Summary
Microdiálisis in vivo ha permitido colección de moléculas presentes en el líquido intersticial del cerebro (ISF) de animales despiertos, comportarse libremente. Con el fin de analizar las moléculas relativamente grandes en ISF, el actual artículo se centra específicamente en el protocolo de microdialysis con sondas de alto peso molecular cortado de las membranas.
Abstract
Microdiálisis in vivo es una técnica poderosa para recoger ISF en despiertos, comportándose libremente animales basados en el principio de la diálisis. Aunque la microdiálisis es un método establecido que mide relativamente pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores, se ha utilizado recientemente para evaluar también la dinámica de moléculas más grandes en ISF usando puntas de prueba con alto peso molecular cortado membranas. Al uso de estas sondas, microdialysis tiene que ejecutar en modo push-pull para evitar la presión acumulada dentro de las sondas. Este artículo proporciona protocolos paso a paso, incluyendo cirugía estereotáctica y cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger las proteínas de la ISF. Durante microdialysis, drogas pueden administrarse ya sea sistémica o por infusión directa en ISF. Microdiálisis reversa es una técnica para incorporar directamente compuestos en ISF. Inclusión de medicamentos en el búfer de perfusión de microdiálisis permite que difunden en ISF a través de las sondas mientras recogía simultáneamente ISF. Mediante la medición de la proteína tau por ejemplo, el autor muestra cómo los niveles se alteran al estimular la actividad neuronal por microdiálisis reversa de picrotoxin. Ventajas y limitaciones de microdiálisis se describen junto con la solicitud extendida mediante la combinación de otros métodos en vivo .
Introduction
ISF consta de 15-20% del volumen total del cerebro y ofrece un microentorno crítico para la transducción de señales, transporte de substrato y separación de residuos1. Por lo tanto, la capacidad de recogida de ISF de animales vivos proporcionará mayor implicaciones para diversos procesos biológicos como mecanismo de enfermedad. Microdiálisis in vivo es uno de los pocos métodos muestra y cuantificar moléculas extracelulares de ISF de despierto, moviendo libremente animales y de tal modo sirve como una herramienta útil en Neurociencias investigación campo2,3. En este método, las sondas de microdiálisis con membranas semipermeables son insertadas en el cerebro y perfundidas con tampón de perfusión en la tasa de flujo relativamente lento (0.1-5 μl/min). Durante esta perfusión, moléculas extracelulares en ISF pasivamente se difunden en la punta de prueba según el gradiente de concentración y recogen como un dializado. Aunque este artículo se centra en el método de muestra de ISF en el cerebro, el principio y el método pueden aplicarse a otros órganos por la modificación apropiada si es necesario.
Microdiálisis primero fue empleado en la década de 1960 y desde entonces ha sido ampliamente utilizado para recoger pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores en el cerebro. Sin embargo, la reciente disponibilidad comercial de las sondas de microdiálisis con peso molecular alto cortar membranas (100 kDa 3 MDa) ha extendido su aplicación a las proteínas relativamente mayores en ISF así4,5,6 ,7. Los estudios de uso de estas sondas ha llevado a la conclusión que las proteínas como tau o α-sinucleína que durante mucho tiempo se pensó que exclusiva citoplásmico también son fisiológicamente presente en ISF4,5,8.
Una de las dificultades con sondas de microdiálisis de corte grandes membranas (normalmente más de 1.000 kDa) es que son más susceptibles a la pérdida de líquido de ultrafiltración debido a la presión interna acumulada en las puntas de prueba. Sondas de microdiálisis aquí tienen una estructura única para evitar este problema. La presión no se construirá debido a esta estructura, por lo tanto microdialysis con estas puntas de prueba debe ser operado en un modo de "push-pull" utilizando una bomba de jeringa para inundar las sondas (= empuje) y una bomba peristáltica/rodillo para recoger la venida del dializado de la salida de la sonda (= tirar) 9 (aunque necesita empujar y tirar bombas, debido a la cancelación de los orificios de ventilación en las puntas de prueba, la presión el sistema es técnicamente sólo impulsado por la bomba de extracción). Este artículo comienza con la cirugía estereotáctica de una implantación de cánula guía y describe cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger ISF a través de sondas de microdiálisis con 1.000 membranas de corte kDa.
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Protocol
Todos los estudios en animales fueron revisados y aprobados por el cuidado institucional de Animal y uso de la escuela graduada de medicina en la Universidad de Tokio.
1. pre-quirúrgico
- Antes de comenzar la cirugía, limpie todo con etanol al 70% para mantener las condiciones estériles. Se recomienda el apoyo térmico utilizando una almohadilla de calefacción.
- Anestesiar los ratones por inyección intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirmar anestesia realizando una pizca del dedo del pie. Se recomienda el uso de meloxicam SR en la inducción y la buprenorfina recuperación oferta durante al menos 24 h.
- Cepille el cabello con una recortadora quirúrgica. Fijar el ratón el ratón y el adaptador de rata neonatal utilizando barras de oídos y una pinza de nariz.
Nota: Es crítico para asegurarse de que cabeza de ratón está asegurada en esta etapa y no mueve de lado a lado. - Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
2. estereotáxicas cirugía para la implantación de cánula guía
- Configurar el ratón y la rata neonatal el adaptador sobre el aparato estereotáxicas. Hacer sagittally una incisión en la piel sobre el cráneo con un bisturí. Limpie la sangre y el tejido conectivo en el cráneo usando un hisopo de algodón húmedo.
- Determinar la coordenada de la región cerebral de interés utilizando atlas del cerebro. Antes de iniciar las mediciones, asegúrese de que esa línea media es recta de modo que el pedacito de taladro puede ser movido A P y en la sutura de la línea media todo el tiempo.
Nota: Este artículo utiliza la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,50 mm, D/V:-1,20 mm, 12 grados) a hipocampo posterior. - Nivel cráneo A-p
- Coloque un taladro en un manipulador de marco estereotáxicas. Baje la broca hasta que toque suavemente lambda y registrar sus coordenadas ventral. Repita este procedimiento para bregma.
Nota: Cuando se nivela el cráneo, la medida vertical de vértice es igual a la de lambda. Si no, ajustar en consecuencia la altura de la abrazadera de la nariz. Después de que el cráneo es nivelado, grabar la coordenada anterior/posterior, lateral de bregma.
- Coloque un taladro en un manipulador de marco estereotáxicas. Baje la broca hasta que toque suavemente lambda y registrar sus coordenadas ventral. Repita este procedimiento para bregma.
- Nivel cráneo de izquierda a derecha
- Mueva el taladro del vértice a la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L: +2,0 mm), bajar el taladro en el cráneo y grabar la coordenada vertical. Repita este procedimiento para la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,00 mm).
Nota: Si el cráneo está nivelado, estas mediciones verticales de dos puntos equidistantes de la línea media son iguales. Si no es así, ajuste la altura de las barras de oído.
- Mueva el taladro del vértice a la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L: +2,0 mm), bajar el taladro en el cráneo y grabar la coordenada vertical. Repita este procedimiento para la coordenada (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,00 mm).
- Perfore un agujero de burr cuidadosamente en las coordenadas de destino (A / P:-3,10 mm, M/L:-2,50 mm) implantar una cánula guía. Si el diámetro de un orificio de trépano no es lo suficientemente grande como para una implantación de cánula guía, perfore otro agujero que coincide con el primero. Perfore otro agujero en el hueso parietal derecho (lado contralateral) e inserte un tornillo de hueso, que ayuda a garantizar el cemento dental en 1.10 (ver figura 1B).
- Cortar una pieza cierre circular de la parte trasera de la tapa de un tubo de centrífuga de 1.5 mL por una cuchilla de afeitar y hacer una '' corona ''. Esta corona se utiliza para impedir la propagación a la piel de cemento dental. Colocar sobre el cráneo para que los agujeros de las rebabas en paso 2.5 mantenerse dentro del círculo (ver figura 1).
- Establecer una Asamblea estereotáctica por colocarle una cánula guía el brazo más corto de un adaptador estereotáxicas y fijarlo con una tuerca ciega. Coloque el brazo más largo del adaptador estereotáctica en la pinza de electrodo. Fije en el manipulador del aparato estereotáctica (ver figura 1A).
- Gire el conjunto de stereotax D-V en el brazo del manipulador por 12 grados (ver figura 1B). Hacia la cánula guía del orificio de trépano en 1.6. Inserte la cánula guía lentamente el cerebro mediante la reducción de 1,2 mm.
Nota: El ángulo de la sonda es específico al hipocampo; otras regiones pueden requerir otros ángulos o sin ángulo en todo. Consultar un atlas del cerebro de coordenadas precisas. Secar la superficie del cráneo, porque si no el cemento no se pegue y tapa de cemento puede desplazarse - Agregue el cemento dental dentro de la corona completamente cubrir tanto la parte metálica de la cánula de la guía y el tornillo del hueso suficiente para asegurarlos. Aplique cemento dental adicional si hay una parte de cráneo expuesta.
- Espere hasta que el cemento dental se seque totalmente (~ 12-20 min). Retire el adaptador estereotáctica de la abrazadera del electrodo. Retire la tuerca de la tapa y reemplace el adaptador estereotáxicas con un maniquí de prueba y sujetar la tuerca con sombrerete.
- Suelte el ratón del aparato estereotáxicas y casa el ratón solo en una jaula individual.
Nota: El ratón no se debe dejar desatendido hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Compruebe el ratón todos los días hasta el día de microdiálisis. El ratón recibe AINE como carprofen si parece que está en el dolor. Espera 2 semanas es necesaria para estudios de sueño y vigilia así el ratón habituates al nuevo ambiente10, pero otros tipos de estudios pueden requerir períodos de recuperación más cortos (por ejemplo, 1-2 días).
3. Microdialysis configuración
- Control de calidad de las puntas de prueba: Llene una jeringa desechable de 1ml con agua destilada waterand lo conecte a la salida (puerto menor) de una sonda con un tubo byton. Cubra los orificios de ventilación con los dedos y presione el émbolo de la jeringa suavemente para infundir el agua a la sonda. Compruebe que el agua aparece desde la entrada de la sonda y hay no hay fugas en la superficie de una membrana de microdiálisis.
- Activación de las sondas: sumerja las membranas de una sonda en etanol (70-100%) durante dos segundos. Luego, incorporar agua destilada en la sonda otra vez con una jeringa otra vez.
- Preparación de buffer de perfusión: con el fin de evitar la adherencia de moléculas Diana para los tubos, añadir BSA por diluir la solución de BSA de 30% al 4% con LCR artificial (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 , 122 m m NaCl, pH = 7.35), que parezca a concentración del electrólito en el LCR, inmediatamente antes del uso. El búfer de perfusión a través de una unidad de filtro de jeringa con 0.1 μm tamaño de poro del filtro.
Nota: 4% BSA mejora la recuperación para pegar proteínas pero puede limitar severamente la entrega de compuestos, especialmente para compuestos que tienen alta Unión a BSA. Esta es una de las ventajas de utilizar la menor concentración de BSA (como 0,15%) en algunos casos3. Tenga en cuenta que BSA puede Agregar muy fácilmente cuando agitado por vortex o remover la placa. Estos agregados pueden obstruir las sondas o los poros de la membrana. Tenga cuidado al preparar una solución de BSA para limitar esta agregación - Preparar dos líneas separadas de entrada y salida (ver figura 1) y conectar ambas líneas con una aguja de conexión. Llene una jeringa desechable de 3 mL con buffer de perfusión y conectar con el extremo de entrada de la tubería utilizando una aguja Roma-final. Llenar el tubo entero con tampón de perfusión mediante la ejecución de la bomba de jeringa.
- Parar la bomba de jeringa y vuelva a colocar la aguja de la conexión entre entrada y salida de línea con una sonda de microdiálisis activados en el paso 3.3 (ver figura 1). Antes de este reemplazo, coloque la tuerca de tapa en la punta de prueba.
- Monte el tubo del rodillo en el tubo de salida de la bomba de rodillo. Iniciar la bomba de la jeringuilla a 10 μl/min y luego la bomba de rodillos en el caudal un poco más lento (9,8 9,5 μl/min). Asegúrese de quitar todas las burbujas de aire en el tubo entero, que puede influir en la recuperación cuando introduce la sonda.
- Anestesiar el ratón de paso 1.12 de la misma manera como en el paso 1.2. Poner el collar de ratón alrededor de su cuello. Retire la tuerca de la tapa y la sonda dummy y lentamente Inserte una sonda de microdiálisis de 3.4 a través de la cánula guía y sujetar la tuerca con sombrerete.
- Lugar el ratón en la jaula conectada a un sistema de movimiento libre y traba el mouse con el collar. Mantener funcionando la bomba de jeringa y la bomba de rodillo el caudal indicado en el paso 3.5 para al menos 1 h.
Nota: Para conseguir la colección de ISF de animales despiertos, este artículo utiliza un sistema de movimiento libre, donde la jaula sí mismo responde al movimiento de un animal para mantener tubos de torsión. Alternativamente, líquidos giratorios disponibles de varias compañías pueden también ser utilizados. - Parada del rodillo de la bomba primero y luego la bomba de jeringa. Fijar el caudal deseado. Ejecute la jeringa bomba 20% más rápido que la bomba de rodillo.
Nota: por ejemplo, si ejecuta a 1 μl/min, funciona la bomba de jeringa en 1.2 μl/min caudal óptimo debe determinarse empíricamente para cada molécula. - Recoger muestras ISF: Coloque el extremo libre del tubo de salida en el colector de fracciones refrigerados.
Nota: Volumen de muestra apropiado varía en función de análisis utilizados para el análisis. - Después de la terminación del experimento, retire la sonda. (Anestesiar el ratón según sea necesario). Manejar recuperación de ratón al igual que en el paso 2.11. Análisis de la ISF recogida por métodos tales como HPLC o ELISA.
- Para lavar la tubería entera después de microdiálisis, conecte la entrada y tubos de salida otra vez mediante la sustitución de la sonda con la conexión de la aguja y ejecutan el blanqueador diluido en el tubo entero y luego lavarlo con agua. Seque y almacene para uso repetido.
Nota: Otros tipos de tuberías son aceptables, sin embargo, BSA en tampón de perfusión puede obstruir los tubos con pequeño diámetro, por lo tanto estos tubos se consideran como de un solo uso. Los tubos pueden ser usados o tapado después de múltiples usos, así que asegúrese de que el caudal es constante cada vez que lo use.
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Representative Results
Para estimular o inhibir la actividad neuronal en la microdiálisis reversa11,12,13, picrotoxin, antagonista de los receptores GABAA o tetrodotoxina, blocker del canal del Na+ se han utilizado. Se ha demostrado que liberación de tau es estimulada por el aumento de la actividad neuronal13,14. Consistente con estas observaciones anteriores, cuando 50 picrotoxin μm (PTX) fue administrado vía microdiálisis reversa (ver la discusión para más detalles) en ratones C57B6/J despiertos aumentaron tau endógena ISF niveles medidos por ELISA en comparación con el vehículo () control (DMSO) Figura 2).
Figura 1: configuración de la cirugía y la construcción de circuitos de microdiálisis. (A) establecer una Asamblea estereotáctica para una implantación de la guía mediante una tuerca, un adaptador estereotáxicas y una cánula guía. (B) cirugía estereotáctica para implantar una cánula guía. La cánula guía se inserta en el cerebro en 12 grados con respecto a la vertical. (C) construcción de una tubería de entrada y una tubería de salida. Línea de entrada consta de 70 cm FEP (JF-70) de la tubería y la tubería de salida consiste en JF-70 y el tubo y 1/2 de la tubería de FEP. Las agujas de conexión se utilizan para cada conexión. (D) una vez que el tubo entero se llena con tampón de perfusión, detenga la bomba y vuelva a colocar la aguja de la conexión entre entrada y salida de línea con una sonda de microdiálisis activado. Asegúrese de conectar el extremo del tubo de entrada al puerto de entrada de una sonda (puerto más largo) y conecte el extremo de la tubería de salida con orificio de salida de una sonda (puerto menor). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: datos representativos que muestran cambios de tau ISF en picrotoxin inversa microdialysis. Picrotoxin (PTX, 50 μm) o DMSO fueron entregados en el hipocampo de los ratones C57B6/J mediante microdiálisis reversa. Picrotoxin rápido aumento de los niveles de tau endógena ISF desde su nivel basal (es decir, las concentraciones promedio de tau durante 3 h antes de la administración de PTX) comparado con tratamiento de DMSO. Los datos se visualizan como ±SEM, n = 3 para DMSO, n = 4 para PTX. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Microdialysis con alto peso molecular cortado las membranas tiene que ser operado por un modo de vaivén, por lo tanto es fundamental que el caudal es constante y precisa. La inexactitud en las tasas de flujo puede ser la causa de la generación de burbujas de aire y la inconsistencia en la concentración de la muestra. Si el flujo es incompatible, verifique todas las conexiones de salida. Si el problema persiste, puede ser necesario volver a empezar con nuevas sondas y tubos.
Sondas Microdilaysis son continuamente inundadas por el buffer de perfusión. Por lo tanto, no hay tiempo suficiente para moléculas extracelulares llegar a un equilibrio completo en el búfer de perfusión. Como consecuencia, la concentración en el dializado es mucho menor que su concentración real en ISF. Para estimar la verdadera concentración de moléculas en ISF, un método de flujo cero es a menudo usado3,5,15. Este método mide la concentración mediante la alteración de la tasa de flujo. Hay una relación inversa entre la concentración y el caudal. Por lo tanto, la concentración de moléculas Diana puede determinarse extrapolando la curva exponencial a los teóricos de flujo cero, que representa la perfecta recuperación de las moléculas. Sin embargo, la recuperación puede verse afectada por diversos factores como la interacción con membranas o hidrofobicidad de las moléculas o interacción con otras proteínas, y se debe tener en cuenta que la concentración en el cero teórico puede no ser necesariamente equivalente a su verdadera concentración en ISF.
Una inserción de la sonda provoca lesiones locales agudas en cerebro. De esta razón, las primera varias fracciones típicamente están excluidas de su análisis posterior. De hecho, los niveles de la proteína tau ISF en hipocampo no son estables en la primera hora 9-15 probablemente debido a la lesión aguda provoca liberación inespecífica de tau en ISF (observación inédita del autor). Recuperación después de lesión de la inserción de sonda varía de blanco a blanco. Estudios piloto deben realizarse para determinar cuando cada objetivo alcanza un nivel de estado estacionario para determinar cuando las muestras deben ser analizadas. Esto determina el "punto inicial" para tomar muestras de microdiálisis. Un punto final para el muestreo es cuando el objetivo ya no está en el estado estacionario (típicamente 3-5 días después de la implantación de la sonda de microdiálisis; no guía de implantación). Inicio y final de cada destino deben determinarse empíricamente por cada laboratorio para cada destino.
Microdiálisis es especialmente útil cuando se combina con tratamiento farmacológico. Medicamentos pueden ser administrados sistémicamente o infundidos directamente en ISF. Microdiálisis reversa es un método que infunde directamente pequeños compuestos por medio de sondas. Diálisis se produce bidireccionalmente. Por lo tanto, inclusión de medicamentos en el búfer de perfusión permite su difusión aunque sondas de microdiálisis al tejido circundante. Este método permitió a la administración local de la pequeña colección compuesto y simultánea de ISF. Microdiálisis reversa es menos invasiva en comparación con una inyección de presión a través de la cánula y pueden mantener más constante la concentración de drogas en el área de la blanco.
Antes de comenzar la microdiálisis reversa, el volumen interno de la tubería entera debe tenerse en cuenta para calcular el tiempo de tratamiento y recogida de muestras. Por ejemplo, el volumen interno de la tubería entera en este artículo es 91.5 μl (consulte la Tabla de materiales para el volumen interno de cada tubo). Por lo tanto, cuando el caudal es 1,0 μL/min, lleva 91,5 min para el búfer de perfusión que contienen drogas para alcanzar el colector de fracciones. Por otro lado, cuando los medicamentos se entregan sistémicamente, se debe considerar el volumen interno de la tubería de salida (56,5 μL en este caso).
Método de microdiálisis in vivo ofrece varias ventajas sobre otras técnicas. Por ejemplo, mientras que los homogenados de cerebro probables consisten en proteínas extracelulares e intracelulares, microdialysis recoge específicamente proteínas extracelulares de ISF. En segundo lugar, una sonda de microdiálisis solo puede recoger ISF en los diferentes momentos del mismo animal. Concentración objetivo en cada muestra puede normalizarse a una línea base de %. Esto normaliza la concentración absoluta entre los animales por lo que se pueden comparar diferencias relativas. Esto aumenta el poder de un estudio y normalmente reduce el número de animales necesario para un experimento al comparar las diferencias relativas en los niveles de proteína después de la administración de drogas/manipulación. Por otro lado, la limitación principal de microdiálisis es la restricción del tamaño de la molécula objetivo.
Microdiálisis pueden combinarse con otras técnicas en vivo . Por ejemplo, efectuar microdialysis en ratones transgénicos regulables puede estimar en vivo volumen de destino proteína16. La combinación con la medición del EEG, fue utilizada para medir la actividad eléctrica durante la microdiálisis reversa11. Y manipulación de la actividad neuronal en el cerebro mientras que al mismo tiempo recoger ISF17optogenetics.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por '' subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (proteína cerebral envejecimiento y demencia Control)(15H01552) de MEXT y subvenciones para jóvenes científicos (B) (16K 20969). El autor agradece a Dr. David M. Holtzman y Dr. John R. Cirrito para el asesoramiento técnico durante el desarrollo de este método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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