Summary
وقد مكن في فيفو ميكرودياليسيس مجموعة من الجزيئات الموجودة في الدماغ السائل الخلالي (قوي الأمن الداخلي) من الحيوانات مستيقظا، ويتصرف بحرية. من أجل تحليل الجزيئات الكبيرة نسبيا في قوي الأمن الداخلي، المادة الحالية يركز تحديداً على البروتوكول ميكرودياليسيس باستخدام المسابر مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية.
Abstract
في فيفو ميكرودياليسيس تقنية قوية لتجميع قوي الأمن الداخلي من الحيوانات مستيقظا، ويتصرف بحرية استناداً إلى مبدأ الغسيل الكلوي. أن ميكرودياليسيس أسلوب المنشأة أن التدابير جزيئات صغيرة نسبيا بما في ذلك الأحماض الأمينية أو العصبية، فقد استخدم مؤخرا أيضا تقييم ديناميات الجزيئات الكبيرة في قوي الأمن الداخلي باستخدام المسابر مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية. عند استخدام مثل هذه التحقيقات، وقد ميكرودياليسيس ليتم تشغيلها في وضع دفع وجذب لتجنب الضغوط التي تراكمت داخل التحقيقات. توفر هذه المقالة خطوة بخطوة البروتوكولات بما في ذلك الجراحة ستيريوتاكسيك وكيفية إعداد خطوط ميكرودياليسيس لتجميع البروتينات من قوي الأمن الداخلي. أثناء ميكرودياليسيس، يمكن إدارة الأدوية النظامية أو عن طريق التسريب المباشر إلى قوي الأمن الداخلي. وميكرودياليسيس عكس أسلوب لبث المركبات مباشرة إلى قوي الأمن الداخلي. إدراج العقاقير في المخزن المؤقت لنضح ميكرودياليسيس يسمح لهم منتشر في قوي الأمن الداخلي من خلال تحقيقات حين جمع قوي الأمن الداخلي في وقت واحد. ويبين المؤلف بقياس البروتين تاو كمثال، كيف تتغير مستوياته على حفز نشاط الخلايا العصبية بعكس ميكرودياليسيس من بيكروتوكسين. يرد وصف المزايا والقيود المفروضة على ميكرودياليسيس جنبا إلى جنب مع التطبيق الموسع عن طريق الجمع بين أساليب أخرى في فيفو .
Introduction
قوي الأمن الداخلي تضم 15-20% حجم الدماغ الإجمالي ويوفر المكروية حاسمة بالنسبة لتوصيل الإشارة والنقل الركيزة وإزالة النفايات1. ولذلك، سيوفر قدرة جمع قوي الأمن الداخلي من الحيوانات الحية آثار أكبر بالنسبة لمختلف العمليات البيولوجية، فضلا عن إليه المرض. في فيفو ميكرودياليسيس هي واحدة من الطرق القليلة أن العينة وقياس الجزيئات خارج الخلية من قوي الأمن الداخلي من مستيقظا، تتحرك بحرية الحيوانات ومما يخدم كأداة مفيدة في علم الأعصاب البحوث الميدانية2،3. في هذا الأسلوب، وإدراجها في الدماغ ميكرودياليسيس تحقيقات مع الأغشية semipermeable و perfused مع المخزن المؤقت التروية بمعدل التدفق البطيء نسبيا (0.1-5 ميليلتر/دقيقة). خلال هذه التروية، جزيئات خارج الخلية في قوي الأمن الداخلي منتشر في التحقيق وفقا للتدرج تركيز سلبية وجمع دياليساتي. على الرغم من أن تركز هذه المقالة على أسلوب الذي عينة قوي الأمن الداخلي في الدماغ، المبدأ والطريقة يمكن تطبيقها على الأجهزة الأخرى بالتعديل المناسبة إذا لزم الأمر.
واستخدمت ميكرودياليسيس أول مرة في أوائل الستينات، ومنذ ثم أنها قد استخدمت على نطاق واسع لجمع جزيئات صغيرة بما في ذلك الأحماض الأمينية أو العصبية في الدماغ. ومع ذلك، وسعت الأخيرة التوافر التجاري لتحقيقات ميكرودياليسيس مع الوزن الجزيئي العالية قطع الأغشية (100 3 كاتشين MDa) تطبيقه على البروتينات أكبر نسبيا في قوي الأمن الداخلي، وكذلك4،،من56 ،7. الدراسات التي تستخدم هذه المجسات أدى إلى إيجاد تلك البروتينات مثل تاو أو α-سينوكلين الذي كان يعتقد منذ فترة طويلة أن تكون حصرية هيولى موجودة أيضا الناحية الفسيولوجية في قوي الأمن الداخلي4،،من58.
إحدى الصعوبات استخدام المسابير ميكرودياليسيس مع قطع كبيرة من الأغشية (كاتشين 1,000 عادة أكثر) أنهم أكثر عرضه ل ultrafiltration السوائل المفقودة بسبب الضغوط الداخلية المتراكمة في التحقيقات. وقد ميكرودياليسيس المسابر المستخدمة هنا بنية فريدة من نوعها لتجنب هذه المشكلة. سوف لا تكون تراكمت الضغط نتيجة لهذا الهيكل، وبالتالي ينبغي أن يدار ميكرودياليسيس مع هذه التحقيقات في وضع "دفع وجذب" باستخدام مضخة الحقن إلى نتخلل المسابر (= دفع) ومضخة اسطوانة/تحوي جمع dialysate القادمة من منفذ مسبار (= السحب) 9 (على الرغم من أنه يحتاج إلى مضخات الدفع والجذب، بسبب ضغط إلغاء تنفيس ثقوب موجودة في التحقيقات، النظام من الناحية الفنية فقط تحركها مضخة سحب). يبدأ بالجراحة ستيريوتاكسيك لغرس القنية دليل هذه المادة وتوضح هذه المقالة كيفية إعداد خطوط ميكرودياليسيس من أجل جمع قوي الأمن الداخلي من خلال تحقيقات ميكرودياليسيس مع كاتشين 1,000 وقف إنتاج الأغشية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الدراسات الحيوانية تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة "مدرسة الدراسات العليا للطب" في جامعة طوكيو.
1-قبل إجراء العمليات الجراحية
- قبل البدء بعملية جراحية، يمسح كل شيء مع الإيثانول 70% للحفاظ على ظروف معقمة. ويوصي بدعم الحرارية باستخدام وسادة تدفئة.
- تخدير الفئران بحقن داخل كلورال هيدرات (400 مغ/كغ). تأكيد أنيسثيتيزيشن بأداء قرصه أخمص القدمين. يوصي باستخدام ميلوكسيكام ريال في الاستقراء والبوبرينورفين بعد شفائهم محاولة لمالا يقل عن 24 ساعة.
- حلاقة الشعر مع المقص جراحي. إصلاح ماوس الماوس ومحول الفئران حديثي الولادة باستخدام أشرطة الإذن والمشبك آنف.
ملاحظة: من المهم للتأكد من أن رأس الماوس هو المضمون في هذه المرحلة ولا تتحرك جنبا بجنب. - تطبيق مرهم البيطرية في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
2-ستيريوتاكسيك لعملية جراحية لغرس القنية دليل
- تعيين الماوس وفار الولدان محول على الجهاز ستيريوتاكسيك. جعل شق ساجيتالي على الجلد أكثر من الجمجمة باستخدام مشرط. تمحو الدم والنسيج الضام في الجمجمة باستخدام مسحه القطن رطبة.
- تحديد التنسيق لمنطقة الدماغ لمصلحة استخدام أطلس الدماغ. قبل البدء في القياسات، تأكد من أن خط الوسط مستقيم حتى يمكن مثقاب انتقلت A-P، وتبقى على خياطة خط الوسط طوال الوقت.
ملاحظة: يستخدم هذه المقالة التنسيق (A/p:-3.10 مم، M/l:-2.50 ملم، د/الخامس:-1.20 مم، 12 درجة) لاستهداف الحصين الخلفي. - جمجمة مستوى A-P
- إرفاق تدريبات على مناور إطار ستيريوتاكسيك. خفض التدريبات حتى أنها تمس برفق لامدا وسجل تنسيق البطني. كرر هذا الإجراء بريجما.
ملاحظة: عندما يتم تسويته الجمجمة، قياس الرأسي بريجما مساوية لامدا. إذا لم يكن كذلك، ضبط ارتفاع المشبك الآنف تبعاً لذلك. بعد أن يحصل تعادل الجمجمة، سجل إحداثي بريجما الأمامي/الخلفي، والجانبي.
- إرفاق تدريبات على مناور إطار ستيريوتاكسيك. خفض التدريبات حتى أنها تمس برفق لامدا وسجل تنسيق البطني. كرر هذا الإجراء بريجما.
- مستوى الجمجمة اليسار واليمين
- نقل التدريبات من بريجما إلى التنسيق (A/p:-3.10 مم، M/l: +2.0 ملم) وخفض التدريبات في الجمجمة وتسجيل اﻻحداثي الرأسي. ثم كرر هذا الإجراء للتنسيق (A/p:-3.10 مم، M/l:-2.00 ملم).
ملاحظة: إذا كان يتم تسوية الجمجمة، تتساوى هذه القياسات الرأسية من نقطتين مسافة واحدة من خط الوسط. إذا لم يكن الأمر كذلك، ضبط ارتفاع أشرطة الإذن.
- نقل التدريبات من بريجما إلى التنسيق (A/p:-3.10 مم، M/l: +2.0 ملم) وخفض التدريبات في الجمجمة وتسجيل اﻻحداثي الرأسي. ثم كرر هذا الإجراء للتنسيق (A/p:-3.10 مم، M/l:-2.00 ملم).
- حفر حفرة لدغ بعناية في تنسيق الهدف (A/p:-3.10 مم، M/l:-2.50 ملم) زرع قنية دليل. إذا كان القطر من ثقب لدغ ليست كبيرة بما يكفي غرس قنية دليل، حفر ثقب آخر يتداخل مع أول واحد. حفر ثقب آخر في العظم الجداري حق (الجانب كونترالاتيرال) وإدراج المسمار العظام، مما يساعد على تأمين الأسمنت الأسنان في 1.10 (انظر الشكل 1B).
- قص قطعة دائرية تأمين من الجانب الخلفي من غطاء أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل بشفرة حلاقة وجعل '' تاج ''. يستخدم هذا التاج لمنع الأسمنت الأسنان من الانتشار للجلد. وضعه في الجمجمة حيث أن الثقوب لدغ في الخطوة 2، 5 البقاء داخل الدائرة (انظر الشكل 1).
- إعداد عقد جمعية ستيريوتاكسيك بوضع قنية دليل على الذراع أقصر من محول ستيريوتاكسيك وثبتت عليه باستخدام غطاء الجوز. تعيين ذراع أطول من محول ستيريوتاكسيك على المشبك الكهربائي. نعلق على مناور جهاز ستيريوتاكسيك (انظر الشكل 1A).
- استدارة الجمعية ستيريوتاكس د-V في الذراع مناور 12 درجة (انظر الشكل 1B). نقل قنية دليل للدغ حفرة في 1.6. إدراج قنية دليل ببطء في الدماغ بخفضه من 1.2 مم.
ملاحظة: زاوية التحقيق محددة إلى الحصين؛ قد تتطلب المناطق الأخرى لا زاوية أو زوايا أخرى على الإطلاق. استشارة أطلس الدماغ لإحداثيات دقيقة. الجاف على سطح الجمجمة، لأنه إذا لم الأسمنت لن تتمسك، ويمكن أن تصبح فكها غطاء الأسمنت - إضافة الأسمنت الأسنان داخل التاج تغطية كامل الجزء المعدني قنية دليل والمسمار العظام ما يكفي لتأمينها. تطبيق الأسمنت الأسنان إضافية إذا كان هناك جزء من جمجمة مكشوف.
- انتظر حتى تماما هو المجففة الأسمنت الأسنان (~ 12-20 دقيقة). قم بإزالة محول ستيريوتاكسيك من المشبك الكهربائي. إزالة غطاء الجوز واستبدال محول ستيريوتاكسيك مع تحقيق زائف وربط الجوز كاب.
- حرر زر الماوس من جهاز ستيريوتاكسيك وبيت الماوس وحدها في قفص حدة.
ملاحظة: الماوس لا ينبغي أن تترك غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. تحقق من الماوس يوميا حتى يوم ميكرودياليسيس. ويتلقى الماوس المسكنات مثل والايبوبروفين إذا كان يبدو في الألم. انتظار 2 أسابيع أمر ضروري لدراسات النوم-اليقظة حتى الماوس هابيتواتيس إلى البيئة الجديدة10، ولكن أنواع أخرى من الدراسات قد تتطلب فترات استرداد أقصر (مثلاً، 1-2 أيام).
3-ميكرودياليسيس الإعداد
- فحص الجودة من تحقيقات: تعبئة حقنه المتاح 1 مل مع الشربووجدت المقطر توصيله بالمنفذ (بورت أقصر) للتحقيق باستخدام أنبوب بيتون. تغطية ثقوب تنفيس مع الأصابع وكساد المكبس حقنه برفق ضخ المياه للتحقيق. تحقق من أن تظهر المياه من مدخل التحقيق وهناك لا تسرب على سطح غشاء ميكرودياليسيس.
- تنشيط تحقيقات: تغرق في الأغشية للتحقيق في الإيثانول (70-100%) لمدة ثانيتين. وبعد ذلك، ضخ الماء المقطر في التحقيق مرة أخرى مع حقنه مرة أخرى.
- إعداد المخزن المؤقت التروية: لتفادي التصاق الجزيئات المستهدفة للغلايات، إضافة جيش صرب البوسنة بتمييع حل جيش صرب البوسنة 30% إلى 4% مع الخدمات القطرية المصطنعة (1.3 مم كاكل2، 1.2 مم MgSO4، 3 مم بوكل، 0.4 مم خ2ص4، 25 مم ناكو3 ، عيار 122 ملم كلوريد الصوديوم، درجة الحموضة = 7.35)، تطابقاً مع تركيز المنحل بالكهرباء في السائل الدماغي النخاعي، مباشرة قبل استخدامها. قم بتصفية المخزن المؤقت التروية من خلال وحدة تصفية المحاقن مع 0.1 حجم المسام ميكرومتر.
ملاحظة: 4% جيش صرب البوسنة يحسن الانتعاش للالتصاق البروتينات ولكن يمكن أن تحد بشدة من تسليم المركبات، خاصة بالنسبة للمركبات التي لديها جيش صرب البوسنة-ربط عالية. هذا إحدى ميزات استخدام تركيز أقل من جيش صرب البوسنة (مثل 0.15%) في بعض الحالات3. علما بأن جيش صرب البوسنة يمكن تجميعها بسهولة جداً عند تحريكها بلوحة دوامة أو إثارة. يمكن أن تسد هذه المجاميع المسابير أو مسام الغشاء. يجب توخي الحذر عند إعداد حل جيش صرب البوسنة للحد من هذا التجميع - إعداد سطرين منفصلين لمدخل ومخرج (انظر الشكل 1) وتوصيل خطوط على حد سواء مع إبرة اتصال. ملء المتاح 3 مل حقنه مليئة بالمخزن المؤقت التروية وتوصيله مع نهاية مدخل الأنابيب باستخدام إبرة بلانت-نهاية. ملء الأنبوب كامل مع نضح المخزن المؤقت عن طريق تشغيل المضخة المحاقن.
- إيقاف المضخة المحاقن واستبدالها الإبرة الاتصال بين الخط مدخل ومخرج خط تحقيقا ميكرودياليسيس المنشط من الخطوة 3، 3 (انظر الشكل 1). قبل هذا الاستبدال، وضع الجوز كاب على التحقيق.
- تركيب أنبوب الاسطوانة في أنابيب المآخذ على المضخة الدوارة. بدء ضخ حقنه في 10 ميليلتر/دقيقة ومن ثم المضخة الدوارة في معدل التدفق أبطأ قليلاً (9.5-9.8 ميليلتر/دقيقة). تأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء في الأنبوب الكامل، الذي يمكن أن يؤثر في الانتعاش عندما يقومون بإدخال المسبار.
- تخدير الماوس من الخطوة 1، 12 بنفس الطريقة كما في الخطوة 1.2. وضع طوق الماوس حولها في الرقبة. إزالة غطاء الجوز ومسبار وهمية وبطء إدراج تحقيق ميكرودياليسيس من 3.4 من خلال قنية دليل وربط الجوز كاب.
- مكان الماوس في القفص متصل بنظام الحركة الحرة وحبل الماوس مع ذوي الياقات البيضاء. الحفاظ على تشغيل المضخة المحاقن ومضخة الاسطوانة بمعدل تدفق المشار إليها في الخطوة 3، 5 على الأقل 1 ح.
ملاحظة: لتحقيق جمع قوي الأمن الداخلي من الحيوانات مستيقظا، تستخدم هذه المقالة نظام الحركة الحرة، حيث القفص نفسه يستجيب لحركة الحيوان للحفاظ على الغلايات من التواء. بدلاً من ذلك، يمكن أيضا استخدام سائل يدور المتاحة من مختلف الشركات. - محطة ضخ الاسطوانة أولاً ومن ثم ضخ حقنه. تعيين معدل التدفق المطلوب. تشغيل المحاقن ضخ 20 ٪ أسرع من المضخة الدوارة.
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا قمت بتشغيل في 1 ميليلتر/دقيقة، تعمل المضخة حقنه في 1.2 ينبغي أن تحدد معدل التدفق الأمثل ميليلتر/كحد أدنى لكل جزيء تجريبيا. - جمع عينات من قوي الأمن الداخلي: وضع نهاية الأنابيب منفذ مجاناً على جامع الكسر المبردة.
ملاحظة: يختلف حجم العينة المناسب تبعاً لفحوصات المستخدمة للتحليل. - بعد الانتهاء من هذه التجربة، إزالة المسبار. (تخدير الماوس حسب الحاجة.) التعامل مع الانتعاش الماوس بنفس الطريقة كما في الخطوة 2.11. تحليل قوي الأمن الداخلي التي يتم جمعها من خلال أساليب مثل [هبلك] أو أليسا.
- غسل الأنابيب كاملة بعد ميكرودياليسيس، الاتصال مدخل ومنفذ الغلايات مرة أخرى بالاستعاضة عن التحقيق مع الاتصال إبرة وتشغيل المبيض المخفف في الأنبوب كامل وثم مسح عليه بالماء. الجاف وتخزينها للاستخدام المتكرر.
ملاحظة: أنواع أخرى من الغلايات مقبولة، بيد أن جيش صرب البوسنة في المخزن المؤقت التروية يمكن أن تسد الأنابيب مع القطر الصغير، وبالتالي تعتبر هذه الأنابيب تستخدم مرة واحدة. الغلايات يمكن ارتداؤها أو انسداد بعد استخدامات متعددة، لذا تأكد أن معدل التدفق يتسق كل مرة قبل الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أن تحفز أو تثبط نشاط الخلايا العصبية في عكس ميكرودياليسيس11،،من1213، بيكروتوكسين، خصم مستقبلات GABAA أو تيدرودوتاكسين، استخدمت مانع قناة نا+ . فقد ثبت أن إطلاق سراح تاو هو حفز زيادة نشاط الخلايا العصبية13،14. تمشيا مع هذه الملاحظات السابقة، عندما كانت تدار 50 ميكرومتر بيكروتوكسين (PTX) عن طريق عكس ميكرودياليسيس (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل) في الفئران C57B6/ي مستيقظا زيادة قوي الأمن الداخلي تاو الذاتية مقارنة مستويات تقاس أليسا لأداة التحكم ([دمس]) ( الشكل 2).
رقم 1: إعداد عملية جراحية وتشييد الدوائر ميكرودياليسيس. (أ) إعداد جمعية ستيريوتاكسيك لغرس دليل استخدام الجوز كاب ومحول ستيريوتاكسيك وقنية دليل. (ب) ستيريوتاكسيك جراحة زرع قنية دليل. يتم إدراج قنية دليل في الدماغ في درجة 12 فيما يتعلق برأسي. (ج) تشييد أنابيب مدخل وأنابيب منفذ. مدخل خط يتكون من 70 سم FEP الأنابيب (جي-70) وخط منفذ يتكون من جي-70 وأنبوب الاسطوانة و 1/2 من أنابيب FEP. وتستخدم الإبر الاتصال لكل اتصال. (د) متى الأنبوب كامل مليء نضح المخزن المؤقت، تتوقف المضخة واستبدالها الإبرة الاتصال بين الخط مدخل ومخرج خط تحقيقا ميكرودياليسيس المنشط. تأكد من توصيل نهاية الأنابيب مدخل إلى مدخل الميناء للتحقيق (منفذ أطول) وقم بتوصيل نهاية الأنابيب منفذ مع المنفذ منفذ للتحقيق (ميناء أقصر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: عكس بيانات تمثيلية تظهر التغييرات تاو قوي الأمن الداخلي عند بيكروتوكسين ميكرودياليسيس- بيكروتوكسين (PTX، 50 ميكرومتر) أو تم تسليمها [دمس] في قرن آمون الفئران C57B6/ي عن طريق عكس ميكرودياليسيس. بيكروتوكسين زادت بسرعة مستويات تاو الذاتية قوي الأمن الداخلي من المستويات القاعدية (أي، تاو متوسط التركيزات خلال ح 3 قبل الإدارة PTX) مقارنة بمعاملة [دمس]. يتم عرض البيانات ك mean±SEM، n = 3 ل [دمس]، n = 4 ل PTX. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميكرودياليسيس مع ارتفاع الوزن الجزيئي قطع الأغشية ليدار بطريقة دفع وجذب، وبالتالي من الأهمية بمكان أن معدل التدفق دقيقة وثابتة. عدم دقة في معدلات التدفق يمكن أن تكون قضية توليد فقاعة هواء وعدم تناسق في تركيز العينة. إذا كان التدفق غير متناسقة، تحقق من كافة الاتصالات للتسرب. إذا استمرت المشكلة، قد يلزم إعادة تشغيل مع تحقيقات جديدة والغلايات.
يتم بشكل مستمر perfused المسابير ميكروديلايسيس بالمخزن المؤقت نضح. ولذلك، لا توجد وقتاً كافياً لجزيئات الخلية للوصول إلى توازن كامل في المخزن المؤقت التروية. نتيجة لذلك، التركز في دياليساتي أقل بكثير من تركيزه الفعلي في قوي الأمن الداخلي. من أجل تقدير صحيح تركيز الجزيئات في قوي الأمن الداخلي، هو أسلوب تدفق صفر غالباً ما تستخدم3،،من515. هذا الأسلوب يقيس التركيز بتغيير معدل التدفق. وهناك علاقة عكسية بين التركيز ومعدل التدفق. ولذلك، يمكن تحديد تركيز الجزيئات المستهدفة باستقراء المنحنى الأسى العودة إلى النظرية صفر التدفق، الذي يمثل استرداد مثالية للجزيئات. غير أن الانتعاش يمكن أن يتأثر بعوامل مختلفة مثل التفاعل مع الأغشية أو hydrophobicity من الجزيئات أو التفاعل مع غيرها من البروتينات، وواحدة ينبغي أن نضع في اعتبارنا أن التركيز في الصفر النظرية قد لا تكون بالضرورة ما يعادل تركيزه الحقيقي في قوي الأمن الداخلي.
إدراج مسبار ضررا المحلية الحادة في الدماغ. من هذا السبب، تستبعد كسور عدة الأولى عادة من مزيد من التحليل. وفي الواقع، مستويات البروتين تاو قوي الأمن الداخلي في قرن آمون ليست مستقرة في الساعة 9-15 الأولى المحتمل نظراً لأن أسباب الإصابة الحادة غير محددة سراح تاو إلى قوي الأمن الداخلي (المراقبة البلاغ غير منشورة). الاسترداد بعد التحقيق الإدراج الإصابة يختلف من الهدف إلى الهدف. ينبغي إجراء دراسات تجريبية لتحديد عندما يصل مستوى الحالة المستقرة لتحديد متى يجب أن يتم تحليل عينات من كل هدف. وهذا يحدد "نقطة بداية" لأخذ العينات ميكرودياليسيس. نقطة نهاية لأخذ العينات عند الهدف لم يعد في حالة ثابتة (عادة 3-5 أيام بعد التحقيق ميكرودياليسيس غرس؛ لا دليل غرس). ينبغي تحديد بداية ونهاية لكل هدف تجريبيا بكل مختبر لكل هدف.
ميكرودياليسيس مفيد بشكل خاص عندما جنبا إلى جنب مع العلاج بالعقاقير. يمكن أن تدار النظامية المخدرات أو أكسب مباشرة إلى قوي الأمن الداخلي. عكس ميكرودياليسيس هو أحد الأساليب التي مباشرة يتحلى بها المركبات الصغيرة عن طريق إجراء تحقيقات. الغسيل الكلوي يحدث توجه مرتين. ولذلك، يسمح إدراج العقاقير في المخزن المؤقت التروية نشرها على الرغم من أن يسبر ميكرودياليسيس للأنسجة المحيطة. هذا الأسلوب تمكين الإدارة المحلية الصغيرة جمع مجمع والمتزامن لقوى الأمن الداخلي. ميكرودياليسيس العكسي هو أقل الغازية مقارنة بحقنه ضغط من خلال قنية ويمكن الحفاظ على تركيز مستمر أكثر من المخدرات في المنطقة المستهدفة.
قبل البدء ميكرودياليسيس العكسية، ينبغي مراعاة وحدة التخزين الداخلية للأنابيب كاملة لحساب توقيت العلاج وجمع العينات. على سبيل المثال، وحدة التخزين الداخلية كامل الأنابيب المستخدمة في هذه المقالة هي 91.5 ميليلتر (انظر الجدول للمواد اللازمة لوحدة التخزين الداخلية لكل الأنابيب). ولذلك، عندما يكون معدل تدفق 1.0 ميليلتر/دقيقة، يستغرق دقيقة 91.5 للمخزن المؤقت نضح تحتوي على عقاقير للوصول إلى جامع الكسر. من ناحية أخرى، عندما يتم تسليم الأدوية النظامية، ينبغي النظر في وحدة التخزين الداخلية الأنابيب منفذ (56.5 ميليلتر في هذه الحالة).
في فيفو ميكرودياليسيس الأسلوب يقدم عدة مزايا أكثر من غيرها من التقنيات. على سبيل المثال، بينما تتألف homogenates الدماغ المحتمل من البروتينات خارج الخلية وداخل الخلية على حد سواء، ميكرودياليسيس على وجه التحديد تجمع البروتينات خارج الخلية من قوي الأمن الداخلي. ثانيا، يمكن جمع تحقيق ميكرودياليسيس واحد قوي الأمن الداخلي في نقاط زمنية مختلفة من الحيوان نفسه. يمكن تطبيعها تركيز الهدف في كل عينة لخط أساس في المائة. وهذا طبيعتها التركيز المطلق بين الحيوانات حيث يمكن مقارنة الاختلافات النسبية. وهذا يزيد من قوة لدراسة وعادة ما يقلل عدد الحيوانات اللازمة لتجربة عند مقارنة الاختلافات النسبية في مستويات البروتين بعد إدارة المخدرات/التلاعب. من ناحية أخرى، هو القيد الرئيسي من ميكرودياليسيس تقييد حجم الجزيء المستهدف.
ميكرودياليسيس يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى في فيفو . على سبيل المثال، يمكن تقدير أداء ميكرودياليسيس في الفئران المعدلة وراثيا ريجولاتابل في فيفو دوران البروتين الهدف16. واستخدمت في التركيبة مع القياس EEG، لقياس النشاط الكهربائي أثناء عكس ميكرودياليسيس11. ومكن أوبتوجينيتيكس التلاعب بنشاط الخلايا العصبية في الدماغ حين جمع17من قوي الأمن الداخلي في وقت واحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
Acknowledgments
أيد هذا العمل '' معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (بروتين الدماغ الشيخوخة والخرف Control)(15H01552) من يأمرون ومعونات للعلماء الشباب (ب) (20969 ك 16). شكرا مقدم البلاغ الدكتور ديفيد م. Holtzman والدكتور جون ر. سيريتو للنصائح التقنية أثناء تطوير هذا الأسلوب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K.
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
