemple, diluer l’apprêt P21 et modèle T28 à 12,5 pmol/µL avec H2O ; puis transfert 12 µL du primer dilué et 12 µL du modèle dilué dans un tube de 1,5 mL microcentrifugeuse stérilisé.
Remarque : La quantité de modèle/apprêt mix est suffisante pour 2 réactions ; augmenter proportionnellement le volume des réactifs en conséquence pour plusieurs réactions. - Bien refermer le tube. Il incuber 30 min à couvert 65-° C bain-marie, suivi de 30 min dans un bain d’eau de-37 ° C et enfin sur la glace pour assurer un bon recuit.
- Dans un tube de microcentrifuge stérilisé de 1,5 mL, ajouter 8 µL d’apprêt et mélange de modèle (50 pmol), 2 µL de 10 x relecture tampon de réaction, 4 µL du mélange 4 ddNTPs (2 mM de chaque 4 dNTPs) et H2O jusqu'à 18 µL. Flick le tube pour mélanger.
Remarque : 1 tampon de réaction relecture x contient 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, dithiothréitol 1 mM et 10 mM Tris-HCl (pH de 7,9 à 25 ° C). Voir la Table des matières pour la source commerciale de 10 x relecture tampon de réaction. La concentration finale de chaque ddNTP dans la réaction est de 0,1 mM. - Diluer l’ADN polymérase dans glacée 1 x tampon de réaction à la concentration voulue de relecture [par exemple, à un tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 4 µL de 1 x relecture tampon de réaction et de 1 µL de polymérase Klenow 5-U provenant d’une source commerciale (Table de Materials)]. Stocker l’enzyme dilué sur la glace en permanence.
Remarque : La quantité de dilué ADN polymérase est suffisante pour 2 réactions ; augmenter proportionnellement le volume des enzymes en conséquence pour plusieurs réactions. Un volume de 2,0 µL, contenant des 2,0 unités de Klenow polymérase, peut relire plus de la moitié des 50 pmol de T-G terminal dépareillées P21/T28 en 5 min. - Préchauffer le tube de microcentrifuge avec le mélange de substrat de l’étape 2.3 à la température de la réaction souhaitée (par exemple, généralement 37 ° C pour Klenow polymérase et 25 ° C pour T4 ADN polymérase). Puis transférer 2,0 µL de l’ADN polymérase dilué de l’étape 2.4 dans le mélange de substrat préchauffée et feuilleter le tube pour mélanger son contenu.
- Centrifuger les tubes avec l’enzyme et le substrat pendant quelques secondes à 3 200 g à la température ambiante pour filer vers le bas les composants des réactions. Transférer immédiatement la réaction à un bloc chauffant ou un bain d’eau à la température d’incubation désiré comme au point 2.5.
-
Mettre fin à la réaction
- Ajouter un volume égal de phénol tamponné, mélanger au Vortex pendant quelques secondes et il centrifuger dans une microcentrifugeuse à 3 200 g à la température ambiante pendant 5 min.
- Transférer la phase aqueuse dans un tube de microcentrifuge propre et ajouter un volume égal de chloroforme, mélanger au Vortex pendant quelques secondes et centrifugeuse dans un microtube à 3 200 g à la température ambiante pendant 3 min. transférer la phase aqueuse dans un tube à centrifuger propre et en cubate il à 95 ° C pendant 5 min ; puis placez-le sur la glace.
ATTENTION : Phénol et le chloroforme sont des produits chimiques dangereux. Manutention et d’évacuation doit suivre les règlements institutionnels.
- Transférer la phase aqueuse dans un tube de microcentrifuge propre et ajouter un volume égal de chloroforme, mélanger au Vortex pendant quelques secondes et centrifugeuse dans un microtube à 3 200 g à la température ambiante pendant 3 min. transférer la phase aqueuse dans un tube à centrifuger propre et en cubate il à 95 ° C pendant 5 min ; puis placez-le sur la glace.
- Sinon, utiliser un acide trempe de protocole. Pour ce faire, ajoutez 2 µL de 1 M HCl pour arrêter la réaction sur la glace pendant 6 min, puis ajouter 0,64 µL de 1 M, diéthanolamine (DEA) pour neutraliser le pH du mélange réactionnel et il incuber à 95 ° C pendant 5 min ; puis placez-le sur la glace.
- Ajouter un volume égal de phénol tamponné, mélanger au Vortex pendant quelques secondes et il centrifuger dans une microcentrifugeuse à 3 200 g à la température ambiante pendant 5 min.
3. résine Addition pour éliminer la Contamination saline
- Utilisant le scoop de la résine du dessalement commerciale nécessaire (voir la Table des matières), prendre la résine suffisante pour couvrir les fossettes de la plaque réactionnelle de la résine 384-Fossette, 6 mg.
- Répartir la résine à travers tous les fossettes (6 mg/fossette) en grattant dans la partie supérieure de la plaque. Récupérer n’importe quel excès de résine et remplacez-le dans la bouteille.
- Transférer les produits de la réaction finale d’étape 2.7 des microtubes à une plaque 384 puits. Distribuer 16 µL d’H2O à diluer les produits de la réaction finale dans chaque puits sceller la plaque, puis centrifuger pour éliminer toutes les bulles.
- Enlever le joint, tourner la plaque 384 puits avec les produits de la réaction à l’envers pour couvrir la plaque de résine remplis réactionnelle.
- Retournez le sandwich de plaques bien-à-Fossette et soigneusement laisser la résine chuter dans la plaque 384 puits (n’oubliez pas la plaque 384 puits affleure la cheville métallique sur la plaque de résine remplis réactionnelle).
- Retirez la plaque de la fossette sur le dessus, sceller la plaque 384 puits contenant des mélanges de produits de la réaction et de résine, il centrifuger brièvement à 3 200 g pour enlever les bulles et le placer sur un agitateur pendant au moins 15 minutes à température ambiante pour dessalement son contenu.
- Après le nettoyage de résine, centrifuger la plaque 384 puits à 3 200 g pendant 5 min compacter la résine jusqu’au fond des puits.
4. transfert des produits de réaction à une puce Matrix
- Mettre les plaques de l’échantillon dans le distributeur nanolitres (nanodispenser, voir la Table des matières).
- Mettre la matrice chip (voir la Table des matières) et la plaque 384 puits de section 3.7 dans le bac correspondant.
- Utiliser le nanodispenser pour repérer les produits de la réaction à la puce ; Appuyez sur le bouton exécuter sur l’écran tactile de la nanodispenser pour commencer.
- Vérifiez l’image saisie automatisée des taches échantillon contenant des informations à l’écran pour s’assurer que le volume global tacheté sur la puce saturation est d’environ 5-10 nL. Répétez l’échantillon repérer si le volume est insuffisant.
5. configurer les informations d’analyse sur la spectrométrie de masse
- Préparer un fichier au format .xls contenant les informations de signal prévu pour l’importation. Par exemple, utilisez le paramètre de « P21_T28.xls » (tableau 2) pour la réaction de relecture de P21/T28 en étapes 2, 3 et 4.
- Créer et définir une nouvelle méthode de dosage dans le programme d’application (voir la Table des matières) par un clic droit sur le Groupe test Import au Format Designer et sélectionnez le fichier .xls (p. ex., « P21_T28.xls » de l’étape 5.1).
- Mettre en place la cible test plaque via l’arborescence d’option Client : projet : plaque sur le côté gauche de l’écran par un clic droit sur le haut de l’arborescence et en lui donnant un nom de fichier (par exemple, « CTT20171201 » représente le code de test et la date).
- Sélectionnez le type de plaque 384 puits, puis appuyez sur OK; une plaque vierge s’affiche.
- Sélectionnez le test approprié (par exemple, P21_T28) sur le côté gauche de l’écran.
- Affecter le dosage sélectionné (par exemple, P21_T28) pour chaque échantillon repéré la position de l’échantillon sur la puce en sélectionnant le puits, puis un clic droit pour sélectionner Ajouter Plex.
- Préparer une liste de travail de tous les essais sur le circuit au format .xlsx avec aucun en-tête (par exemple, 1201.xlsx du tableau 3). Importer le travail liste via l’option Ajouter un nouveau projet échantillon .
- Le test dans la liste de travail (par exemple, de 1201.xlsx) d’affecter à chaque poste du dosage P21_T28 et choisissez par un clic droit.
6. MALDI-TOF MS opération
- Lien vers le spectromètre de masse à la puce en utilisant le programme d’application (voir la Table des matières).
- Sélectionnez le paramètre par défaut sur le côté droit de l’écran.
- Indiquez le nom de test de l’étape 5.3 (p. ex., CTT20171201), ID de la puce à l’angle de la puce et enregistrer les paramètres.
- Démarrez le programme de contrôle de MS (voir la Table des matières).
- Appuyez sur le bouton Entrée/sortie et sortez la plaque de scout. Placez le jeton tacheté à l’étape 4.4 sur la plaque de scout et appuyez sur le bouton Entrée/sortie pour la puce tacheté d’entrer dans le spectromètre de masse.
- Cliquez sur le bouton acquérir du programme d’application (voir la Table des matières) pour démarrer la spectrométrie de masse et d’acquisition de données.
7. analyse de données
- Ouvrez le programme pour l’analyse des données (voir la Table des matières).
- Naviguez dans l’arborescence de la base de données dans le coin supérieur gauche, puis sélectionnez l’ID de la puce de l’étape 6.3. Ouvrez le fichier de données sur le côté droit de l’écran.
- Cliquez sur l’icône pour afficher le spectre de masse du spectre. Pour rogner une gamme spécifique de m/z, faites un clic droit pour sélectionner la Boîte de dialogue Personnalisation et dans la nouvelle fenêtre cliquez sur axe des abscisses et fixer la limite supérieure et inférieure désirée et appuyez sur OK pour afficher la plage spécifiée du spectre.
- Exportation du spectre pour la tenue des registres en cliquant-droit à l’exportation.
Remarque : En utilisant une échelle de 1 600 largeur/1 200 unité est une taille raisonnable pour l’inspection des données sur un écran d’ordinateur.- Sélectionnez le type de fichier JPEG, cliquez sur la Destination, sélectionnez Parcourir disque (par exemple, flash disque E:), tapez le nom du fichier (par exemple, 1201-1.jpg) et puis cliquez sur Exporter.
- Pour le dosage de données, utilisez le curseur et cliquez sur le sommet pour montrer la hauteur du pic à l’angle supérieur gauche.
- Vous pouvez également imprimer un fichier JPEG exporté et mesurer la hauteur du pic avec une règle manuellement.
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Representative Results
Modèles et amorces :
À l’aide de la procédure présentée ici, égale modèles molaire oligonucléotide synthétique et amorces de séquences pertinentes obtenues de sources commerciales ont été vérifiés pour leur pureté et leur qualité (Figure 3 a; note que les signaux correspondant à la masse désignée et le faible bruit de fond) ainsi que pour la relation entre l’intensité maximale et la masse de la substance à analyser (Figure 2 a). Les hauteurs des pics ont été mesurées et calculées (Figure 2 b) pour la normalisation de données de MS.
Spectres de condition et de la masse de réaction :
L’utilisation de réactions d’extension seule amorce de base couplé avec MALDI-TOF MS pour le génotypage a précédemment démontrée réalisable à l’aide de terminateurs standard ddNTPs17. L’essai de relecture à l’aide de ddNTPs standard est semblable à une réaction singleplex de génotypage, mais est beaucoup plus simple et très facile à exécuter pour obtenir un résultat propre et fiable.
Les spectres MS a couvert tous les signaux générés à partir des amorces et des modèles (Figure 3). La conception appropriée des amorces et les modèles produit un profil de signal bien séparés pour les modèles et les amorces (Figure 3). Selon la valeur de m/z, signaux de modèles et de leurs produits de dégradation partielle non spécifique (m/z > 7 000) étaient bien distincts les apprêts dépareillées et corrigent produits (m/z < 7 000 dans la Figure 3). Si nécessaire, introduire phosphorothioate nucléase résistante adhère à remplacer les 4 dernières liaisons phosphodiester à l’extrémité 3' du modèle (tableau 1; T28S4/P21) peut réduire hydrolyse de modèle non spécifique (Figure 3; d27).
En l’absence des dNTPs, KF a un robuste 3'-exonucléase et est capable de dégrader l’apprêt tant le modèle in vitro21. Comme les 4 dNTPs natives, l’ajout des 4 ddNTPs empêche une dégradation d’extrémité 3' par KF (Figure 3 et 3E). De même, une une extension de nucléotide de l’extrémité 3' ajoute une stabilité accrue à l’amorce. À l’aide de pol j’ai relecture des conditions précédemment décrit20 avec 10 U (46 pmol) KF, plus de 80 % des substrats 50-pmol incompatibilité ont été corrigées en 5 min (Figure 3, 3Eet 3 G).
Intermédiaires et l’analyse du mécanisme :
MALDI-TOF MS résolution peut être aussi fine que 1 dalton ; en effet, tous les substrats, produits et intermédiaires avec des changements de masse dans la réaction peuvent être résolus dans le même spectre MS de la plage sélectionnée. Par exemple, un écart de T-G terminal, le G ne correspondent pas à l’extrémité de l’amorce a été corrigé avec l’incorporation de la ddA, avec une différence de m/z de seulement 32. Une telle différence de m/z peut être facilement identifiée sur le spectre MS dans une gamme de m/z de 5 000 à 7 000 (Figure 4 a). Le changement de chaque signal individuel peut être calculé en additionnant tous les signaux de l’amorce ne correspondent pas, l’excision intermédiaires et corrigé des produits 100 %. Par exemple, dans la réaction de relecture de T-G, le produit a été corrigé par rapport au produit l’excision était 23 % contre 17 % à 5 min, 31 % contre 18 % à 10 min et 69 % contre 14 % à 20 min (Figure 4 a).
Lorsqu’un décalage de T-G avant-dernier est présent dans le primaire, les 2 dernières nt devrait être excisées, suivie d’une addition de ddA pour terminer la correction. En effet, les bons produits augmentent avec le temps de 12 % à 5 min, 28 %, à 10 min, à 45 %, à 20 min de la réaction. En outre, deux formes de produits de l’excision pour une relecture, les produits de l’excision intermédiaire et 2-nt 1-nt l’excision, avant-dernier T-G ont été facilement résolu (Figure 4 b).
Cinétique de relecture avec dNTP unique :
PPS de l’ADN d’e. coli je, ddNTPs ne sont pas des supports appropriés et devraient être considérées comme inhibiteurs22. Sinon, en utilisant un seul dNTP « correct » dans la réaction de relecture au lieu de cela aussi supprimera non-spécifiques 3' - 5' activité exonucléasique et la génération de produits d’extension de nucléotide d’analyse MS (Figure 5 b). Le taux de relecture provenant de réactions contenant un seul dCTP est environ deux fois plus élevé que les réactions contenant les 4 ddNTPs (Figure 5 a, 5 bet 5C). Ainsi, l’utilisation d’un seul dNTP « correct » dans l’essai de relecture donne de meilleurs résultats sans les effets inhibiteurs des ddNTPs. Cette approche devrait fournir une plus grande sensibilité pour la relecture des analyses cinétiques.
Relecture des non-correspondances internes :
MS relecture dosages utilisant KF pour inadéquations internes et l’identification des produits corrigés sont simples (c.-à-d.l’exonucléase relecture accises nucléotides de l’extrémité 3' de l’incohérence interne des amorces), suivie par la ajout de ddNMP correspondant à l’excision produits via la fonction de polymérase générant relire produits plus courtes que les substrats d’apprêt (Figure 6). A observé une tendance claire de relecture efficacité, où KF relire efficacement les non-correspondances dans le dernier, avant-dernier, 3rd et 4ème nucléotides de l’extrémité 3' des amorces (Figure 6; 1, 2, 3 et 4). Des incompatibilités à 5 nt de l’extrémité 3' de l’amorce ont été partiellement corrigées avec 15 < % de correction de désadaptation et > 15 % de l’amorce a montré une extension sans relecture (Figure6 ; MM5). KF n’a pas pu corriger les non-correspondances positionnés à 6, 7, 8 et 9 nt de l’extrémité 3' de l’amorce (Figure 6; MM6, 7, 8 et 9) étendu mais encore une proportion importante des substrats (Figure 6; PE de MM6, 7, 8 et 9).
Réparation des lésions de désoxyinosine :
Chez e. coli, désoxyinosine dans l’ADN est principalement traitée par l’endo V réparation voie20,23. Endo V initie la réaction par une incision à la deuxième liaison phosphodiester 3' de la lésion de dI. La rupture de brins générée est censée être utilisé par pol I pour une excision de la lésion ultérieure et l’ADN resynthèse24. Cette procédure a été appliquée pour tester pol j’ai réparer des substrats contenant dI au site 3' avant-dernier (tableau 1; Un-I, C-I, G-I et T-I) pour valider cette hypothèse. La réparation de la 3' avant-dernier dI est analogue à la relecture de l’avant-dernier décalage de T-G (Figure 4 b et 6; Entrée de mm2), dans lequel les 2 dernières nt doit être enlevés suivie d’une addition d’un ddNMP correct pour terminer la réparation. Les patrons de MS montrent clairement pol j’ai corrigé hétéroduplex de A-I, G-I et T-j’ai, mais avec des efficacités différentes (Figure 7; Signaux RP). Toutefois, le C-j’ai substrat est réfractaire à la pol j’ai réparer (tableau 1 et Figure 7 et 7E; RP très faible) et démontré l’extension d’amorce dans une large mesure (Figure 7; Signal de PE).
Figure 1 . Modèle : système pour la relecture dosage. Une couche d’apprêt dépareillé était ensuite recuit conformément à un modèle formant une incompatibilité de terminale (en gras). Relecture exonucléase de l’ADN polymérase serait de détecter et de supprimer les nucléotides dépareillés formant un produit de l’excision. En présence d’une ADN polymérase et quatre ddNTPs, le produit de l’excision est prolongé par une seule base complémentaire à l’ancien site ne correspondent pas. Lorsqu’elles sont soumises à la MALDI-TOF, la différence de masse entre l’amorce ne correspondent pas, les produits de l’excision et les produits corrigés peut être résolue. (Ce chiffre est une adaptation de Su et al. 25 avec autorisation.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . L’intensité maximale et oligonucléotides Massachusetts Des huit oligonucléotides du 17 au 24 nt avec les séquences complémentaires à l’extrémité 3' de T28 (tableau 1) ont été testés. (A) A mélange de 50 pmol de chaque oligonucléotide dans les solutions de 40 µL était soumis à une analyse de MS. (B), la hauteur du pic de 17 nt servait de 100 % pour le calcul. L’intensité du signal relatif pour chaque oligonucléotide était la moyenne de six dosages et les barres d’erreur représentent 1 écart-type. (Ce chiffre est une adaptation de Su et al. 25 avec autorisation.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Effet des différents modèle de conception. Relecture des réactions ont été évaluées avec l’amorce de P21 formant une incompatibilité de terminal T-G avec différents modèles. L’analyse de relecture a été réalisée avec 10 U (43 pmol) Klenow-polymérase, 50 pmol substrat et 4 ddNTPs à 37 ° C pendant 5 min (A), ce panneau indique un substrat P21/T32 T-G sans enzyme. (B), ce panneau indique une extension de l’amorce d’un substrat de T-A P21/T32 par exonucléase 3' déficient Klenow. PE = produit d’extension de l’apprêt. (C) ce panneau présente une relecture du substrat P21/T32 T-G. PP = produit relecture ; D26, d27, d28 = modèle dégradés à l’extrémité 3'. (D), ce panneau indique un substrat P21/T28 T-G sans enzyme. (E) ce panneau présente une relecture du substrat P21/T28 T-G. PP = produit relecture ; D26, d27 = modèle dégradés à l’extrémité 3'. (F), ce panneau indique un substrat P21/T28S4 T-G sans enzyme. (G) ce panneau présente une relecture du substrat P21/T28S4 T-G. PP = produit relecture ; EP = excision produits ; D27 = sous-produit de dégradation de modèle. (Ce chiffre est une adaptation de Su et al. 25 avec la permission). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Analyse du cours du temps pour l’excision produits et relecture. Relecture des analyses ont été effectuées avec 2 U (8,6 pmol) KF et 50 pmol substrats comme décrit dans le protocole. Les réactions ont été trempées à la fois. (A) ce panneau montre une relecture d’une 3' incompatibilité de terminal T-G ; EP = relecture excision produit ; D18 et d19 = des sous-produits de l’excès de l’excision ; PP = produits relecture ; P21 = amorce ne correspondent pas. (B) ce panneau montre une relecture d’une incompatibilité de Tabu 3'-avant-dernier ; AE-1 = excision intermédiaire ; EP-2 = relecture excision produits ; D18 = sous-produit de l’excès de l’excision ; PP = produits relecture ; P21 = amorce ne correspondent pas ; NA = sodium ion lié nucléotides. (Ce chiffre est une adaptation de Su et al. 25 avec autorisation.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Relecture de réaction avec 4 ddNTPs contre une seule dNTP. Relecture des analyses ont été effectuées avec 0,1 U (0,43 pmol) KF et 50 pmol substrats comme décrit dans le protocole. Les réactions ont été trempées à la fois. (A) ce panneau montre une relecture d’un 3' terminal et G incompatible avec 4 ddNTPs ; EP = relecture excision produit ; PP = relecture resynthèse produits ; P21G = amorce ne correspondent pas. (B) ce panneau montre une relecture d’un 3' terminal et G incompatible avec dCTP ; PP = relecture resynthèse produits ; P21G = amorce ne correspondent pas. (C), la correction des niveaux sont la moyenne des trois déterminations et les barres d’erreur représentent 1 écart-type. Na+ = sodium ion lié nucléotides. (Ce chiffre est une adaptation de Su et al. 25 avec autorisation.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Relecture des non-correspondances internes. Relecture des épreuves ont été réalisées avec 2 U (8,6 pmol) Klenow polymérase et 50 pmol substrats à 37 ° C pendant 20 min comme décrit dans le protocole. Blanc = enzyme blanc d’un substrat MM1. MM1 = un substrat P21/T28 T-G ; Mm2 à MM9 = substrats avec des disparités internes, les chiffres indiquent la position de décalage par rapport à extrémité 3'. P21 = amorces dépareillées ; PR = produits corrigés ; PE = apprêts étendus ; D19 et d20 = des sous-produits de l’excès de l’excision, les chiffres représentent la taille des nucléotides. (Ce chiffre est une adaptation de Su et al. 25 avec autorisation.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 . Réparation de 3' avant-dernier désoxyinosine lésions. Des essais de réparation ont été réalisés avec 2 U Klenow polymérase et 50 pmol substrats à 37 ° C comme indiqué au point 2.3 de la protocole. Les réactions ont été trempées à la fois. Ces panneaux montrent des réactions avec (A) T-j’ai substrat ; (B), G-j’ai substrat ; (C) A-j’ai substrat ; et (D) C-j’ai substrat. RP = produits de réparation ; EP = excision produits ; PE = produits d’apprêt extension, Na+ = sodium ions adduits. (E), la correction des niveaux pour T-I, G-I et A-j’étais la moyenne des trois déterminations et les barres d’erreur représentent 1 écart-type. Les niveaux de correction pour C-j’étais la moyenne des deux déterminations. (Ce chiffre est une adaptation de Su et al. 25 avec autorisation.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Substrats | Séquences | Efficacité de correction (pmol) | |
| P21/T32 | 3'-TAATATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 17.3 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 18,4 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | |||
| P21/T28S4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 22,9 | |
| RMN | 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGAG | ||
| MM2 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 13.5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGGGA | |||
| MM3 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 16,9 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGGAAA | |||
| MM4 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 15.1 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTGAGAA | |||
| MM5 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | 4.2 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTTAGGAA | |||
| MM6 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 * | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGTCGGGAA | |||
| MM7 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACGCTGGGAA | |||
| MM8 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGACATTGGGAA | |||
| MM9 | 3'-ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | < 0,5 | |
| 5'-TACCAGTCAGGATGTTGGGAA | |||
| A-J’AI | 3'-ACCAGCGACCCCTTATACAGTCAT | 8.2 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| C-J’AI | 3'-ACCAGCGACCCCTTATCCAGTCAT | 1.0 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| G-J’AI | 3'-ACCAGCGACCCCTTATGCAGTCAT | 15.4 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
| T-J’AI | 3'-ACCAGCGACCCCTTATTCAGTCAT | 16,6 | |
| 5'-TGGTCGCTGGGGAATAIG | |||
Tableau 1. Relecture des substrats et l’efficacité de la correction par le fragment de Klenow. Ce tableau montre les "BOLD" 4-nucléotides à l’extrémité 3' du modèle contenant les modifications phosphorothioate. Les paires de bases dépareillées sont en caractères gras. Les relecture analyses ont été effectuées avec la polymérase de Klenow 2 U (8,6 pmol), 50 pmol substrat et 4 ddNTPs à 37 ° C pendant 10 min. * ces valeurs sont des limites pour le niveau de correction parce que le bruit de fond empêche des estimations précises de < 1 % de la totales massives signaux observés. (Ce chiffre est une adaptation de Su et al. 25 avec autorisation.)
| EH BIEN | TERME | SNP_ID | 2E-PCRP | 1ER-PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | TM | PcGC | PWARN | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_CALL | EXT1_MASS |
| W1 | iPLEX | T28 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 8524.54 | ATGGTCAGTCCTGCAACCCTTCAGCTGA | |||
| W1 | iPLEX | P21 | NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 6495.24 | TACCAGTCAGGACGTTGGGAA | |||
Le tableau 2. T28_P21.xlsx fichier. Le réglage a été utilisé pour la Figure 3D, 3E, 4 aet 5 a.
| 1201-1 |
| 1201-2 |
| 1201-3 |
| 1201-4 |
| 1201-5 |
| 1201-6 |
| 1201-7 |
Tableau 3. 1201.xlsx fichier. Le réglage a été utilisé pour des 7 réactions Figure4 a.
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Discussion
Cette étude décrit une étape par étape analyse d’activité de relecture analysée par l’instrument commercial choisi (voir la Table des matières) à l’aide de MALDI-TOF MS. Les principaux avantages comprennent que l’apprêt et le modèle sont étiquette gratuit et facile à exécuter, ce qui permet une plus grande flexibilité dans la conception des expériences. Un flux bâtards complète transformation de 30 essais de relecture prendrait 4 h, y compris 3 h pour effectuer manuellement les relecture des réactions et leur nettoyage, tandis que les analyses de MALDI-TOF MS à l’aide du protocole susmentionné prend 1 h pour terminer. Le principal inconvénient de cette méthode est la quantité de substrat nécessaire pour le dosage. Pour obtenir des signaux forts et des résultats constants, nous avons utilisé 50 pmol du substrat de l’ADN dans une réaction de 20 µL ; ainsi, la quantité d’ADN est bien supérieure à celle d’ADN radiomarqué expériences8,9,10. Réduire les volumes et la taille de l’échantillon et d’affiner l’opération MS peuvent diminuer la quantité de substrat nécessaire.
Des oligonucléotides synthétiques obtenus de sources commerciales peuvent être utilisés pour l’étude de relecture directement sans traitement ou toute autre purification. Toutefois, il est conseillé de vérifier la pureté et la qualité de l’ADN par MALDI-TOF MS. Les liaisons phosphorothioate ont été introduits pour remplacer les liaisons 4 phosphodiester derniers à l’extrémité 3' du modèle (tableau 1) afin de réduire la dégradation non spécifique du brin modèle (Figure 3), mais à un coût plus élevé par exemple. Fait intéressant, les signaux de la matrice et les amorces ADN peuvent être bien séparés par MS en raison de leur différence de taille ; par conséquent, cette modification phosphorothioate n’est pas nécessaire. En 3E Figure, par exemple, tous les produits possibles de l’extension d’amorce P21 et la relecture excision et resynthèse étaient moins de 22 nt (m/z < 7 000), tandis que tous les fragments de dégradation du modèle T28 étaient supérieures à 24 nt (m/z > 7 000 ). Les résultats Figure 4 a étaient de la même P21/T28 recto verso défini comme ceux de 3E Figure. Une fenêtre agrandie de m/z 6 000-7 000 montre uniquement les signaux de l’amorce de l’ADN sans tout signal de confusion du modèle.
La stratégie consistant à utiliser des amorces avec une extension de ddNMP s’est avéré pour être très stable, et, ainsi, contenant des produits ddNMP sont de bons indicateurs pour l’analyse de la relecture. L’ajout de ddNMP à produits excision pourrait « geler » les relecture produits en l’État pour l’analyse immédiatement après l’excision. Alternativement, en utilisant un seul dNTP correct (Figure 5 b) au lieu de 4 ddNTPs pour supprimer l’activité hydrolytique non spécifique de l’exonucléase relecture est également réalisable.
Arrêter les réactions avec une procédure d’extraction standard phénol/chloroforme est avéré pour être le meilleur moyen pour la fin de la réaction car, en une seule étape, il permet les réactions faut arrêter tout en enlevant aussi toute interférence de protéine. Par ailleurs, trempe, l’acide qui se prête à l’automatisation, puis neutralisé par non métalliques alcalins sans une phase de séparation, a également démontré des résultats fiables. Des adduits de l’ion sodium (Na+ dans la Figure 4, 5et 7) sont préoccupantes car ils peuvent augmenter de fond et compliquer la discrimination de signal. Une bonne utilisation de la propre résine peut réduire ces interférences ; Pourtant, même lorsque ces adduits sont présents, ils ont normalement beaucoup plus petits pics par rapport à leur parent-signal, et cette propriété peut être utilisée pour distinguer entre eux (Figure 4, 5et 7). Généralement, la hauteur du pic de sodium adduits était proportionnelle aux sommets majeurs ; l’inclusion ou l’exclusion de sodium adduits dans le calcul n’affecte pas significativement les résultats de la quantification. Par conséquent, pour la quantification, nous avons utilisé la hauteur du pic majeur que pour le calcul.
Les relecture expériences décrites ici ont profité des non-correspondances internes pour démontrer l’importance de l’exonucléase partition de domaine dosage de KF26 et l’ADN polymérase détaillée j’ai capacité de corriger efficacement l’inadéquation à vers le haut 4 nt en amont de l’apprêt extrémité 3' (Figure 5, 1 - 4) probablement en raison de la stabilité d’appariement à l’apprêt-modèle jonctions27. En outre, cette étude a aussi utilisé amorces contenant des lésions désoxyinosine avant-dernier pour étudier un PPS que je répare d’endo V-entaillé réparation intermédiaires. Les résultats ont montré que L-j’ai réparé plus efficacement que A-I et G-I ; Cependant, C-j’ai été réfractaire à la pol j’ai réparer (tableau 1 et Figure 7). Ces résultats confirment qu’une analyse de MALDI-TOF MS peut être très utile pour la correction d’épreuves et de divers court-patch28 en raison de sa haute résolution des analyses de réparation de l’ADN.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions la NCFPB intégrée Core Facility de génomique fonctionnelle (Taipei, Taiwan) et le laboratoire de la pharmacogénomique NRPB (Taipei, Taïwan) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation santé de Taiwan (L-I.L.) et le ministère des sciences et technologie, Taipei, Taiwan, ROC [plus 105-2320-B-002-047] pour Hu Wei-Yao, recherche [plus 105-2628-B-002-051-MY3] pour Su Kang-Yi et [ Most-105-2320-B-002-051-My3] pour Liang-en Lin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Oligonucleotides | Mission Biotech (Taiwan) | ||
| phosphorothioate modified oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Taiwan) | ||
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs, MA | M0210L | |
| Klenow fragment (3'→5' exo-) | New England Biolabs, MA | M0212L | |
| NEBuffer 2.1 (10X) | New England Biolabs, MA | B7202S | |
| 2', 3' ddATP | Trilink Biotechnologies, CA | N4001 | |
| 2', 3' ddGTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4002 | |
| 2', 3' ddTTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4004 | |
| 2', 3' ddCTP | Trilink Biotechnologies, CA | N4005 | |
| dATP, dGTP, dCTP, dTTP set | Clubio, Taiwan | CB-R0315 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | ||
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | |
| Clean Resin Tool Kit | Agena Bioscience, CA | #08040 |
References
- Loeb, L. A., Kunkel, T. A. Fidelity of DNA synthesis. Annual Review of Biochemistry. 51, 429-457 (1982).
- Kornberg, A., Baker, T. DNA replication. , W.H. Freeman. Oxford, UK. (1992).
- Carroll, S. S., Benkovic, S. J. Mechanistic aspects of DNA polymerases: Escherichia coli DNA polymerase I (Klenow fragment) as a paradigm. Chemical Reviews. 90 (7), 1291-1307 (1990).
- Echols, H., Goodman, M. F. Fidelity Mechanisms in DNA Replication. Annual Review of Biochemistry. 60 (1), 477-511 (1991).
- Johnson, K. A. The kinetic and chemical mechanism of high-fidelity DNA polymerases. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1041-1048 (2010).
- Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: Multiple roles maintain genome stability. Biochimica et Biophysica Acta. 1804 (5), 1049-1063 (2010).
- Fidalgo da Silva, E., Reha-Krantz, L. J. DNA polymerase proofreading: active site switching catalyzed by the bacteriophage T4 DNA polymerase. Nucleic Acids Research. 35 (16), 5452-5463 (2007).
- Petruska, J., Goodman, M. F. Influence of neighboring bases on DNA polymerase insertion and proofreading fidelity. The Journal of Biological Chemistry. 260 (12), 7533-7539 (1985).
- Mendelman, L. V., Petruska, J., Goodman, M. F. Base mispair extension kinetics. Comparison of DNA polymerase α and reverse transcriptase. The Journal of Biological Chemistry. 265 (4), 2338-2346 (1990).
- Lutz, S., Burgstaller, P., Benner, S. A. An in vitro screening technique for DNA polymerases that can incorporate modified nucleotides. Pseudothymidine as a substrate for thermostable polymerases. Nucleic Acids Research. 27 (13), 2792-2798 (1999).
- Da Silva, E. F., Mandal, S. S. S., Reha-Krantz, L. J. Using 2-aminopurine fluorescence to measure incorporation of incorrect nucleotides by wild type and mutant bacteriophage T4 DNA polymerases. The Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 40640-40649 (2002).
- Frey, M. W., Sowers, L. C., Millar, D. P., Benkovic, S. J. The nucleotide analog 2-aminopurine as a spectroscopic probe of nucleotide incorporation by the Klenow fragment of Escherichia coli polymerase I and bacteriophage T4 DNA polymerase. Biochemistry. 34 (28), 9185-9192 (1995).
- Leung, K. H., et al. A highly sensitive G-quadruplex-based luminescent switch-on probe for the detection of polymerase 3'-5' proofreading activity. Methods. 64 (3), 224-228 (2013).
- Song, C., Zhang, C., Zhao, M. Rapid and sensitive detection of DNA polymerase fidelity by singly labeled smart fluorescent probes. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 2699-2702 (2011).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
- Haff, L. A., Smirnov, I. P. Multiplex genotyping of PCR products with MassTag-labeled primers. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3749-3750 (1997).
- Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), e155 (2003).
- Su, K. Y., et al. Pretreatment Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 433-440 (2012).
- Lee, C. C., et al. Endonuclease V-mediated deoxyinosine excision repair in vitro. DNA Repair. 9, 1073-1079 (2010).
- Lee, C. C., et al. The excision of 3' penultimate errors by DNA polymerase I and its role in endonuclease V-mediated DNA repair. DNA Repair. 12 (11), 899-911 (2013).
- Kucera, R. B., Nichols, N. M. DNA-Dependent DNA Polymerases. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 3.5.1-3.5.19 (2008).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Weiss, B. Removal of deoxyinosine from the Escherichia coli chromosome as studied by oligonucleotide transformation. DNA Repair. 7 (2), 205-212 (2008).
- Cao, W. Endonuclease V: an unusual enzyme for repair of DNA deamination. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (17), 3145-3156 (2013).
- Su, K. Y., et al. Application of single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry in proofreading and DNA repair assay. DNA Repair. 61, 63-75 (2018).
- Carver, T. E., Hochstrasser, R. A., Millar, D. P. Proofreading DNA: recognition of aberrant DNA termini by the Klenow fragment of DNA polymerase I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10670-10674 (1994).
- Santa Lucia, J. Jr, Hicks, D. The thermodynamics of DNA structural motifs. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 415-440 (2004).
- Su, K. Y., et al. DNA polymerase I proofreading exonuclease activity is required for endonuclease V repair pathway both in vitro and in vivo. DNA Repair. 64, 59-67 (2018).
