Summary
体内微透析已使大脑间质液中存在的分子从清醒的、自由行为的动物中收集。为了分析该化合物中相对较大的分子, 本文重点研究了用高分子量切断膜探针的微透析协议。
Abstract
在体内微透析是一种强大的技术, 收集从清醒, 自由行为的动物基于透析原理。虽然微透析是一种测量相对较小的分子, 包括氨基酸或神经递质的已建立的方法, 它最近也被用来评估大分子的动力学, 利用探针与高分子量切断膜。使用这种探针时, 微透析必须以推拉模式运行, 以避免探头内部积聚的压力。本文提供了分步协议, 包括立体定向手术, 以及如何建立微透析线收集蛋白质从。在微透析中, 药物可以系统地或直接输注到疫苗中。反向微透析技术是直接将化合物注入到其上的一种方法。在微透析灌注缓冲器中加入药物, 可使它们通过探针扩散到。以头蛋白为例, 通过对化学点燃癫痫的反向微透析, 揭示了其水平在刺激神经元活性方面的变化。本文结合其他体内方法, 介绍了微透析技术的优点和局限性。
Introduction
该方法包括总脑容积的 15-20%, 并提供了一个关键的微环境对信号传导, 基质运输和废物清除1。因此, 收集活体动物的能力将对各种生物过程和疾病机制带来更大的影响。体内微透析是从清醒的、自由移动的动物中取样和量化细胞外分子的为数不多的方法之一, 从而在神经科学研究领域2、3中成为有用的工具。在该方法中, 透膜的微透析探针插入脑中, 以相对缓慢的流速 (0.1-5 µL/分钟) 灌流灌注缓冲液。在此灌注过程中, 细胞外分子根据浓度梯度被动扩散到探针中, 并作为透析液收集。虽然本文的重点是对脑部标本的方法, 但无论是原则还是方法, 都可以通过适当的修改在必要的情况下应用于其他器官。
微透析在二十世纪六十年代代初首次被使用, 从那时起, 它被广泛用于收集小分子, 包括氨基酸或脑内神经递质。然而, 最近的商业可用性微透析探针与高分子量的切割膜 (100 kDa-3 MDa) 已扩大其应用到相对较大的蛋白质, 以及4,5,6 ,7。使用这些探针的研究结果发现, 长时间被认为是专属细胞质的头或α synuclein 的蛋白质也在生理上存在于4,5,8。
使用微透析探针与大型切断膜 (通常超过 1000 kDa) 的难点之一是, 由于探针中积聚的内压, 它们更容易受到超滤液的损耗。这里使用的微透析探针有一个独特的结构来避免这个问题。压力不会被建立由于这个结构, 因此微透析与这些探针应该操作在 "推挤-拉扯" 方式使用注射器泵灌注探针 (= 推挤) 和滚筒/蠕动泵收集从探针出口的透析器(= 拉)9 (虽然它需要推挤和拉扯泵, 由于压力取消透气孔存在于探针, 系统在技术上仅由拉扯泵驱动)。本文从引导套管植入的立体定向手术入手, 介绍了如何建立微透析线, 以便通过微透析探针与 1000 kDa 膜分离来采集。
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Protocol
所有动物研究都由东京大学医学研究生院机构动物护理和使用委员会审查和批准。
1. 手术前的程序
- 在开始手术前, 用70% 乙醇擦拭所有的东西以保持不育的条件。推荐使用加热垫的热支持。
- 麻醉对小鼠进行腹腔注射水合氯醛 (400 毫克/千克)。通过执行脚趾夹来确认麻醉。推荐使用 meloxicam SR 在感应和丁丙诺啡恢复出价至少24小时。
- 用手术剪刀刮头发。用耳棒和鼻钳固定鼠标和新生老鼠适配器。
注意: 确保鼠标头在这个阶段是安全的, 并且不并排移动是非常关键的。 - 在麻醉时, 应将兽医软膏涂抹于眼部, 以防干燥。
2. 引导套管植入的立体定向手术
- 在立体定向装置上设置鼠标和新生大鼠适配器。用手术刀在头骨的皮肤上做切口弧矢。用湿棉签擦拭头骨上的血液和结缔组织。
- 用脑图谱确定大脑感兴趣区域的坐标。在开始测量之前, 确保中线是直的, 以便钻头可以移动 A P 和保持在中线缝合的整个时间。
注: 本文使用坐标 (A/P:-3.1 毫米, 米/升:-2.5 毫米, d-/V:-1.2 毫米, 12 度) 靶向后海马。 - 水平头骨 A-P
- 在立体定向的机械手上安装钻头。向下钻, 直到它轻轻地接触 lambda 并记录其腹侧坐标。对 bregma 重复此过程。
注意: 当头骨被夷为平地时, bregma 的垂直测量等于 lambda。如果没有, 相应调整鼻钳的高度。在头骨被夷为平地后, 记录 bregma 的前/后侧坐标。
- 在立体定向的机械手上安装钻头。向下钻, 直到它轻轻地接触 lambda 并记录其腹侧坐标。对 bregma 重复此过程。
- 水平头骨左-右
- 将钻头从 bregma 移动到坐标 (A/P:-3.1 毫米, 米/升: +2.0 毫米), 将钻头下钻到头骨并记录垂直坐标。然后重复此过程的坐标 (A/P:-3.1 毫米, 米/升:-2.0 毫米)。
注: 如果头骨被夷为平地, 这些垂直测量的两个等距点从中线是平等的。如果没有, 则调整耳棒的高度。
- 将钻头从 bregma 移动到坐标 (A/P:-3.1 毫米, 米/升: +2.0 毫米), 将钻头下钻到头骨并记录垂直坐标。然后重复此过程的坐标 (A/P:-3.1 毫米, 米/升:-2.0 毫米)。
- 小心地在靶坐标系上钻一个毛刺孔 (a/P:-3.1 毫米, M/升:-2.5 毫米) 以植入导套管。如果毛刺孔的直径不够大, 不能用于引导套管植入, 请钻另一个与第一个孔重叠的洞。在右侧 (对侧) 壁骨上钻另一孔, 插入骨螺钉, 这有助于确保1.10 的牙科水泥 (见图 1B)。
- 用剃刀刀片从1.5 毫升离心机管盖的后侧切开一个圆形锁片, 然后做一个 "皇冠"。这种皇冠是用来防止牙科水泥蔓延到皮肤。把它放在头骨上, 使步骤2.5 中的毛刺孔留在圆圈内 (见图 1)。
- 通过将引导套管放在立体定向适配器的较短臂上, 并使用帽螺母将其固定, 从而设置立体定向组件。在电极钳上设置立体定向适配器的长臂。将其附着在立体定向装置的机械手上 (见图 1A)。
- 旋转机械手臂上的 d-V stereotax 组件12度 (见图 1B)。将导套管移至1.6 所制造的毛刺孔。通过降低1.2 毫米, 将引导套管慢慢插入大脑。
注: 探针的角度特定于海马体;其他地区可能需要其他角度或根本没有角度。请参考大脑图谱以得到精确的坐标。干的头骨表面, 因为如果没有水泥将不坚持和水泥帽可以成为脱落 - 在牙冠内添加牙科水泥, 以充分覆盖导套管的金属部分和足够的螺钉来保护它们。如果头骨中有一部分被暴露, 则应用附加的牙科水泥。
- 等待, 直到牙科水泥完全干燥 (~ 12-20 分钟)。从电极钳上卸下立体定向适配器。取下瓶盖螺母, 用一个虚拟探头替换立体定向适配器, 并固定盖螺母。
- 将鼠标从立体定向装置中释放, 并将鼠标单独放在单独的笼子里。
注意: 鼠标不应该被留在无人看管, 直到它恢复了足够的意识, 以维持胸骨卧床。每天检查鼠标直到微透析。老鼠收到的非甾体类抗炎, 如卡洛芬, 如果它似乎是在疼痛。等待2周对睡眠唤醒的研究是必要的, 所以鼠标 habituates 到新的环境10, 但其他类型的研究可能需要较短的恢复期 (例如, 1-2 天)。
3. 微透析设置
- 探针质量检查: 用蒸馏回水填充一次性1ml 注射器, 用 byton 管将其连接到探头的插座 (较短的端口)。用手指盖住排气孔, 轻轻地压低注射器的柱塞, 将水注入探针。检查探头入口是否出现水, 微透析膜表面没有渗漏。
- 探针活化: 将探针的膜浸入乙醇 (70-100%) 两秒钟。然后再用注射器将蒸馏水注入探针。
- 灌注缓冲剂的制备: 为了避免靶分子与油管的粘附, 添加 bsa 通过稀释 30% bsa 溶液到4% 与人工脑脊液 (1.3 毫米 CaCl2, 1.2 毫米 MgSO4, 3 毫米氯化钾, 0.4 毫米的 NaHCO2., 122 毫米氯化钠, pH 值 = 7.35), 与脑脊液中的电解质浓度密切相关, 在使用前立即。用0.1 µm 孔径的注射器过滤器过滤灌注缓冲器。
注: 4% BSA 提高了黏附蛋白的回收率, 但可以严重限制化合物的传递, 特别是对具有高 BSA 结合性的化合物。这是使用较低浓度的 BSA (如 0.15%) 在某些情况下,3的优势之一。注意, BSA 可以很容易地聚集时, 由涡流或搅拌板搅拌。这些骨料可以堵塞探针或膜孔。在准备 BSA 解决方案以限制此聚合时, 请谨慎使用 - 为入口和出口准备两条单独的线路 (见图 1C), 并用连接针连接两条线。填充一个一次性的3毫升注射器填充灌注缓冲, 并连接到导管的入口端使用钝端针。通过运行注射器泵填充整个油管与灌注缓冲。
- 使用步骤3.3 中的活化微透析探针, 停止注射器泵并更换进线和出口线之间的连接针 (见图 1C)。在更换之前, 把瓶盖螺母放在探头上。
- 在滚筒泵的出口油管上安装滚子管。启动注射器泵在10µL/分钟, 然后辊泵的速度稍慢 (9.5-9.8 µL/分钟)。确保删除整个油管中的所有气泡, 这可能会影响他们进入探头时的恢复。
- 麻醉步骤1.12 中的鼠标与步骤1.2 中的方法相同。把鼠标项圈放在脖子上。取下帽螺母和假探头, 慢慢地从3.4 通过导套管插入微透析探针, 并固定盖螺母。
- 将鼠标放在连接到自由移动系统的笼子里, 并将鼠标拴在衣领上。在步骤3.5 中, 保持注射器泵和滚子泵的运行速度至少为1小时。
注意: 为了达到从醒的动物收集, 这篇文章使用一个自由移动的系统, 笼子本身响应动物的运动, 以防止油管扭曲。另外, 也可以使用各种公司提供的液体旋转。 - 先停止滚筒泵, 然后再用注射器泵。设置所需的流速率。运行注射器泵比滚筒泵快20%。
注: 例如, 如果你运行在1µL/分钟, 操作注射器泵在1.2 µL/分钟. 最佳流速应根据经验对每个分子。 - 收集样品: 将出口油管的自由端放在冷藏馏分收集器上。
注: 适当的样品体积因分析使用的化验结果而异。 - 实验完成后, 取出探头。(根据需要麻醉鼠标。 处理鼠标恢复与步骤2.11 中的方法相同。用 HPLC 法和 ELISA 方法对采集的试剂进行分析。
- 要在微透析后冲洗整个油管, 请用连接针替换探头, 并在整个油管中运行稀释漂白剂, 然后用清水冲洗。干燥和储存, 以重复使用。
注: 其他类型的油管是可以接受的, 但是, 在灌注缓冲中 BSA 可以堵塞小直径的油管, 因此这些油管被认为是一次性使用。油管可以在多次使用后被磨损或堵塞, 所以确保每次使用前的流量都是一致的。
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Representative Results
为了刺激或抑制反向微透析11,12,13, 化学点燃癫痫, GABAA受体拮抗剂或河豚毒素的神经活动, Na+通道阻滞药已被使用。结果表明, 通过神经元活动的增加13,14刺激了头的释放。与以前的观察一致, 当50µM 化学点燃癫痫 (PTX) 通过反向微透析 (参见讨论更多细节) 在醒 C57B6/J 小鼠增加的内源性头水平与车辆控制 (亚砜) 相比, ELISA 测定 (图 2)。
图 1: 手术设置和微透析电路的构建。(A)使用帽螺母、立体定向适配器和导套管设置引导植入的立体定向装置。(B)立体定向手术植入导管导管。引导套管插入到大脑中, 垂直方向为12度。(C)建造进口油管和出口油管。进口线由 70 cm FEP 管材 (JF-70) 和出口线包括 JF-70 和滚子管和 1/2 FEP 管材。连接针用于每个连接。(D)当整个油管装满灌注缓冲液后, 用活化微透析探针停止泵并更换进线和出口线之间的连接针。确保将入口油管的末端连接到探头 (较长的端口) 的入口端, 并将出口油管端与探头的出口端口 (较短的端口) 连接。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 显示化学点燃癫痫反向微透析后的头变化的代表性数据.化学点燃癫痫 (PTX, 50 µM) 或亚砜通过反向微透析传递到 C57B6/J 小鼠的海马。化学点燃癫痫从基底水平迅速增加了内源性头水平 (即PTX 前3小时的平均头浓度) 与亚砜治疗相比。数据显示为 mean±SEM, n = 3 为亚砜, n = 4 为 PTX。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
高分子量切断膜的微透析必须采用推拉方式操作, 因此流速准确、恒定是至关重要的。流动速率的不准确性可能是气泡产生的原因和样品浓度不一致。如果流程不一致, 请检查所有连接是否有泄漏。如果问题仍然存在, 可能需要重新启动新的探头和油管。
Microdilaysis 探头通过灌注缓冲液不断灌注。因此, 细胞外分子没有足够的时间在灌注缓冲液中达到完全平衡。因此, 透析液中的浓度比其实际浓度要低得多。为了估计分子在该化合物中的真正浓度, 采用零流法通常使用3、5、15。该方法通过改变流速来测量浓度。浓度与流速呈反比关系。因此, 目标分子的浓度可以通过将指数曲线推回到理论零流来确定, 这代表了分子的完美恢复。然而, 恢复可能受到各种因素的影响, 如与膜的相互作用或分子的疏水性或与其他蛋白质的相互作用, 并应记住, 在理论零的浓度可能不一定等同于它的真实浓度。
探针插入引起脑部急性局部损伤。因此, 前几个分数通常被排除在进一步分析之外。事实上, 在头9-15 小时内, 海马中的头蛋白的水平并不稳定, 因为急性损伤会导致头的非特异性释放 (作者未发表的观察)。探头插入损伤后的恢复从目标到目标不同。应进行试验研究, 以确定每个目标何时达到稳态水平, 以确定何时应分析样品。这决定了微透析取样的 "起点"。取样端点是当目标不再处于稳态状态 (通常是在微透析探针植入后3-5 天), 而不是引导植入。每个目标的开始和结束都应由每个实验室为每个目标进行经验主义的确定。
微透析在结合药物治疗时尤其有用。药物可以系统地管理或直接注入到疫苗中。反向微透析是直接通过探针注入小化合物的一种方法。透析发生双向。因此, 在灌注缓冲中加入药物可以使其扩散, 虽然微透析探针对周围组织。这种方法使当地管理小化合物和同时收集的联合基金会。反向微透析比通过套管加压注射更容易侵入, 并能在靶区保持更恒定的药物浓度。
在开始反向微透析之前, 应考虑整个油管的内部容积, 以计算处理时间和样品收集。例如, 本文所用的整个油管的内部容积为91.5 µL (请参阅每个油管内部容积的材料表)。因此, 当流速为1.0 µL/分钟时, 含有药物的灌流缓冲液达到分数收集器需要91.5 分钟。另一方面, 当药物被系统地交付时, 应该考虑出口油管的内部容量 (56.5 µL 在这种情况下)。
在体内微透析方法比其他技术提供了一些优势。例如, 虽然脑组织匀浆可能包括胞外和胞内蛋白, 微透析专门收集细胞外蛋白的。其次, 单一的微透析探针可以从同一动物的不同时间点收集。每个样本中的目标浓度都可以规范化为% 基线。这使动物之间的绝对浓度正常化, 所以相对差异可以比较。这增加了研究的力量, 并且通常减少实验所需的动物数量, 当比较药物管理/操作后蛋白质水平的相对差异。另一方面, 微透析的主要局限性是靶分子大小的限制。
微透析可以与其他体内技术相结合。例如, 在 regulatable 转基因小鼠中进行微透析可以估计目标蛋白16的体内周转。结合脑电图,测量被用来测量电活动在反向微透析11。光遗传学使大脑中神经元活动的操作同时收集17。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了来自下个和年轻科学家 (B) (16K20969) 资助的 "对创新领域 (脑蛋白质老化和痴呆控制) (15H01552) 进行科学研究的资助" 的支持。作者感谢 David m. Holtzman 博士和 Cirrito 博士在这一方法的发展过程中提出的技术建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K.
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
