Summary
En i situ hybridisering (ISH) protokol, der bruger korte antisense oligonukleotider til at registrere alternative pre-mRNA splejsning mønstre i mus hjernen sektioner er beskrevet.
Abstract
Alternative splejsning (AS) forekommer hos mere end 90% af menneskelige gener. Udtryk mønster af et alternativt splejset exon er ofte reguleret i en celle typespecifikke mode. SOM udtryk mønstre analyseres typisk af RT-PCR og RNA-seq ved hjælp af RNA prøver isoleret fra en population af celler. Kan foretages i situ undersøgelse af som udtryk mønstre for et bestemt biologiske struktur af RNA i situ hybridisering (ISH) ved hjælp af exon-specifikke prober. Men denne særlige brug af ISH har været begrænset, fordi alternative exons er generelt alt for korte til at designe exon-specifikke prober. I denne betænkning er brugen af BaseScope, en nyligt udviklede teknologi, der beskæftiger kort antisense oligonukleotider i RNA ISH, beskrevet at analysere som udtryk mønstre i mus hjernen sektioner. Exon 23a af neurofibromatosis type 1 (Nf1) bruges som et eksempel til at illustrere, at korte exon-exon afkørsel sonder udviser robust hybridisering signaler med høj specificitet i RNA ISH analyse på musen hjernen sektioner. Endnu vigtigere, kan signaler registreret med exon inklusion og overspringelse specifikke sonder bruges til at pålideligt beregne procent splejset i værdier af Nf1 exon 23a udtryk i forskellige anatomiske områder af en mus hjerne. Forsøgsplan og beregningsmetode for som analyse præsenteres. Resultaterne viser, at BaseScope giver en kraftfuld ny værktøj til at vurdere som udtryk mønstre i situ.
Introduction
Alternative splejsning (AS) er en fælles proces, der opstår under pre-mRNA modning. I denne proces, kan en exon medtages varierende i modent mRNA. Således, gennem AS, ét gen kan generere mange mRNAs at kode for forskellige proteinprodukter. Det anslås, at 92 – 94% af menneskelige gener gennemgår alternative splejsning1,2. Unormal alternativ splicing mønstre skyldes genetiske mutationer har været knyttet til en lang række sygdomme, herunder Amyotrofisk lateral sklerose, født dystrofi og kræft3,4. Det er således vigtigt at undersøge og bedre at forstå alternative splejsning reguleringsmekanismer i et forsøg på at finde nye behandlinger af sygdomme hos mennesker.
SOM ofte er reguleret i en celle typespecifikke mode. Det er vigtigt at fastlægge AS udtryk mønster af et specifikt gen i et givet biologisk system. Men dette bliver kompliceret, når et komplekst organ, der indeholder mange forskellige typer af celler, som hjernen eller hjertet, er undersøgt. I dette tilfælde er et ideelt valg af assay system RNA i situ hybridisering (ISH) ved hjælp af væv sektioner så AS udtryk mønster af et specifikt gen kan påvises i mange celletyper samtidigt. Faktisk, exon-specifikke sonder har anvendt til at vurdere udtryk niveauer af en alternativ exon5,6,7. Dog, denne fremgangsmåde er ikke velegnet til som mønster analyse af følgende grunde. Første, konventionelle ISH metoder normalt bruge sonder længere end 300 bp, mens den gennemsnitlige størrelse af hvirveldyr interne exons (ikke første eller sidste exon) er 170 nukleotider8,9. For det andet, når en exon-specifikke sonde bruges til at undersøge det splejsning mønster af en indre alternative exon, den eneste mRNA isoform opdaget af sonden er den, der indeholder exon, mens mRNA isoform uden exon ikke kan påvises. Beregning af den procentvise splejset (PSI) værdi for den alternative exon er således kompliceret. Derudover kombinerer konventionelle fluorescerende ISH ofte ISH med immunfarvning, hvilket reducerer opdagelse effektivitet og robusthed. For eksempel i en undersøgelse, som undersøgte stress-induceret splejsning isoform skift af acetylcholinesterase (AChE) mRNA, digoxigenin blev indarbejdet i ISH sonden og påvises ved hjælp af anti-digoxigenin antistof. Alternativt, biotin-mærket sonde blev opdaget af en basisk fosfatase/streptavidin konjugat og et substrat for basisk fosfatase10. Hverken metode bruger enhver forstærkning strategi til at øge følsomheden af påvisning. Som et resultat, er det udfordrende for at opdage mRNA udskrifter, der er udtrykt på et lavt niveau. Således, en enklere og mere robust ISH assay system er nødvendig for at analysere som udtryk mønstre i situ.
BaseScope blev for nylig udviklet baseret på platformen af RNAscope, en veletableret og udbredt ISH assay system. Begge assay systemer anvender en target-specifikke forstærkning teknologi, der øger følsomheden af påvisning11,12. Hvad adskiller en fra den anden er længden af target sekvens, som er så korte som 50 nukleotider for BaseScope og 300 – 1.000 nucleotider for RNAscope. Det er således muligt at design sonder, der er målrettet exon-exon kryds til at registrere specifikke alternativ mRNA isoformer. I den aktuelle undersøgelse, blev en procedure etableret for at undersøge som udtryk mønstre af neurofibromatosis type 1 (Nf1) exon 23a, en alternativ exon grundigt undersøgt i samme laboratorium13,14,15 , 16 , 17, i mus hjernen sektioner. Resultaterne viser, at BaseScope er et ideelt system til at studere udtryk mønstre af Nf1 exon 23a in situ. Da denne analyse system kan tilpasses til at analysere som udtryk mønstre af mange alternative exons, repræsenterer det en kraftfulde nye redskab i undersøgelser af AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg beskrives her, der involverer mus er blevet godkendt af Case Western Reserve University institutionelle Animal Care og brug udvalget. Titlen på protokollen 2016-0068 (PI: Hua Lou) er "Rolle alternative pre-mRNA-splicing i hvirveldyr udvikling".
Bemærk: Oplysninger om alle de udstyr, reagenser og forsyninger, der anvendes i denne protokol er inkluderet i Tabellen af materialer.
1. Forbered Formalin fast Paraffin indlejret (FFPE) afsnit
-
Aflive 1 CD1 musen og 1 C57BL/6J af cervikal dislokation. Forsigtigt skære åbne kraniet med kirurgisk saks og pincet. Fjerne hjernen med en skovl.
Bemærk: 5-måned-forhenværende CD1 mandlige mus og 3-måned-forhenværende C57BL/6J mandlige mus blev brugt og viste lignende resultater.- Vask hjernen med PBS. Løs hele hjernen med en opløsning indeholdende 10% formalin ved stuetemperatur (RT) for 30 h ved at sætte hele hjernen i 50 mL af formalin.
- Ændre den fastsættelse løsning til PBS og inkuberes hjernen i PBS natten over ved 4 ° C. Dehydrere og integrere hjernen med xylen og paraffin ved hjælp af standardprocedurer18.
-
Brug en mikrotom til at skære indlejrede væv i 5 µm sektioner. Sætte paraffin båndet i vandbad RT, første, og derefter i en 45 ° C vandbad til at sprede båndet.
- Når rynker og folder i båndet forsvinder, umiddelbart montere sektioner på glas dias. Luft tørre dias overnatning på RT. bages dias i 1 timer ved 60 ° C før brug.
2. prøven forbehandling
-
Deparaffinize væv sektioner. Udføre disse trin i et stinkskab.
- Fylde to vaske op (figur 1A) med 250 mL frisk xylen og to med 250 mL 100% ethanol. Indsæt væv dias i en vask rack (figur 1A) og sted vask rack i vaske op efter ordre og inkubering tiden angivet i tabel 1.
- Under hver inkubation, løfte vask rack op og ned mere end 3 gange i vask skål. Efter hver inkubation, flytte hurtigt vask rack i den næste vask skål at forhindre afsnittene væv fra udtørring.
- Efter endt inkubation trin, skal du fjerne vask rack med dias fra vask skål. Placer rack i en 60 ° C inkubator i 5 min eller indtil slides er helt tørre.
- Tegne en 0,75 '' x 0,75 '' barriere omkring afsnittet væv med en hydrofobe barriere pen. Luft tørre barriere for 3 min på RT.
-
Forbehandle skiver
- Forberede reagenser og udstyr
- Tænd hybridisering ovn (figur 1B) og Indstil temperaturen til 40 ° C 30 min før brug.
- Våd den befugtning papir (figur 1E) med destilleret vand helt og sætte det i fugtighed kontrol bakke (figur 1 d, venstre). Holde fugt kontrol bakke i hybridisering ovn.
- Forbered 700 mL frisk 1 x mål hentning reagenser ved at tilføje 630 mL af dH2O til 70 mL 10 x mål hentning reagenser.
- Anvende hydrogenperoxid.
- Sætte deparaffinized dias på bænken. Tilføj 5-8 dråber af hydrogenperoxid til en sektion til helt dække vævet. Der inkuberes i 10 min. ved RT.
- Tryk på dias på et stykke absorberende papir til at fjerne opløsningen af hydrogenperoxid, ét dias ad gangen. Straks indsætte diaset i et rack, vask og flytte rack til en vask skål fyldt med dH2O.
- Vaske dias ved at flytte rack op og ned i destilleret vand i 3-5 gange. Flytte vask rack til en vask skål fyldt med frisk destilleret vand og vask dias en gang mere.
- Udføre mål hentning
- Placer en 1.000 mL glas bægerglas på en varm tallerken. Tilføje 700 mL frisk 1 x mål hentning reagenser i bægerglasset og dække det med folie. Indsæt et termometer i bægerglasset gennem dækslet folie (figur 1 c). Tænd varmepladen, og Indstil høje for 10-15 min.
- Når temperaturen af hentning reagenser når 98 ° C, skifte temperaturstyring af varmepladen fra høj til lav for at opretholde en mild kog. Ikke koge mere end 15 min.
- I mellemtiden, omhyggeligt åbne folien og sætte vask rack med skiver inde hentning regent. Bægerglasset dækkes igen og der inkuberes i 15 min.
- Brug pincet til at fjerne rack fra bægerglasset til en vask skål fyldt med 200 mL af dH2O og skyl til 15 s.
- Flytte rack til en vask skål indeholdende 100% frisk ethanol og lad sidde til 3 min. Fjern dias og tør dem i et 60 ° C inkubator i 10 min.
- Anvende Protease III
- Objektglassene på pletten rack (figur 1 d, højre). Tilsættes 5 dråber af Protease III til at dække vævet. Omhyggeligt lagt rack i bakken fugtighed kontrol (figur 1 d, venstre) og Indsæt skuffen i 40 ° C hybridisering ovn. Inkuber i 30 min.
- Fjern dias rack og sæt bakken tilbage i ovnen. Tryk på dias for at fjerne den overskydende væske, ét dias ad gangen. Indsætte diaset i en vask rack og sted rack i en vask skål fyldt med dH2O. flytte rack op og ned for at vaske dias for 3 - 5 gange.
- Forberede reagenser og udstyr
3. ISH Assay
-
Forberede materialer
- Pre varm 50 x vaskebuffer i en 40 ° C inkubator for 20 min. Bland 2.94 L dH2O og 60 mL 50 x vaskebuffer at gøre 1 x vaskebuffer.
- Forberede 50% hæmatoxylin Farvningsopløsningen ved tilsætning af 100 mL af Gills hæmatoxylin I til 100 mL med dH2O. Forbered 0,02% (w/v) ammoniak vand ved at tilføje 1,43 mL 1 N ammoniumhydroxid til 250 mL af dH2O. Mix godt i en container.
- Sætte sonder og AMP 0 – 6 reagenser RT 30 min. før brug. Holde fugt kontrol bakke i 40 ° C hybridisering ovn.
-
ISH procedure
Bemærk: For at undersøge udtrykket af Nf1 splejsning isoformer og beregne procent splejset (PSI) værdi for exon 23a, tre forskellige ISH sonder, der er målrettet exon 23a-inkluderet isoform, exon 23a-udelukket isoform eller begge isoformer er brugt (figur 2 ). Sonderne anvendes på adjacently cut væv sektioner. For at sikre nøjagtigheden af beregningen, er det afgørende, at de tre væv afsnit behandles nøjagtigt det samme i hybridisering, forstærkning og signal detection trin.- Sonde hybridisering.
- Fjern dias fra vask rack og tryk det overskydende væske fra dias. Objektglassene i pletten rack.
- Brug en blyant til at mærke diasene med navnet sonde. Sætte de tre adjacently cut hjernen væv dias at være hybridiseret med tre forskellige Nf1 sonder (figur 2) sammen. Udføre de efterfølgende trin i den samme rækkefølge af dias.
- Tilsæt 4 dråber af sonde til at dække vævet. Gøre denne ét dias ad gangen for at forhindre afsnittene fra udtørring. Placere pletten rack i bakken fugtighed kontrol og indsætte det i 40 ºC ovn i 2 timer.
- Vask dias to gange med vask buffer. For hver vask, fylde farvning fadet med 200 mL af 1 x vaskebuffer og placere en vask rack i det. Tryk på overskydende væske på et papir håndklæde ét dias ad gangen og hurtigt indsætte det i vask rack. Flytte diaset rack op og ned i skålen for 3-5 gange i 2 min på RT.
- For det andet vask, bruge friske wash buffer.
- Signal forstærkning.
- Tryk på den overskydende vaskebuffer fra dias og placere dem i pletten rack. Tilsæt 4 dråber af AMP 0 til at dække vævet. Placere pletten rack i bakken fugtighed kontrol og sæt det i ovnen i 30 min. ved 40 ° C.
- Vask dias to gange med vask buffer som beskrevet ovenfor.
- Gentag dette trin med AMP 1 – 6 efter ordre og betingelse i tabel 2. Vask dias to gange efter hver hybridisering trin.
- Signal Detection
- Tryk på den overskydende vaskebuffer fra dias og placere dem i pletten rack. Tilføje 2 µL af hurtigt røde B til 120 µL af hurtigt Red en (1:60 ratio) i et microcentrifuge rør. Bland godt og tilføje at fuldt ud dække afsnittet væv.
Bemærk: Det samlede volumen af røde A / B mix er baseret på antallet og størrelsen af væv sektioner. For en 0,75 '' x 0,75 '' område er 120 µL nok for et afsnit. Brug blandingen i 5 min og undgå eksponering af mix for direkte sollys eller UV-lys. - Luk skuffen og inkuberes i 10 min. ved RT. Fjern løsning til en spildbakken og straks indsætte dias i et rack, vask og placere rack i en vask skål fyldt med vand fra hanen. Skyl igen med frisk vand fra hanen.
- Tryk på den overskydende vaskebuffer fra dias og placere dem i pletten rack. Tilføje 2 µL af hurtigt røde B til 120 µL af hurtigt Red en (1:60 ratio) i et microcentrifuge rør. Bland godt og tilføje at fuldt ud dække afsnittet væv.
- Sonde hybridisering.
-
Counterstaining af dias
- Fjerne vask rack fra vand fra hanen, og hurtigt tryk på absorberende papir til at fjerne ekstra vand. Sætte rack i en 50% hæmatoxylin farvning løsning og straks flytte rack op og ned flere gange. Der inkuberes i 2 min på RT.
- Overføre dias rack tilbage i vand fra hanen parabol. Vask 3 – 5 gange ved at flytte rack op og ned og ændre frisk vand fra hanen, indtil diasene bliver klar, mens hjernen væv forbliver lilla.
- Flytte rack til en parabol, der indeholder 0,02% ammoniak vand. Flytte rack op og ned 2 – 3 gange, indtil væv blaat. Vask dias 3 – 5 gange med frisk vand fra hanen i en farvnings-fad.
-
Montering af prøverne
- Flytte diaset rack fra farvning skålen til en 60 ° C inkubator og Inkuber i mindst 15 min. indtil slides er helt tørre.
- Sted 40 µL af montering medium på diaset og omhyggeligt placere en 24 mm x 50 mm coverslip over afsnittet væv. Luft tørre dias i 30 min på RT.
4. dataindsamling og analyse
Bemærk: Brug et dias scanner til at scanne billeder på 40 X forstørrelse.
-
Positive og negative kontroller
- For hvert forsøg omfatte positive og negative kontroller (figur 3). Som en god positiv kontrol, bør signal ses som punktformet prikker på 20-40 X forstørrelse.
- Brug musen (Mm) - PPIB - 1ZZ som positiv kontrol. Denne sonde er rettet mod en fælles husholdning gen PPIB. For negativ kontrol er en prik til hver 20 celler viser baggrunden farvning pr. 20 X mikroskopfelt acceptabel.
- Bruge DapB-1ZZ sonde som en negativ kontrol. Denne sonde mål bakterielt gen dapB. Disse kontrol sonder har været brugt i mange ISH assays19.
-
Signal detektion og analyse af som udtryk mønstre af Nf1 exon 23a
- Som hybridisering signaler er angivet som punktformet prikker, tælle prikker manuelt. Antallet af prikker er korreleret med de afskrifter, der registreres af en bestemt probe. Bemærk, at antallet af prikker kan også analyseres af ImageJ eller SpotStudio software.
- Brug tre sonder til at krydse til exon 23a-holdige, exon 23a-mangler isoformer eller samlede Nf1 udskrifter (figur 2). Som de tre sonder ikke kan bruges samtidig, skal du bruge tre tilstødende hjernens væv sektioner til at krydse sig til hver enkelt sonde.
- For at beregne procent splejset i (PSI) til exon 23a, tælle antallet af celler og prikker i flere områder af hjernen. For hvert område af interesse, tælle mere end 400 celler fra flere sub-regioner som angivet i figur 4.
- Indsamle data fra de samme subregioner for hver af de tre sonder. Beregne PSI som antallet af prikker per celle med exon 23a optagelse probe / (antallet af prikker per celle med exon 23a optagelse sonde + antal dot pr. celle med exon23a springe sonde) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BaseScope ISH blev udført ved hjælp af tre mus stammer: CD1 vildtype mus, C57BL/6J vildtype mus og Nf123aIN/23aIN mutant mus i C57BL/6J baggrund, i hvilke exon 23a er inkluderet i alle celletyper som følge af manipuleret splejsning websted mutationer14,15.
Som et første skridt, ISH assay system blev testet ved hjælp af virksomheden leveret reagenser: dias, der har 3T3 celler, og negative og positive ISH sonder. Som vist i figur 3, blev ingen signal opdaget da negative kontrol sonden blev brugt, mens mange punktformet prikker blev opdaget da positive kontrol sonden blev anvendt.
Næste, ISH blev udført ved hjælp af musen hjernen sektioner og Nf1-specifikke sonder, der er designet til at opdage Nf1 afskrifter, der indeholder exon 23a, springe exon 23a eller begge isoformer (figur 2). Disse prober rettet mod specifikke exon-exon vejkryds. To hjerneregioner blev udvalgt til at undersøge AS udtryk mønster af Nf1 exon 23a: cortex og hippocampus CA3 (figur 4). For hver region, tæller tre sub-regioner, som angivet i figur 4, registrering af både celle og dot numre. For hver region, var ca. 400 celler tælles i alt og bruges til at beregne prikker/celle forholdet. AS udtryk mønster for Nf1 exon 23a beregnes som PSI.
ISH signaler opnået med de tre Nf1 sonder i cortex og hippocampus CD1 mus er vist i figur 5A-5F og tabel 3. Regionen cortex fra C57BL/6J Nf1+/ + og Nf123aIN/23aIN mus blev også analyseret (figur 6).
Resultatet af disse eksperimenter førte til adskillige konklusioner. Første, summen af signaler, vist som prikker/celle, detekteres af exon 23a integration-specifikke og overspringelse-specifikke sonder er lig med at der er registreret af sonden hybridizing til begge isoformer (tabel 3), hvilket tyder på, at de tre sonder hybridiseret med Nf1 udskrifter med samme effektivitet. For det andet er PSI værdien af exon 23a i cortex, 10%, i overensstemmelse med tidligere rapporteret RT-PCR resultatet, hvor cortex blev dissekeret fra voksne C57BL/6J mus hjerne efterfulgt af total RNA isolering og RT-PCR analyse14,15. Dette resultat tyder på at BaseScope ISH kan bruges til kvantitativt analysere som udtryk mønstre ud over udskrift niveauer i væv sektioner. For det tredje, de opnåede resultater med Nf123aIN/23aIN mutant hjernen væv, som indeholder alle af Nf1 udskrifter exon 23a14,15, viste lignende niveauer af signaler når integration-specifikke og Nf1 samlede sonder blev brugt og ingen signal når springe-specifikke sonde blev brugt (figur 6), der angiver, at de to sonder målretning exon integration eller springe er meget specifikke.
Figur 1: udstyr, der anvendes i ISH. (A) vask skål og vask rack. (B) hybridisering ovn. (C) målrette hentning bægerglas og varmeplade sæt. (D) fugtighed kontrol bakke og plette rack. (E) befugtning papir angivet med en rød pilespids inside fugt kontrol bakke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sonder anvendes til at påvise Nf1 exon 23a som udtryk mønstre. Alle sonderne indeholder en ZZ par oligonukleotid. Integration-specifikke sonden (rød) mål krydset af exons 23a og 24, spring-specifikke sonde (grøn) er rettet mod krydset af exons 23 og 24, og Nf1 samlede sonden (blå) mål krydset af exons 26 og 27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: ISH bruger negativ (A-B) og positiv (C-D) kontrol af 3T3 celler. En kontrol dias 3T3 celler blev behandlet gennem trin 2 (prøve forbehandling) og 3 (ISH procedure) i protokollen. Positive signaler er vist som rød punktformet prikker angivet med røde pile. B og D er zoomet i billeder af A og C, henholdsvis. Skalalinjen = 20 µm (A og C); 5 µm (B og D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: billede af en mus hjernen koronale sektion. De røde felter angiver områder valgt til optælling af celle og signal numre i cortex og hippocampus CA3 regioner. Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: RNA ISH signaler registreret bruger Nf1-specifikke sonder og mus hjerne sektioner. CD1 hjerner blev behandlet gennem trinene 1-4 i protokollen. Røde punktformet prikker angiver positive signaler, når de tre Nf1-specifikke sonder (vist i figur 3) anvendes. Cortex (A-C) og hippocampus (D-F) er vist. NF1 samlede sonde blev brugt i A og D, inklusion-specifikke sonden i B og E, og springe-specifikke sonden i C og F. skala bar = 40 µm (A-C); 400 µm (D-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: RNA ISH signaler registreret i Nf1+/ + og Nf123aIN/23aIN hjerne sektioner. Både mus stammer er i C57BL/6J baggrund. Hjerner blev behandlet gennem trinene 1-4 i protokollen. A-C. Nf1+/ + cortex. D-F. Nf123aIN/23aIN cortex. Nf1 samlede sonde blev brugt i A og D, inklusion-specifikke sonden i B og E, og springe-specifikke sonden i C og F. skala bar = 40 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Rækkefølgen af inkubation | Kemikalier i TT parabol | Tid |
| 1 | 250 mL xylen | 5 min |
| 2 | 250 mL xylen | 5 min |
| 3 | 250 mL 100% ethanol | 2 min |
| 4 | 250 mL 100% ethanol | 2 min |
Tabel 1: Inkubation procedure af trin 2.1.1.
| AMP løsning | Inkubationstiden | Inkubation temperatur |
| AMP 1 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 5-RØD | 30 min | Stuetemperatur |
| AMP 6-RØD | 15 min | Stuetemperatur |
Tabel 2: Signal forstærkning procedure af trin 3.2.2.
| Regionen | springe | inklusion | skipping + integration | i alt | PSI |
| Cortex | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5,56 | 5,65 | 3,71 |
Tabel 3: RNA ISH resultaterne beregnes ud fra det billede, der er vist i figur 5. Numrene i prikker/celle, blev beregnet ved hjælp af mere end 400 celler, der er inkluderet i de tre delregioner i cortex og CA3 (figur 4). Standard fejl er inkluderet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne meddelelse rapporterer brugen af BaseScope RNA ISH at undersøge som udtryk mønstre i mus hjernen sektioner. Det er påvist, at antisense exon-exon junction sonder kortere end 50 nukleotider kan målrette exon integration og overspringelse isoformer håndfast og konkret. Derudover kan de deraf følgende signaler bruges til at beregne PSI af en alternativ exon.
Et par variationer blev testet i proceduren. For eksempel, blev frossen væv sektioner genereret af kryostaterne skæring testet og vist sig at være succesrige til brug i dette ISH protokol. I dette tilfælde dog blev deparaffinization skridt i 2.1 ændret til vask af OLT med PBS i 5 min. Desuden, selvom det er meget praktisk at bruge hybridisering ovnen fra ACD, giver brugen af en simpel inkubator, indstillet på 40 ° C kombineret med et dias farvning bakke bruges til Immunhistokemi sammenlignelige resultater. Det vigtigste er at holde fugten i boksen ved herunder våd papirfiltre under hele proceduren.
Der er en begrænsning i denne procedure. Det er i øjeblikket ikke muligt at udføre, multi-farve mærkning på det samme væv dias. Således kan forskellige sonder kun bruges på adjacently klip, forskellige sektioner. For at opnå præcise PSI værdier, er det afgørende at sikre, at inkubationstiden for sonden hybridisering, signal forstærkning og opdagelse er den samme for hver væv sektion. I fremtiden, vil implementere brugen af multi-farve sonder på det samme væv dias, som bruges i RNAscope procedurerne, være meget ønskeligt.
RNA ISH beskrevet i denne betænkning giver en kraftfulde nye værktøj til kvantitativt analysere som udtryk mønstre i situ. Denne teknologi kan anvendes til at studere mange alternative exons. I en nylig rapport, var det med held bruges til at undersøge differential udtryk mønstre af de fire ErbB4 splicing isoformer i neuroner og oligodendrocytes på cellulære opløsning20. Som vist i dette og flere andre rapporter, vil kombinationen af BaseScope RNA ISH med immunochemistry være en kraftfuld tilgang til at studere lokalisering og funktion af varierende udtrykt splejsning isoformer6,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association [licensbetaling 0365274B til H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 til Z.W.], National Institutes of Health [Office for forskning infrastruktur delt Instrumentation Grant S10RR031845 til den lysmikroskopi Imaging facilitet ved Case Western Reserve University], og Kina stipendium Rådet [til X.G.].
Forfatterne takke Richard Lee i lys mikroskopi Imaging Core for hans hjælp med diasscanning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
