Summary
É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.
Abstract
Splicing alternativa (AS) ocorre em mais de 90% dos genes humanos. O padrão de expressão de um exon alternativamente emendado frequentemente é regulado de forma de tipo específico de célula. COMO expressão de padrões normalmente são analisados por RT-PCR e RNA-seq usar amostras do RNA isolado de uma população de células. Em situ exame de como os padrões de expressão para uma particular estrutura biológica pode ser realizada por RNA em situ da hibridação (ISH) usando sondas específicas do exon. No entanto, este uso particular do ISH tem sido limitado porque exões alternativos geralmente são muito curtos para projetar sondas específicas do exon. Neste relatório, o uso de BaseScope, uma tecnologia desenvolvida recentemente que emprega oligonucleotides antisentidos curtos no RNA ISH, é descrito para analisar como padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Exon 23a de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) é usado como um exemplo para ilustrar que curto exon-exon junction sondas exibem sinais de hibridização robusto com alta especificidade na análise de RNA ISH em seções de cérebro de rato. Mais importante, sinais detectados com sondas de inclusão e saltando-específicas do exon podem ser usados para confiantemente, calcular a porcentagem emendada em valores de Nf1 exon 23a expressão em diferentes áreas anatômicas de um cérebro de rato. O protocolo experimental e o método de cálculo para análise são apresentados. Os resultados indicam que o BaseScope oferece uma nova ferramenta poderosa para avaliar como expressão padrões em situ.
Introduction
Splicing alternativa (AS) é um processo comum que ocorre durante a maturação de pre-mRNA. Neste processo, um exon diferencialmente pode ser incluído no mRNA maduro. Assim, AS, através de um gene pode gerar muitos mRNAs esse código para produtos diferentes da proteína. Estima-se que os 92 – 94% dos genes humanos sofrem alternativas emenda1,2. Alternativa anormal, padrões de emenda resultou de mutações genéticas têm sido associadas a um grande número de doenças, incluindo câncer,3,4, distrofia miotônica e esclerose lateral amiotrófica. Assim, é crucial investigar e entender melhor os mecanismos reguladores splicing alternativos na tentativa de encontrar novos tratamentos de doenças humanas.
COMO muitas vezes é regulada de forma de tipo específico de célula. É importante determinar o padrão de expressão de AS de um gene específico em um determinado sistema biológico. No entanto, isso se torna complicado quando um órgão complexo que contém muitos tipos diferentes de células, tais como o cérebro ou no coração, é estudado. Neste caso, a escolha ideal do sistema de ensaio é RNA em situ hibridação (ISH) usando tecido seções para que o padrão de expressão de AS de um gene específico pode ser detectado em muitos tipos de células simultaneamente. Com efeito, sondas específicas do exon têm sido utilizadas para avaliar os níveis de expressão de uma alternativa exon5,6,7. No entanto, essa abordagem não é adequada para análise do padrão pelas seguintes razões. Em primeiro lugar, convencionais métodos ISH geralmente usam sondas mais de 300 bp, enquanto o tamanho médio dos vertebrados exões internos (não primeiro ou último exon) é 170 nucleotídeos8,9. Em segundo lugar, quando uma sonda exon-específico é usada para examinar o padrão de emenda de um exon alternativo interno, a única isoforma de mRNA detectada pela sonda é aquele que contém o exon, enquanto a isoforma de mRNA sem o exon não pode ser detectado. Assim, o cálculo por cento emendados em valor (PSI) para o exon alternativo é complicado. Além disso, ISH fluorescente convencional muitas vezes combina ISH com imunocoloração, que reduz a eficiência de deteção e robustez. Por exemplo, em um estudo que investigou a induzida por estresse, Emendando isoform comutação da acetilcolinesterase (AChE) mRNA, Digoxigenina foi incorporada a sonda ISH e detectado usando anticorpo anti-Digoxigenina. Alternativamente, biotina-rotulado sonda foi detectada por um fosfatase alcalina/estreptavidina conjugado e um substrato para a fosfatase alcalina10. Nenhum método usa qualquer estratégia de amplificação para aumentar a sensibilidade da deteção. Como resultado, é difícil detectar as transcrições de mRNA que são expressos em níveis baixos. Assim, é necessário um sistema de ensaio ISH mais simples e mais robusto para analisar como expressão padrões em situ.
BaseScope foi recentemente desenvolvido com base na plataforma de RNAscope, uma bem estabelecida e amplamente utilizado o sistema de ensaio ISH. Ambos os sistemas de ensaio utilizam uma tecnologia de amplificação de destino específico que aumenta a sensibilidade da deteção11,12. O que distingue um do outro é o comprimento da sequência de destino, que é tão curto quanto 50 nucleótidos para BaseScope e 300 – 1.000 nucleotídeos para RNAscope. Assim, é possível a concepção sondas junções exon-exon para detectar alternativa específica do mRNA isoformas de destino. No estudo atual, foi estabelecido um procedimento para examinar como testes padrões da expressão de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) exon 23a, um exon alternativo extensivamente estudado no mesmo laboratório13,14,15 , 16 , 17, nas seções de cérebro de rato. Os resultados demonstram que o BaseScope é um sistema ideal para estudar os padrões de expressão de Nf1 exon 23a in situ. Como este sistema de ensaio pode ser adaptado para analisar como padrões de expressão de muitos exões alternativos, representa uma nova ferramenta poderosa nos estudos de AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos descritos aqui que envolvem ratos foram aprovados pelo Comitê de utilização e caso Western Reserve University institucional Cuidado Animal. O título do protocolo de 2016-0068 (PI: Hua Lou) é "Papel de alternativo pre-mRNA emendar no desenvolvimento de vertebrados".
Nota: Informações de todos os equipamentos, reagentes e suprimentos utilizados neste protocolo são incluídas na Tabela de materiais.
1. prepare a formalina parafina fixa incorporado (FFPE) seções
-
Eutanásia em 1 CD1 de rato e 1 rato C57BL/6J por deslocamento cervical. Cuidadosamente corte o crânio com uma tesoura cirúrgica e fórceps. Remova o cérebro com uma colher.
Nota: 5 meses CD1 masculinos ratos e camundongos machos de 3 meses C57BL/6J foram utilizados e mostraram resultados semelhantes.- Lave o cérebro com PBS. Consertar o cérebro com uma solução de formol a 10% em temperatura ambiente (RT) para 30 h colocando o cérebro todo em 50 mL da solução de formalina.
- Alterar a solução de fixação para PBS e incubar o cérebro em PBS durante a noite a 4 ° C. Desidratar e incorporar o cérebro com xileno e parafina usando os procedimentos padrão de18.
-
Use um micrótomo para corte de tecido incorporado em 5 seções µm. Ponha a fita de parafina em banho maria RT primeiro e depois em um banho de água de 45 ° C para espalhar a faixa de opções.
- Quando as rugas e dobras na fita desaparecerem, imediatamente monte seções em lâminas de vidro. Ar secos slides durante a noite em slides RT. leve ao forno por 1h a 60 ° C antes do uso.
2. pré-tratamento da amostra
-
Deparaffinize cortes de tecido. Execute estas etapas em uma coifa.
- Preencha dois lavar pratos (figura 1A) com 250 mL de xileno fresco e dois com 250 mL de etanol a 100%. Inserir slides de tecido em um rack de lavagem (figura 1A) e coloc a lavagem da cremalheira em lavar pratos seguindo a ordem e incubação tempo indicado na tabela 1.
- Durante cada incubação, levante o cesto de lavagem acima e para baixo mais de 3 vezes no lavar prato. Após cada incubação, mover-se rapidamente a cremalheira de lavagem para o prato seguinte de lavagem para impedir os cortes histologicos desseque.
- Depois de concluir as etapas de incubação, retire o cesto de lavagem com slides do lavar prato. Coloque o Carré numa incubadora de 60 ° C por 5 min ou até que as lâminas estejam completamente secas.
- Desenhe uma 0,75 '' x 0,75 '' barreira em torno da seção de tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica. Ar seco a barreira por 3 min em RT
-
Fatias de pré-tratamento
- Preparar reagentes e equipamentos
- Acender o forno de hibridização (figura 1B) e definir a temperatura a 40 ° C 30 min antes de usar.
- Molhe o papel de humidificação (Figura 1E) com água destilada completamente e colocá-lo na bandeja de controle de umidade (Figura 1, à esquerda). Manter a bandeja de controle de umidade no forno da hibridação.
- Prepare a 700 mL de 1x fresco alvo recuperação de reagentes, acrescentando 630 mL de dH2O a 70 mL de 10 x alvo recuperação de reagentes.
- Aplica o peróxido de hidrogênio.
- Coloque os slides deparaffinized no banco. Adicione 5-8 gotas de peróxido de hidrogênio a uma seção para cobrir totalmente o tecido. Incubar durante 10 minutos a RT.
- Toque os slides em um pedaço de papel absorvente para remover a solução de peróxido de hidrogênio, um slide de cada vez. Imediatamente inserir o slide em um rack de lavagem e mover o cesto para um prato de lavar roupa cheio de dH2O.
- Lave os slides, movendo o rack acima e para baixo em água destilada por 3 a 5 vezes. Tirar a grade de lavagem para um prato de lavagem cheio de água destilada fresca e slides de lavagem mais uma vez.
- Executar recuperação de alvo
- Coloque um copo de vidro de 1.000 mL em uma chapa quente. Adicione 700 mL de 1x fresco alvo recuperação de reagentes para o copo e cubra com papel alumínio. Inserir um termômetro na medida através da cobertura da folha (Figura 1). Ligar a chapa e coloque em alta por 10-15 min.
- Quando a temperatura dos reagentes de recuperação atinge 98 ° C, passar o controle de temperatura da placa quente de alta para baixa para manter uma fervura suave. Não ferva mais de 15 min.
- Enquanto isso, cuidadosamente Abra o papel alumínio e coloque a grelha de lavagem com fatias dentro o regente de recuperação. Cobrir o copo novamente e incube por 15 min.
- Uso de fórceps para retirar o suporte do copo para um prato de lavagem preenchido com 200 mL de dH2O e enxaguar por 15 s.
- Mover o cesto para um prato de lavagem contendo 100% de etanol fresco e deixe descansar por 3 min. remover slides e secá-las em uma incubadora de 60 ° C por 10 min.
- Aplicar a Protease III
- Coloque os slides na prateleira a mancha (Figura 1, direito). Adicione 5 gotas de Protease III para cobrir o tecido. Cuidadosamente coloque a grelha na bandeja de controle de umidade (Figura 1, à esquerda) e insira a bandeja do forno de hibridização de 40 ° C. Incube durante 30 min.
- Retire as lâminas e volte a colocar o tabuleiro no forno. Toque os slides para remover o excesso de líquido, um slide de cada vez. Inserir o slide em um rack de lavagem e o rack em um prato de lavar roupa cheio de dH2O. Move o rack de cima e para baixo para lavar os slides para 3 - 5 vezes.
- Preparar reagentes e equipamentos
3. ISH ensaio
-
Preparar materiais
- Pré-aquecer 50 x tampão de lavagem em uma incubadora de 40 ° C por 20 min. Mix 2,94 L de dH2O e 60 mL de 50 x tampão de lavagem tornar 1x tampão de lavagem.
- Prepare a solução de coloração de hematoxilina 50% adicionando-se 100 mL de hematoxilina de Gill, eu a 100 mL de dH2água de amônia de 0,02% (p/v) Prepare O. adicionando 1,43 mL de 1 N de hidróxido de amônio a 250 mL de dH2O. Mix bem em um recipiente.
- Colocar as sondas e AMP 0 – 6 reagentes RT 30 min antes de usar. Manter a bandeja de controle de umidade em forno de hibridização a 40 ° C.
-
Procedimento ISH
Nota: Para examinar a expressão da Nf1 isoformas de emenda e calcular a porcentagem emendada em valor (PSI) para exon 23a, três diferentes sondas ISH que destino exon 23a-incluído isoform, exon 23a-excluídos isoform ou ambas as isoformas são usados (Figura 2 ). As sondas são usadas na Adjacent corte cortes histologicos. Para garantir a precisão do cálculo, é fundamental que os três cortes histologicos são tratados exatamente o mesmo nas etapas de deteção de hibridização e amplificação de sinal.- Teste de hibridização.
- Retire o cesto de lavagem os slides e toque o líquido em excesso das lâminas de. Coloque os slides no rack mancha.
- Use um lápis para rotular as lâminas com o nome de sonda. Coloca os três slides de tecido de cérebro Adjacent corte para ser hibridizado com três diferentes sondas de Nf1 (Figura 2) juntos. Realize as etapas subsequentes na mesma ordem dos slides.
- Adicione 4 gotas de sonda para cobrir o tecido. Fazer um slide de cada vez para evitar que as seções de secar. Coloque o Carré de mancha na bandeja do controle de umidade e inseri-lo no forno 40 ° C por 2 h.
- Lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem. Para cada lavagem, encher o prato de coloração com 200 mL de tampão de lavagem 1x e coloque um rack de lavagem nele. Toque o excesso de líquido em um slide de um papel toalha por vez e rapidamente, inseri-lo dentro do rack de lavagem. Mover as lâminas acima e para baixo no prato para 3 a 5 vezes por 2 min em RT
- Para a segunda lavagem, use o tampão de lavagem fresca.
- Amplificação de sinal.
- Toque o tampão de lavagem em excesso das lâminas de... e colocá-los na prateleira de mancha. Adicione 4 gotas de AMP 0 para cobrir o tecido. Coloque o Carré de mancha na bandeja do controle de umidade e inseri-lo no forno por 30 min a 40 ° C.
- Lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem como descrito acima.
- Repita este passo com AMP 1 – 6, seguindo a ordem e a condição da tabela 2. Lave as lâminas duas vezes depois de cada passo de hibridização.
- Detecção do sinal
- Toque o tampão de lavagem em excesso das lâminas de... e colocá-los em rack de mancha. Adicionar 2 µ l de Fast Red B a 120 µ l de Fast Red (proporção de 1: 60) em um tubo de microcentrifugadora. Misture bem e adicione para cobrir totalmente a seção de tecido.
Nota: O volume total de vermelho A / B mix baseia-se no número e tamanho das secções de tecido. Para uma área de 0,75 '' x 0,75 '', 120 µ l é suficiente para uma seção. Use a mistura dentro de 5 min e evitar a exposição da mistura à luz solar direta ou luz UV. - Feche a bandeja e incubar durante 10 minutos a RT. Remove a solução para um contentor de resíduos e imediatamente inserir os slides em um rack de lavar e coloque o Carré em um prato de lavagem cheio de água da torneira. Lave novamente com água fresca da torneira.
- Toque o tampão de lavagem em excesso das lâminas de... e colocá-los em rack de mancha. Adicionar 2 µ l de Fast Red B a 120 µ l de Fast Red (proporção de 1: 60) em um tubo de microcentrifugadora. Misture bem e adicione para cobrir totalmente a seção de tecido.
- Teste de hibridização.
-
Counterstaining dos slides
- Retire o cesto de lavagem da água da torneira e rapidamente toque em papel absorvente para remover a água extra. Colocar o cesto em uma hematoxilina de 50%, solução de coloração e imediatamente tirar a grade acima e para baixo várias vezes. Incubar por 2 min em RT.
- Transferi o porta-lâminas volta para o prato de água da torneira. Lave 3 – 5 vezes movendo o rack acima e para baixo e trocando a água fresca da torneira até os slides tornam-se claras, enquanto os tecidos do cérebro permanecem roxos.
- Mova o cesto para um prato contendo água de amônia de 0,02%. Tirar a grade acima e para baixo 2 – 3 vezes até que os tecidos ficam azuis. Lave os slides 3 a 5 vezes com água fresca da torneira em um prato de coloração.
-
Montagem das amostras
- Mover o porta-lâminas do prato coloração para uma incubadora de 60 ° C e incubar durante pelo menos 15 min, até que as lâminas estejam completamente secas.
- Coloque 40 µ l de meio de montagem no slide e cuidadosamente coloque uma lamínula 24 x 50 mm sobre a seção de tecido. Ar secos slides durante 30 min à RT
4. análise e coleta de dados
Nota: Use um scanner de slides para digitalizar as imagens na ampliação de X 40.
-
Controles positivos e negativos
- Para cada experimento, incluem controles positivos e negativos (Figura 3). Como um bom controle positivo, o sinal deve ser visível como punctate pontos na ampliação de 20-40 X.
- Uso do Mouse (Mm) - PPIB - 1ZZ como controle positivo. Esta sonda alveja um gene de limpeza comum PPIB. Para controle negativo, um ponto para cada 20 células exibindo coloração por campo de microscópio X 20 de fundo é aceitável.
- Use a sonda DapB-1ZZ como controlo negativo. Esta sonda dapB o gene bacteriano como alvo. Estas sondas de controle têm sido utilizadas em muitos ensaios ISH19.
-
Detecção do sinal e a análise de como os padrões de expressão de Nf1 exon 23a
- Como os sinais de hibridação são indicados como pontos punctate, conte os pontos manualmente. O número de pontos está correlacionado com o nível de transcrições que é detectado por uma ponta de prova específica. Observe que o número de pontos também pode ser analisado pelo software ImageJ ou SpotStudio.
- Use três sondas para cruzar a exon 23a-contendo, exon 23a-faltando isoformas ou transcrições de Nf1 totais (Figura 2). Como as três sondas não podem ser usadas simultaneamente, use três seções do tecido cerebral adjacente para cruzar para cada sonda.
- Para calcular o % emendados em (PSI) para exon 23a, conte o número de células e pontos em várias regiões do cérebro. Para cada região de interesse, conte mais de 400 células de várias sub-regiões, conforme indicado na Figura 4.
- Colete dados de sub-regiões mesmas para cada uma das três sondas. Calcular o PSI como o número de pontos por celular com a sonda de inclusão exon 23a / (número de pontos por celular com a sonda de inclusão exon 23a + número de ponto por célula com o exon23a saltando de sonda) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BaseScope ISH foi realizado utilizando três estirpes de rato: CD1 selvagem tipo ratos, C57BL/6J selvagem tipo ratos e ratos mutantes de Nf123aIN/23aIN em background C57BL/6J, em qual exon 23a está incluído em todos os tipos de células como resultado de engenharia local da tala mutações de14,15.
Como primeiro passo, o sistema de ensaio ISH foi testado usando reagentes empresa fornecido: sondas de ISH slides que tem células 3T3 e negativo e positivo. Como mostrado na Figura 3, nenhum sinal foi detectado quando a sonda de controlo negativo foi usada, enquanto muitos pontos punctate foram detectados quando utilizou-se a sonda de controle positivo.
Em seguida, ISH foi realizada usando seções de cérebro de rato e Nf1-sondas específicas que são projetados para detectar as transcrições de Nf1 que contêm exon 23a, saltar o exon 23a ou ambas as isoformas (Figura 2). Estas sondas alvo junções exon-exon específico. Duas regiões do cérebro foram selecionadas para examinar o padrão de expressão AS de Nf1 exon 23a: córtex e hipocampo CA3 (Figura 4). Para cada região, conte três sub-regiões, como indicado na Figura 4, gravação de números de celular e de ponto. Para cada região, aproximadamente 400 células foram contadas no total e usadas para calcular a relação de pontos/célula. O padrão de expressão AS para Nf1 exon 23a é calculado como PSI.
O ISH sinais obtidos com as três sondas de Nf1 no córtex e hipocampo de ratos CD1 são mostrados na Figura 5A-5F e tabela 3. A região do córtex de C57BL/6J Nf1+ + e ratos Nf123aIN/23aIN também foi analisada (Figura 6).
O resultado dessas experiências que levou a várias conclusões. Primeiro, a soma dos sinais, mostrado como pontos/célula, detectada pelo exon 23a inclusão-saltando específicas e sondas iguais àquela detectada pela sonda hybridizing para ambas as isoformas (tabela 3), que sugere que as três sondas hibridizadas com o Nf1 transcrições com eficiência semelhante. Em segundo lugar, o valor PSI do exon 23a em córtex, 10%, é consistente com o resultado de RT-PCR relatado anteriormente, em que o córtex foi dissecado de cérebro de rato adulto C57BL/6J seguido pelo isolamento de RNA total e análise de RT-PCR14,15. Este resultado sugere que o BaseScope ISH pode ser usado para analisar quantitativamente como padrões de expressão, além de níveis de transcrição em secções de tecido. Em terceiro lugar, os resultados obtidos com os tecidos do cérebro mutante Nf123aIN/23aIN , no qual todas as transcrições de Nf1 contenham exon 23a14,15, mostraram níveis semelhantes de sinais quando específicas de inclusão e Nf1 totais sondas foram usadas e nenhum sinal quando específico saltando de sonda foi utilizada (Figura 6), indicando que as duas sondas direcionamento exon inclusão ou saltando são altamente específicas.
Figura 1: equipamento utilizado na ISH. (A) lavar prato e cremalheira de lavagem. (B) forno de hibridização. (C) conjunto de copo e prato quente de recuperação de destino. Umidade (D) controlar a bandeja e mancha de cremalheira. (E) papel de humedecimento indicado por uma seta vermelha dentro da bandeja de controle de umidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sondas usado para detectar Nf1 exon 23a como padrões de expressão. As sondas contêm um do oligonucleotide par ZZ. A sonda de inclusão específicos (vermelho) destina-se a junção de exões 23a e 24, a sonda específica saltando (verde) destina-se a junção de exões 23 e 24, e a sonda total de Nf1 (azul) destina-se a junção de exões 26 e 27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ISH usando negativo (A-B) e os controlos positivos (C-D) em células 3T3. Um slide de controle contendo células 3T3 foi processado através de etapas 2 (pré-tratamento da amostra) e 3 (procedimento ISH) no protocolo. Sinais positivos são mostrados como pontos vermelhos punctate, indicados por setas vermelhas. B e D são ampliadas em imagens de A e C, respectivamente. Barra de escala = 20 µm (A e C); 5 µm (B e D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagem de uma secção coronal de cérebro de rato. As caixas vermelhas indicam as áreas selecionadas para a contagem de números de celular e o sinal no córtex e hipocampo regiões CA3. Barra de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Sinais de RNA ISH detectados usando Nf1-sondas específicas e rato seções do cérebro. CD1 cérebros foram processados através de etapas 1-4 no protocolo. Pontos vermelhos punctate indicam positivo sinaliza quando a três Nf1-sondas específicas (mostrados na Figura 3) são utilizados. Córtex (A-C) e o hipocampo (D-F) são mostrados. NF1 sonda total foi usada na e D, sonda de inclusão específicos em B e E e sonda específica saltando em C e F. escala bar = 40 µm (A-C); 400 µm (D-F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: RNA ISH sinais detectados em Nf1+ + e seções do cérebro de Nf123aIN/23aIN . Ambas as cepas do mouse são no fundo C57BL/6J. Os cérebros foram processados através de etapas 1-4 no protocolo. A-C. Nf1+ + córtex. D-F. Córtex de Nf123aIN/23aIN . Sonda total de Nf1 foi usada na e D, sonda de inclusão específicos em B e E e sonda específica saltando em C e F. escala bar = 40 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ordem de incubação | Produtos químicos no prato de TT | Tempo |
| 1 | 250 mL de xileno | 5 min |
| 2 | 250 mL de xileno | 5 min |
| 3 | 250 mL de etanol 100% | 2 min |
| 4 | 250 mL de etanol 100% | 2 min |
Tabela 1: Processo de incubação de passo 2.1.1.
| Solução de AMP | Tempo de incubação | Temperatura de incubação |
| AMP 1 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 5-VERMELHO | 30 min | Temperatura ambiente |
| AMP 6-VERMELHO | 15 min | Temperatura ambiente |
Tabela 2: Sinal interno de amplificação do passo 3.2.2.
| Região | saltando | inclusão | pular + inclusão | total | LIBRAS POR POLEGADA QUADRADA |
| córtex | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| DAT | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5,56 | 5.65 | 3,71 |
Tabela 3: RNA ISH resultados calculados a partir da imagem mostrada na Figura 5. Os números, mostrados em pontos/celular, foram calculados utilizando mais de 400 células que estão incluídas em três sub-regiões no córtex e CA3 (Figura 4). Erros-padrão estão incluídos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A presente comunicação relata o uso de BaseScope RNA ISH para examinar como os padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Está demonstrado que essa junção exon de anti-sentido-exon sondas menor do que 50 nucleótidos podem direcionar exon inclusão e saltando isoformas robusta e especificamente. Além disso, os sinais resultantes podem ser usados para calcular PSI de um exon alternativo.
Algumas variações foram testadas no procedimento. Por exemplo, seções de tecido congelado geradas secionando criostato foram testadas e mostradas para ser bem sucedido para uso neste protocolo ISH. Neste caso, no entanto, o passo de deparaffinization 2.1 foi mudado para lavagem de PTU com PBS por 5 min. Além disso, embora seja muito conveniente de usar o forno de hibridização fornecido pelo ACD, utilização de uma incubadora simples definir a 40 ° C, combinado com um slide de coloração bandeja usada para imuno-histoquímica dá resultados comparáveis. O importante é manter a umidade na caixa, incluindo papéis de filtro molhados durante todo o procedimento.
Existe uma limitação neste procedimento. Atualmente, não é viável para realizar multi cor rotulagem do mesmo slide de tecido. Assim, diferentes sondas só podem ser usadas em seções diferentes, Adjacent cortadas. Para obter valores exatos de PSI, é fundamental para garantir que o tempo de incubação de hibridização da sonda, detecção e amplificação de sinal são as mesmas para todas as secções de tecido. No futuro, implementar o uso de sondas multi cores do mesmo slide de tecido, como usado nos procedimentos de RNAscope, será altamente desejável.
O RNA ISH descrito neste relatório fornece uma nova ferramenta poderosa para analisar quantitativamente como expressão padrões em situ. Esta tecnologia pode ser aplicada para estudar muitos exões alternativos. Num relatório recente, foi usado com sucesso para examinar os padrões de expressão diferencial da ErbB4 quatro isoformas em neurônios e oligodendrócitos no celular resolução20de emenda. Como mostra este e vários outros relatórios, combinação de BaseScope do RNA ISH com imunoquímica será uma poderosa abordagem para estudar a localização e a função do diferencialmente expressos emenda isoformas6,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela associação americana do coração [subsídio 0365274B para H.L.], National Cancer Institute [P50CA150964 GI SPORE para Z.W.], National Institutes of Health [escritório de pesquisa infra-estrutura compartilhada instrumentação Grant S10RR031845 para a microscopia de luz imagem facilidade na Case Western Reserve University] e China Scholarship Conselho [X.G.].
Os autores graças a Richard Lee do núcleo de Imaging de microscopia de luz por sua ajuda com a digitalização de slides.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
