Summary
In vivoマイクロダイアリシスが分子目を覚まし、自由行動下動物から脳間質液 (ISF) の現在のコレクションを有効にします。Isf 形式で比較的大きな分子を解析するために現在の記事は特にプローブを用いた膜切断高分子量マイクロダイアリシス プロトコルで説明します。
Abstract
In vivoマイクロダイアリシスは、透析の原理に基づく目を覚まし、自由行動下の動物から ISF を収集するために強力な手法です。最近も ISF プローブを用いた切断高分子量の大きい分子のダイナミクスを評価するために使用されていますマイクロダイアリシスは比較的低分子のアミノ酸や神経伝達物質などを測定する確立された方法が、膜。このようなプローブを使用すると、時にマイクロダイアリシス圧力プローブの中に蓄積を避けるためにプッシュプル ・ モードで実行するがあります。ステップバイ ステップ プロトコル定位手術、ISF から蛋白質を収集するマイクロダイアリシス ラインを設定する方法などを説明します。マイクロダイアリシス中、薬は全身か ISF に直接注入によって管理できます。逆マイクロダイアリシス、ISF に化合物を直接注入する手法です。マイクロダイアリシス灌流バッファーの薬剤の包含 ISF を同時に収集しながらプローブは、ISF に拡散することができます。例としてタウ蛋白を測定することによって、著者は、ピクロトキシンの逆マイクロダイアリシスによる刺激的な神経活動時にそのレベルを変更する方法を示しています。マイクロダイアリシスの利点と制限は、他の方法を組み合わせて、拡張アプリケーションと共に説明します。
Introduction
ISF 全脳容積の 15-20% とシグナル伝達、物質輸送、廃棄物のクリアランス1重要な微小環境を提供しています。したがって、生きている動物から ISF の収集能力は疾病メカニズムと同様、様々 な生物学的プロセスに重要なものを提供します。In vivoマイクロダイアリシス サンプルでは、いくつかの方法の 1 つと動物を自由に移動から目を覚まし、ISF から細胞外分子を定量化し、それにより神経科学研究フィールド2,3に有用なツールとして提供しています。この方法で半透膜にマイクロダイアリシス プローブを脳に挿入、比較的低流量灌流バッファーと潅流 (0.1-5 μ L/分)。この灌、isf 形式で細胞外の分子を受動的濃度勾配に従ってプローブに拡散し、透析液を収集します。この記事はサンプル脳内 ISF メソッドに焦点を当て、原則と方法の両方適用できます他の臓器に適切な変更が必要に応じて。
脳内アミノ酸や神経伝達物質を含む小分子を収集するために広く使用されていますし、マイクロダイアリシスには 1960 年代初頭に初めて採用されました。ただし、マイクロダイアリシス プローブ高分子膜 (100 kDa 3 MDa) を断つと、最近の商業的利用だけでなく、4、5,6 は isf 形式で比較的大きい蛋白質への応用が広がった、7。これらのプローブを用いた研究は、発見につながっているそのタンパク質タウや α-シヌクレインが長いと考えられていたなど排他的な細胞質が ISF4,5,8で生理学的存在も。
マイクロダイアリシス プローブを用いた大規模な遮断膜 (通常以上 1,000 kDa) 難しさの 1 つです、限外濾過流体損失蓄積プローブの内部圧力のために影響を受けやすい。ここマイクロダイアリシス プローブは、この問題を回避するユニークな構造を持っています。この構造のため、圧力構築されません、したがってマイクロダイアリシス プローブではシリンジ ポンプを使用して (= プッシュ) プローブとプローブ コンセントから透析液の到来を収集するローラー/ペリスタルティック ポンプを灌流する「プッシュプル」モードで操作されるべきです(= プル)9 (圧力通気孔、プローブの現在のキャンセルのため、プッシュとプルの両方のポンプが必要がありますがシステムが技術的にのみによって駆動されるプル ポンプ)。この記事はガイド カニューレ注入の定位手術で始まり、1,000 kDa カットオフ膜マイクロダイアリシス プローブを介して ISF を収集するためにマイクロダイアリシス線を設定する方法について説明します。
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Protocol
すべての動物の研究は、見直しされ、機関動物ケアと東京大学大学医学大学院の利用委員会によって承認されました。
1. 術前の手順
- 手術を開始する前にすべての無菌状態を維持するために 70% エタノールを拭いてください。加熱パッドを使用して熱のサポートをお勧めします。
- 抱水クロラール (400 mg/kg 腹腔内投与によるマウスを麻酔します。Anesthetization を確認するには、つま先のピンチを実行します。少なくとも 24 時間の誘導で復旧入札時にブプレノルフィン メロキシカム SR の使用をお勧めします。
- 手術のクリッパーで毛を剃る。マウスとラット新生児アダプター イヤバーと鼻のクランプを使用してマウスを修正します。
注: マウス頭がこの段階で保護され、サイド ・ バイ ・ サイドを移動しませんを確認する重要です。 - 麻酔中の乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。
2. 定位手術ガイド カニューレ注入用
- 脳定位固定装置のマウスおよびラットのアダプターを設定します。メスを使用して頭蓋骨に皮膚に大の切開を行います。血と湿った綿棒を使用して頭蓋骨の結合組織をふき取りなさい。
- 脳アトラスを使用して興味の脳の領域の座標を決定します。測定を開始する前に確認ドリル ビットをできるようにその正中線、直線 A P を移動、正中縫合上全体の時間に残ります。
注: この資料は、座標を使用 (A/p: M/l:-2.50 ミリメートル、D/v:-1.20 mm、12 度-3.10 mm) 後部海馬を対象とします。 - レベル スカル A P
- 脳定位固定装置のフレームのマニピュレーターにドリルを取り付けます。ラムダにやさしく触れるそれまでドリルを下げ、その腹側の座標を記録します。前にこの手順を繰り返します。
注: 頭蓋骨を平準化すると、前の垂直方向の測定がラムダのことと同じです。そうでない場合は、それに応じて鼻クランプの高さを調整します。頭蓋骨を取得します平準化後は、前の前方/後方、横の座標を記録します。
- 脳定位固定装置のフレームのマニピュレーターにドリルを取り付けます。ラムダにやさしく触れるそれまでドリルを下げ、その腹側の座標を記録します。前にこの手順を繰り返します。
- レベル頭蓋骨左右
- 前からドリルを座標に移動 (A/p:-3.10 mm、M/l: +2.0 mm)、頭蓋骨にドリルを削減し、垂直方向の座標を記録します。座標のこの手順を繰り返します (A/p:-3.10 mm、M/l:-2.00 mm)。
注: 頭蓋骨を平準化すると、正中線から 2 つの等距離ポイントのこれらの垂直メジャー値が等しいです。ない場合は、耳のバーの高さを調整します。
- 前からドリルを座標に移動 (A/p:-3.10 mm、M/l: +2.0 mm)、頭蓋骨にドリルを削減し、垂直方向の座標を記録します。座標のこの手順を繰り返します (A/p:-3.10 mm、M/l:-2.00 mm)。
- ターゲット座標を慎重にバリの穴をドリル (A/p:-3.10 mm、M/l:-2.50 mm) ガイド カニューレを移植します。場合バリの穴の直径は、ガイド カニューレ注入に対して十分な大きさは、最初の 1 つと重なる別の穴をドリルします。(側) の右頭頂骨で別の穴をドリルし、歯科用セメントの 1.10 (参照してください図 1 b) をセキュリティで保護するのに役立ちます骨ネジを挿入します。
- かみそりの刃で 1.5 mL 遠心管の蓋の裏側から円形のロック部分を切り取って、「王冠」を作る。このクラウンは歯科用セメントが皮膚に拡散するを防ぐためです。2.5 の手順で行ったバリの穴 (図 1参照) の円内に滞在するように頭蓋骨に配置します。
- 脳定位固定装置アダプターの短い腕にガイド カニューレを置くことによって脳定位固定装置アセンブリを設定し、キャップ ナットします。電極クランプの脳定位固定装置アダプターの長いアームを設定します。(参照してください図 1 a) 脳定位固定装置のマニピュレーターを添付します。
- 回転マニピュレーター アーム D V stereotax アセンブリ 12 度 (参照してください図 1 b)。ガイド カニューレを 1.6 で作られたバリの穴に移動します。1.2 mm に下げることによって、脳にゆっくりガイド カニューレを挿入します。
ノート: プローブの角度は、海馬。その他の地域は、すべての他の角度または角度を必要があります。正確な座標の脳アトラスを参照してください。頭蓋骨の表面を乾燥しないセメントは固執しないとセメントのキャップが外れとなってすることができる場合 - ガイド カニューレと十分なそれらを固定する骨ネジの両方の金属部分を完全にカバーするクラウン内歯科用セメントを追加します。頭蓋骨露出部がある場合は、その他の歯科用セメントを適用します。
- 歯科用セメントが完全に乾燥するまで待つ (12 ~ 20 分)。電極クランプから脳定位固定装置アダプターを削除します。キャップ ナットを削除し、脳定位固定装置アダプターを置き換えますダミー プローブ キャップ ナットを締めます。
- 脳定位固定装置からマウスを離すし、個々 のケージの中だけでマウスの家します。
注: マウス残さないように無人までそれは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻しました。マイクロダイアリシスの日まで毎日、マウスを確認します。マウスは、痛みになるある場合に、カルプロフェンなど NSAIDs を受け取ります。2 週間待っているは、マウスは、新しい環境の10、habituates が、研究の他のタイプより短い回復期間 (例えば1-2 日) がありますので睡眠研究に必要です。
3. マイクロダイアリシス セットアップ
- プローブの品質チェック: 塗りつぶし蒸留水を 1 ml の使い捨て注射器 byton チューブを使用してプローブのアウトレット (短いポート) に接続します。指で通気穴をカバーし、優しくプローブに水を注入するシリンジのプランジャーを押し下げます。プローブの口から水が表示されます、透析膜の表面に漏れがないことを確認します。
- プローブの活性化: 2 秒間のエタノール (70-100%) におけるプローブの膜が水没します。その後、蒸留水に吹き込むプローブ再び注射器で再び。
- 灌流バッファーの準備: ビデに標的分子の付着を避けるために追加で BSA (CaCl21.3 mM、1.2 mM MgSO4、3 mM KCl、0.4 mM KH2PO4、25 mM NaHCO3 人工髄液 4% に 30 %bsa 溶液を希釈すること、122 mM 塩化ナトリウム、pH = 7.35) を使用する前にすぐに脳脊髄液中の電解質濃度に密接に一致します。0.1 μ m の孔径のシリンジ フィルター ユニットを介して灌流バッファーをフィルター処理します。
注: 4 %bsa は付着蛋白質のための回復を向上しますが、高い BSA 結合を持つ化合物を特に化合物の配信を厳しく制限することができます。これは、特定のインスタンス3BSA (0.15%) などの低濃度の使用の利点の 1 つです。ボルテックスや攪拌プレートに心が乱れたとき BSA を非常に簡単に集計できることに注意してください。これらの凝集体は、プローブまたは膜毛穴を詰まらせることが。この集約を制限する BSA ソリューションを準備する際は注意が必要 - 入口と出口 (参照してください図 1) の 2 つの別々 の行を準備し、接続針で両方の線を接続します。灌流バッファーでいっぱい使い捨て 3 mL シリンジを入力し、鈍終りの針を使用して管の入口側と接続します。・ シリンジ ポンプを実行することにより灌流バッファー全体の管を記入してください。
- ・ シリンジ ポンプを停止、ステップ 3.3 (参照してください図 1) からアクティブ マイクロダイアリシス プローブで入口線とコンセントの線と接続針を置き換えます。この交換する前に、プローブ キャップ ナットを置きます。
- ローラー ポンプのアウトレット チューブでローラ チューブをマウントします。10 μ L/分でシリンジ ポンプと、わずかに遅い流量 (9.5 9.8 μ L/分) でローラー ポンプを起動します。プローブを入力するときに回復に影響を与える可能性があります全体のチューブのすべての空気の泡を削除することを確認します。
- ステップ 1.2 のように同じ方法でステップ 1.12 からマウスを麻酔します。その首にマウス首輪を置きます。キャップ ナットを取り外して、ダミー プローブ ガイド カニューレを通じて 3.4 からマイクロダイアリシス プローブを挿入し、ゆっくりとキャップ ナットを締めます。
- 場所ケージ内マウスは自由移動システムとテザーの襟付きマウスに接続されています。少なくとも 1 時間 3.5 ステップで指定された流量で、シリンジ ポンプ、ローラー ポンプを実行し続けます。
注: 目がさめている動物から ISF コレクションを達成するためにこの記事を使用して自由移動システムでは、ケージ自体がチューブのねじれを防ぐために動物の動きに応答します。また、液体スイベル様々 な会社から入手可能を使用してすることができますも。 - ローラー ポンプ最初停止し、シリンジ ポンプ。所望の流量を設定します。シリンジ ポンプ 20% ローラー ポンプよりも高速を実行します。
注: 例えば、1 μ L/分の場合は、シリンジ ポンプで稼動 1.2 μ L/分最適な流量、各分子の経験的に決定する必要があります。 - ISF サンプルの収集: 冷蔵分数コレクター アウトレット チューブの無料の端を置きます。
注: 適切な試料量は分析用の試金によって異なります。 - 実験終了後に、プローブを削除します。(マウスを麻酔必要に応じて) マウスの回復ステップ 2.11 のように同じ方法で処理します。高速液体クロマトグラフィーや elisa 法などの方法によって収集された ISF を分析します。
- マイクロダイアリシス後全体のチューブを洗浄するには、入口を接続し、プローブを接続に置き換えることによって再びアウトレット チューブ針全体のチューブで薄めた漂白剤を実行し、水で洗い流し。乾燥し、繰り返し使用できるように保存します。
注: 他の種類のチューブが許容、しかし、灌流バッファーの BSA は細径チューブを詰まらせることが、こうしてこれらのチューブは単回使用として考慮されます。ビデは着用することができます。 または複数使用した後に目詰まりので流量の一貫性のある時間は、使用する前にすべての時間を確認してください。
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Representative Results
刺激または逆マイクロダイアリシス11,12,13ピクロトキシン、ギャバA受容体拮抗薬またはテトロドトキシンで神経細胞の活動を阻害する、+の Na チャンネル遮断薬が使用されています。タウのリリースは神経活動13,14の増加によって刺激されることが示されています。これらの一貫性のある前の観察、50 μ M ピクロトキシン (PTX) は目がさめている C57B6/J マウスにおける逆マイクロダイアリシス (詳細については、の説明を参照) によって投与した場合増加 elisa 法により測定のレベルに比べて車両コントロール (DMSO) (ISF 内因性タウ図 2)。
図 1: 手術のセットアップ、透析回路の構築。(A)キャップ ナット、脳定位固定装置アダプター ガイド カニューレを使用してガイド注入用脳定位固定装置アセンブリを設定します。(B)定位手術ガイド カニューレを移植します。脳内の 12 ° 垂直ガイド カニューレが挿入されます。(C)入口管と出口管の建設。入口行 70 cm FEP チューブ (ユニデン-70) から成り、アウトレット ラインは JF 70 とローラ チューブ FEP チューブの 1/2 で構成されています。接続針は、各接続に使用されます。(D)全体のチューブは、循環バッファーでいっぱいです、一度ポンプを停止し、活性マイクロダイアリシス プローブで入口線とコンセントの線と接続針を置き換えます。インレット チューブの端をプローブ (長いポート) の入口ポートに接続し、プローブ (短いポート) の出口と出口管の端を接続してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ピクロトキシンに ISF トー変化を示す代表的なデータを逆にマイクロダイアリシス。ピクロトキシン (PTX は、50 μ M) DMSO は逆マイクロダイアリシスを介して C57B6/J マウスの海馬に渡されたまたは。ピクロトキシン急増その基底レベルから ISF 内因性タウ蛋白質レベル (すなわち、 PTX 投与前に 3 h の間に平均 tau 濃度) dmso と比較して。Mean±SEM、n としてデータを示す dmso、3 を = n = PTX のための 4。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
透析膜を切断高分子量がプッシュプル ・ モードで作動する、従ってそれは流量が正確で一定であることが重要。流量の不正確さは、空気バブル世代とサンプル濃度の矛盾の原因をすることができます。流れに整合性がない場合は、漏洩のすべての接続を確認します。問題が引き続き発生する場合は、新しいプローブとチューブを再開始する必要があります。
Microdilaysis プローブは、継続的に灌流バッファーによって灌流します。そのため、灌流バッファー内における平衡に到達する細胞外の分子のための十分な時間がないです。その結果、透析液の濃度は isf 形式で、実際の濃度よりはるかに低いです。Isf 形式で分子の真の濃度を推定するためにゼロのフロー法は頻繁に使用される3,5,15です。このメソッドは、流量を変更することにより濃度を測定します。濃度と流量の間に反比例の関係があります。したがって、ターゲット分子の濃度は、分子の完全な回復を表してゼロのフロー理論に戻る指数曲線を外挿するによって決定することができます。しかし、回復は、膜や分子の疎水性との相互作用や他の蛋白質との相互作用などの様々 な要因によって影響される可能性が、1 つ留意すべき理論ゼロで濃度が必ずしもできない場合があります。isf 形式でその真の濃度に相当します。
プローブの挿入は、脳の急性ローカル損傷を引き起こします。この理由から最初のいくつかの画分は通常さらに分析から除外されます。実際には、海馬の ISF タウ蛋白質のレベルは急性障害が ISF (作者の未発表観測) にタウの非固有のリリースを引き起こすため可能性が高い最初の 9-15 時間で安定ではありません。プローブ挿入損傷後の回復は、ターゲットに異なります。各ターゲットのサンプルは分析されるべきときを決定する定常状態レベルに到達したときに判断するパイロット試験を行わなければなりません。これはマイクロダイアリシス サンプリングの「スタート ポイント」を決定します。サンプリングのエンドポイントは、ターゲットはもはや定常状態 (マイクロダイアリシス プローブ注入後通常 3-5 日; ガイド注入しない) です。開始と終了の各ターゲットは、ターゲットごとに各研究室に経験的に定められるべきであります。
マイクロダイアリシスは薬物治療と組み合わせると特に役立ちます。薬は全身投与または ISF に直接注入することができます。逆マイクロダイアリシス プローブを介して小さな化合物を直接注ぎ込む方法の 1 つであります。透析は双方向に発生します。したがって、灌流バッファーの薬剤の包含はマイクロダイアリシス プローブを周囲の組織にもその普及することができます。このメソッドには、ISF の小さな化合物と同時のコレクションのローカル管理が有効になります。逆マイクロダイアリシス カニューレを介して圧力注入に比べて低侵襲で、ターゲット領域における医薬品の一定濃度を維持することができます。
逆透析を開始する前に全体の管の内部のボリュームの治療およびサンプル コレクションのタイミングの計算に考慮に入れ必要があります。たとえば、この記事で使用される全体の管の内部のボリュームは 91.5 μ L (各チューブの内部のボリュームの材料表参照) です。したがって、流量が 1.0 μ L/分の場合、分数コレクターに到達する薬物を含む血流バッファーの 91.5 分をかかります。その一方で、薬が全身に配信されるとき、アウトレット チューブ (この場合は 56.5 μ L) の積を考慮必要があります。
In vivoマイクロダイアリシス法では、他の方式に比べていくつかの利点を提供しています。たとえば、脳ホモジネートの可能性が高いから成る細胞外および細胞内蛋白質、マイクロダイアリシス具体的収集細胞外タンパク質 ISF から。第二に、単一マイクロダイアリシス プローブは、同じ動物から、異なる時点で ISF を収集できます。各サンプルのターゲット濃度は、% 基準に正規化することができます。これは動物の相対的な違いを比較できるようにとの間の絶対濃度を正規化します。これは研究の力を高め、通常次の薬物管理/操作タンパク質レベルの相対的な違いを比較するときに実験に必要な動物の数が減る。その一方で、マイクロダイアリシスの主要な制限は、標的分子のサイズの制限です。
マイクロダイアリシスは、他の体内の手法と組み合わせることができます。たとえば、「恒常トランスジェニック マウスにおけるマイクロダイアリシスを実行するターゲット蛋白質16の生体内での売り上げ高を見積もることができます。,脳波測定との組み合わせは、逆マイクロダイアリシス11時に電気的活動を測定する使用されました。オプトジェネティクス ISF17を同時に収集しながら脳内神経活動の操作を有効にします。
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Disclosures
著者は、何を開示します。
Acknowledgments
この作業によって支えられた「新学術研究領域 (脳タンパク質老化と認知症 Control)(15H01552) 文部科学省科研費若手研究 (B) (16 K 20969) から。このメソッドの開発中に技術的なアドバイスを著者ありがとう博士デビッド ・ m ・ ホルツマンと博士ジョン ・ r ・ Cirrito
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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