Summary
En i situ hybridisering (ISH) protokoll som bruker korte antisense oligonucleotides for å finne alternative pre-mRNA skjøting mønstre i musen hjernen delene er beskrevet.
Abstract
Alternativ skjøting (AS) oppstår i mer enn 90% av menneskets gener. Uttrykksmønster i en alternativt skjøtes ekson er ofte regulert i en celle type-spesifikk måte. SOM uttrykk mønstre er vanligvis analysert av RT PCR og RNA-seq RNA utvalg isolert fra en populasjon av celler. In situ undersøkelse av som uttrykk mønstre for en bestemt biologiske struktur kan utføres av RNA i situ hybridisering (ISH) bruker ekson-spesifikke sonder. Men er bruk ish begrenset fordi alternativ exons er generelt for kort til å utforme ekson-spesifikke sonder. I denne rapporten er bruk av BaseScope, en nylig utviklet teknologi som sysselsetter kort antisense oligonucleotides i RNA ISH, beskrevet å analysere som uttrykk mønstre i musen hjernen deler. Ekson 23a av Nevrofibromatose type 1 (Nf1) brukes som et eksempel for å illustrere at kort ekson-ekson krysset sonder ha robust hybridisering signaler med høy spesifisitet RNA ISH analyse på musen hjernen deler. Enda viktigere, kan signaler oppdaget med ekson inkludering og hoppe-spesifikke sonder brukes til å beregne pålitelig prosent skjøtes i Nf1 ekson 23a uttrykk i ulike anatomiske områder av musen hjerne-verdiene. Eksperimentell protokollen og beregningsmetoden for som analyse presenteres. Resultatene indikerer at BaseScope gir et kraftig nytt verktøy til som uttrykk mønstre i situ.
Introduction
Alternativ skjøting (AS) er en felles prosess som oppstår under pre-mRNA modning. I denne prosessen, kan en ekson være ulikt inkludert i eldre mRNA. Dermed gjennom AS, kan genet generere mange mRNAs koden for annet protein produkter. Det anslås at 92-94% av menneskets gener gjennomgå alternativ skjøting1,2. Unormal alternativ skjøting mønster skyldes genetiske mutasjoner er knyttet til en rekke sykdommer, inkludert amyotrofisk lateral sklerose, myotonic dystrophy og kreft3,4. Det er derfor avgjørende å undersøke og bedre forstå alternativ skjøting regulatoriske mekanismer i et forsøk på å finne nye behandlinger av menneskelige sykdommer.
SOM ofte er regulert i en celle type-spesifikk måte. Det er viktig å bestemme AS uttrykksmønster av et bestemt gen i et biologisk system. Men blir dette komplisert når en komplisert organ som inneholder mange forskjellige typer celler, for eksempel hjernen eller hjertet, er studert. I dette tilfellet er et ideelt valg av analysen RNA i situ hybridisering (ISH) ved hjelp av vev seksjoner slik AS uttrykk mønsteret med et bestemt kan påvises i mange celletyper samtidig. Ekson-spesifikke sonder har faktisk brukt til å vurdere uttrykk nivåer av en alternativ ekson5,6,7. Men er denne tilnærmingen ikke godt egnet for som mønster analyse av følgende årsaker. Første, konvensjonelle ISH metoder bruker vanligvis sonder lengre enn 300 bp, mens den gjennomsnittlige størrelsen på virveldyrenes interne exons (ikke første eller siste ekson) er 170 nukleotider8,9. Andre når en ekson-spesifikke sonde undersøke skjøting mønster av en intern alternativ ekson, er den eneste mRNA isoformen oppdaget av sonden som inneholder ekson, mens mRNA isoformen uten ekson ikke kan oppdages. Dermed er beregning av prosent skjøtes i (PSI) verdi for den alternative ekson komplisert. Videre kombinerer konvensjonelle fluorescerende ISH ofte ISH med immunostaining, som reduserer effektiviteten deteksjon og robusthet. For eksempel i en studie som undersøkte stress-indusert skjøting isoformen bytte av acetylcholinesterase (verke) mRNA, digoxigenin ble innlemmet i ISH sonden og oppdaget bruker anti-digoxigenin antistoff. Alternativt ble biotin-merket sonde oppdaget av en alkalisk fosfatase/streptavidin konjugert og et substrat for alkalisk fosfatase10. Verken metoden bruker en forsterkning strategi for å øke sensitiviteten av gjenkjenning. Som et resultat, er det utfordrende for å oppdage mRNA utskrifter som er uttrykt ved lave nivåer. Dermed er en enklere og mer robust ISH analysen system nødvendig for å analysere som uttrykk mønstre i situ.
BaseScope ble nylig utviklet basert på plattformen for RNAscope, godt etablert og brukte ISH analysen systemet. Begge analysen systemer benytter en mål-spesifikke forsterkning teknologi som øker følsomheten til gjenkjenning11,12. Hva skiller fra hverandre er målet sekvensen, som er så kort som 50 nukleotider for BaseScope og 300-1000 nukleotider for RNAscope. Dermed er det mulig å design sonder som mål ekson-ekson Forbindelsesstykke å oppdage bestemte alternativ mRNA isoformene. I denne studien, ble en prosedyre etablert for å undersøke som uttrykk mønstre av Nevrofibromatose type 1 (Nf1) ekson 23a, en alternativ ekson grundig studert i samme laboratorium13,14,15 , 16 , 17i musen hjernen deler. Resultatene viser at BaseScope er et ideelt system å studere uttrykk bruksmønstre Nf1 ekson 23a i situ. Som denne analysen systemet kan tilpasses analyserer uttrykk mønstre av mange alternative exons, representerer den et kraftig nytt verktøy i studier av AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene beskrevet her som involverer mus er godkjent ved Case Western Reserve University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. Tittelen på protokollen 2016-0068 (PI: Hua Lou) er "Rolle alternativ pre-mRNA skjøting virveldyrenes utvikling".
Merk: Informasjon for alle utstyr, reagenser og utstyr som brukes i denne protokollen er inkludert i Tabellen for materiale.
1. klargjør Formalin fast parafin innebygd (FFPE) deler
-
Euthanize 1 CD1 mus og 1 C57BL/6J mus av cervical forvridning. Forsiktig kutte åpne skallen med kirurgisk saks og tang. Fjerne hjernen med en scoop.
Merk: 5 måneder gamle CD1 mannlige mus og 3-måneden-gamle C57BL/6J mannlige mus ble brukt og viste lignende resultater.- Vask hjernen med PBS. Løsning hele hjernen med en løsning som inneholder 10% formalin ved romtemperatur (RT) 30 timer ved å sette hele hjernen i 50 mL av formalin løsningen.
- Endre fikse løsningen til PBS og ruge hjernen PBS overnatting på 4 ° C. Tørke og legge hjernen med xylen og parafin bruker standard prosedyrer18.
-
Bruk en mikrotom for å klippe innebygde vev i 5 µm seksjoner. Sette parafin båndet i en RT vannbad først, og deretter i en 45 ° C vannbad å spre båndet.
- Når rynker og bretter i båndet forsvinne, umiddelbart montere delene på glass lysbilder. Luften tørr lysbilder overnatting på RT. Bake lysbilder 1t på 60 ° C før bruk.
2. prøven forbehandling
-
Deparaffinize vev deler. Utføre trinnene i avtrekksvifte.
- Fylle to vaske (figur 1A) med 250 mL av fersk xylen og to med 250 mL av 100% etanol. Sette inn vev lysbilder i en vask rack (figur 1A) og sted vask rack i vaske etter orden og inkubasjon tiden angitt i tabell 1.
- Under hver inkubasjon løfte vask rack opp og ned mer enn 3 ganger i parabolen vaskemaskin. Etter hver inkubasjon flytte raskt vask stativet til neste vask rett å hindre delene vev tørker ut.
- Etter inkubasjon trinnene, fjerne vask stativet med lysbilder fra parabolen vask. Montere i en 60 ° C inkubator i 5 minutter eller til lysbildene er helt tørt.
- Tegne en 0,75 '' x 0.75'' barriere omkringliggende vev delen med en hydrofobe barriere. Lufttørke barrieren for 3 min på RT.
-
Pretreat skiver
- Forberede reagenser og utstyr
- Slå på hybridisering ovnen (figur 1B) og sette temperaturen til 40 ° C 30 min før bruk.
- Våt humidifying papiret (figur 1E) med destillert vann helt og putte den i fuktighet kontroll skuff (figur 1 d, venstre). Hold fuktighet kontroll skuffen i hybridisering ovnen.
- Forberede 700 mL frisk 1 x Target henting reagenser ved å legge til 630 mL av dH2O 70 mL 10 x Target henting reagenser.
- Bruke hydrogenperoksid.
- Satt deparaffinized lysbilder på benken. Legge til 5-8 dråper hydrogenperoksid seksjon til dekker vevet. Inkuber i 10 min på RT.
- Tapp lysbilder på absorberende papir fjerne hydrogen peroxide løsningen, ett lysbilde om gangen. Umiddelbart setter inn lysbildet i en vask rack og flytte stativet til en vask fat fylte med dH2O.
- Vask lysbildene ved å flytte stativet opp og ned i destillert vann til 3-5 ganger. Flytte vask stativet til en vask fat fylte med frisk destillert vann og vask lysbilder en gang.
- Utføre målet henting
- Plass en 1000 mL glass kanne på en kokeplate. Legg til 700 mL frisk 1 x Target henting reagenser i begeret og dekk den med folie. Sette inn et termometer i begeret gjennom folie dekselet (figur 1 c). Slå på kokeplate og sett på høy i 10-15 min.
- Når temperaturen på henting reagenser når 98 ° C, bytte temperaturkontroll av kokeplate fra høy til lav for å opprettholde en mild koke. Ikke kok mer enn 15 min.
- I mellomtiden nøye åpne folien og sette vask stativet med skiver inne henting regent. Dekke begeret igjen og ruge i 15 min.
- Bruk tang til å fjerne stativet fra begeret til en vask rett fylt med 200 mL av dH2O og skyll 15 s.
- Flytte stativet til en vask rett som inneholder 100% frisk etanol og la sitte for 3 min. fjerne lysbilder og tørke dem i en 60 ° C inkubator for 10 min.
- Bruke Protease III
- Plass lysbildene på flekken stativet (figur 1 d, høyre). Legge til 5 dråper Protease III å dekke vevet. Nøye sette brettet i fuktighet kontroll skuffen (figur 1 d, venstre) og sett inn skuffen i 40 ° C hybridisering ovnen. Inkuber i 30 min.
- Fjerner du objektglasstativet, og sette skuffen tilbake i ovnen. Trykk på lysbilder for å fjerne overflødig væske, ett lysbilde om gangen. Sette inn lysbildet i en vask rack og stedet racket i en vask rett fylt med dH2O. flytte rack opp og ned å vaske lysbilder for 3 - 5 ganger.
- Forberede reagenser og utstyr
3. ISH analysen
-
Forberede materialer
- Forvarm 50 x vaskebuffer i en 40 ° C inkubator i 20 min. blanding 2.94 L av dH2O og 60 mL 50 x vaskebuffer å 1 x vaskebuffer.
- Forberede 50% Hematoxylin flekker løsning ved å legge til 100 mL Gill's hematoxylin jeg til 100 mL av dH2O. forberede 0,02% (w/v) ammoniakk vann ved å legge til 1.43 mL 1 N ammonium hydroksid 250 mL av dH2O. Mix bra i en beholder.
- Sette sonder og AMP 0 – 6 reagenser RT 30 minutter før bruk. Hold fuktighet kontroll skuffen i 40 ° C hybridisering ovnen.
-
ISH prosedyre
Merk: For å undersøke uttrykk for Nf1 skjøting isoformene og beregne prosentandelen skjøtes i (PSI) verdi for ekson 23a, tre forskjellige ISH sonder som mål ekson 23a-inkludert isoformen, ekson 23a-ekskludert isoformen eller begge isoformene er brukt (figur 2 ). Sonder brukes på adjacently kuttet vev deler. For å sikre nøyaktigheten av beregningen, er det avgjørende at delene tre vev blir behandlet akkurat det samme i hybridisering, forsterkning og signal oppdagelsen trinnene.- Sonde hybridisering.
- Fjern lysbildene fra vask rack og trykk overflødig væske fra lysbilder. Plass lysbildene i racket flekken.
- Bruke en blyant merke lysbildene med sonde navn. Satte tre adjacently kuttet hjernen vev lysbildene for å være hybridiserte med tre forskjellige Nf1 sonder (figur 2) sammen. Utføre de påfølgende trinnene i den samme rekkefølgen av lysbilder.
- Legge til 4 dråper sonden å dekke vevet. Gjøre dette ett lysbilde for å hindre delene tørker. Montere flekken i fuktighet kontroll skuffen og sett den inn i 40 ° C ovnen for 2T.
- Vask lysbildene to ganger med å vaske bufferen. For hver vask, fylle flekker retten med 200 mL 1 x vaskebuffer og plassere en vask rack i den. Trykk overflødig væske på et papir håndkle ett lysbilde om gangen og raskt sette den inn i vask stativet. Flytte objektglasstativet opp og ned i retten for 3-5 ganger i 2 minutter på RT.
- For andre vask, bruke fersk vaskebuffer.
- Signalforsterkning.
- Trykk den overskytende vaskebuffer fra lysbilder og plassere dem i racket flekken. Legge til 4 dråper AMP 0 å dekke vevet. Montere flekken i fuktighet kontroll skuffen og sett den i ovnen i 30 minutter til 40 ° C.
- Vask lysbildene to ganger med å vaske bufferen som beskrevet ovenfor.
- Gjenta dette trinnet med AMP 1 – 6 følge ordre og tilstanden til tabell 2. Vask lysbildene to ganger etter hvert hybridisering trinn.
- Signalgjenkjenning
- Trykk den overskytende vaskebuffer fra lysbilder og plassere dem i flekken rack. Legg 2 µL av Fast rødt B til 120 µL av Fast rødt (1:60 forholdet) i et microcentrifuge rør. Bland godt og legge til fullt ut dekker delen vev.
Merk: Det totale volumet av rød / B blanding er basert på antallet og størrelsen av vev. Et 0,75 '' x 0.75'' område er 120 µL nok for en inndeling. Bruk mix innen 5 min og unngå eksponering av blandingen for direkte sollys eller UV-lyset. - Lukk skuffen og ruge i 10 min på rett fjerne løsningen på en avfallsbeholderen og umiddelbart sette inn lysbilder i en vask rack og montere i en vask fat fylte med vann fra springen. Skyll igjen med vann fra springen.
- Trykk den overskytende vaskebuffer fra lysbilder og plassere dem i flekken rack. Legg 2 µL av Fast rødt B til 120 µL av Fast rødt (1:60 forholdet) i et microcentrifuge rør. Bland godt og legge til fullt ut dekker delen vev.
- Sonde hybridisering.
-
Counterstaining lysbildene
- Fjern vask stativet fra vann fra springen, og raskt trykk på tørkepapir for å fjerne ekstra vann. Stativet inn en 50% hematoxylin flekk løsning og umiddelbart flytte rack opp og ned flere ganger. Inkuber i 2 minutter på RT.
- Overføre objektglasstativet tilbake i springvann parabolen. Vask 3-5 ganger ved å flytte stativet opp og ned og endre vann fra springen til lysbildene blir klart, mens hjernen vev være lilla.
- Flytte stativet til en tallerken med 0,02% ammoniakk vann. Flytt rack opp og ned 2 – 3 ganger til vev blir blå. Vask lysbildene 3-5 ganger med vann fra springen i en flekker retten.
-
Montering av prøvene
- Flytte objektglasstativet fra flekker retten til en 60 ° C inkubator og ruge i minst 15 min til lysbildene er helt tørt.
- Plasser 40 µL av montering medium på lysbildet og forsiktig plassere en 24 x 50 mm dekkglassvæske over delen vev. Luften tørr lysbilder for 30 min på RT.
4. datainnsamling, analyse
Merk: Bruk en slide skanner for å skanne bildene på 40 X forstørrelse.
-
Positive og negative kontroller
- For hvert eksperiment, Inkluder positive og negative kontroller (Figur 3). Som en god positive kontroll skal signalet vises som vises punctate prikker på 20-40 X forstørrelse.
- Bruk musen (Mm) - PPIB - 1ZZ som en positiv. Denne sonde mot en felles husholdning genet PPIB. Negativ kontroll er en prikk på hver 20 celler viser bakgrunnen flekker 20 X mikroskop feltet akseptabelt.
- Bruk DapB-1ZZ sonden som en negativ kontroll. Denne sonde mål bakteriell genet dapB. Disse kontroll sonder har blitt brukt i mange ISH analyser19.
-
Signalet deteksjon og analyse av som uttrykk bruksmønstre Nf1 ekson 23a
- Som hybridisering signalene er angitt som vises punctate prikker, telle prikkene manuelt. Antall prikker er korrelert med nivået av transkripsjoner er oppdaget av en bestemt sonde. Merk at antall prikker kan også analyseres ved ImageJ eller SpotStudio.
- Bruk tre prober for å hybridize ekson 23a inneholder, ekson 23a-mangler isoformene eller totale Nf1 transkripsjoner (figur 2). Som de tre prober ikke kan brukes samtidig, kan du bruke tre tilstøtende hjernen vev deler du hybridize til hver probe.
- For å beregne prosent skjøtes i (PSI) for ekson 23a, Tell antall celler og prikker i flere områder av hjernen. For hvert område av interesse, telle mer enn 400 celler fra flere regioner som vist i Figur 4.
- Samle inn data fra de samme underregionene for hver av de tre prober. Beregne PSI som antall punkt per celle med ekson 23a inkludering sonden / (antall prikker per celle med ekson 23a inkludering sonde + antall punkt per celle med exon23a hoppe sonde) x 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BaseScope ISH ble gjennomført med tre musen stammer: CD1 vill type mus, C57BL/6J vill type mus og Nf123aIN/23aIN mutant mus i C57BL/6J bakgrunnen i hvilke ekson 23a er inkludert i alle celletyper som følge av konstruert skjøte området mutasjoner14,15.
Som et første skritt, ISH analysen systemet ble testet med gitt reagenser: som 3T3 celler, og negative og positive ISH sonder. Som vist i Figur 3, fant ingen signal når negativ kontroll proben ble brukt, mens mange vises punctate prikker ble oppdaget da positiv kontroll proben ble brukt.
Deretter ISH ble gjennomført med musen hjernen seksjoner og Nf1-spesifikke sonder som er utviklet for å oppdage Nf1 utskrifter som inneholder ekson 23a, hopper ekson 23a eller begge isoformene (figur 2). Disse sonder målrette bestemte ekson-ekson veikryss. To områder av hjernen var valgt å undersøke AS uttrykksmønster av Nf1 ekson 23a: cortex og hippocampus CA3 (Figur 4). For hver region, antall tre underregionene, som vist i Figur 4, opptak både celle og prikk. For hver region, ble ca 400 celler regnet totalt og brukes til å beregne punkter/mobiltelefon forholdet. AS uttrykk mønsteret Nf1 ekson 23a beregnes som PSI.
ISH signaler med de tre Nf1 sonder i cortex og hippocampus CD1 mus er vist i figur 5A-5F og tabell 3. Cortex regionen fra C57BL/6J Nf1+/ + og Nf123aIN/23aIN mus var også analysert (figur 6).
Resultatet av disse eksperimentene førte til flere konklusjoner. Først, summen av signaler, vises som prikker/mobiltelefon, oppdaget av ekson 23a inkludering-spesifikke og hoppe-spesifikke sonder tilsvarer til som oppdages av sonden hybridizing til både isoformene (tabell 3), noe som antyder at de tre prober hybridiserte med Nf1 utskrifter med lignende effektivitet. Andre er PSI verdien av ekson 23a i cortex, 10%, konsekvent med tidligere rapportert RT PCR resultatet, der cortex ble dissekert fra voksen C57BL/6J musen hjernen etterfulgt av total RNA isolasjon og RT PCR analyse14,15. Dette resultatet antyder at BaseScope ISH kan brukes å analysere kvantitativt som uttrykk mønstre i tillegg til transkripsjon nivåer i vev deler. Tredje resultatene med Nf123aIN/23aIN mutant hjernen vev, som inneholder alle Nf1 transkripsjoner ekson 23a14,15, viste lignende nivåer av signaler når inkludering-spesifikke og Nf1 totale sonder ble brukt og ingen signal når hoppe-spesifikke sonde ble brukt (figur 6), som angir at to sonder målretting ekson inkludering eller hoppe er svært spesifikke.
Figur 1: utstyr som brukes i ISH. (A) vask rett og vaske rack. (B) hybridisering ovnen. (C) målrette henting kanne og kokeplate sett. (D) fuktighet kontroll brett og flekken rack. (E) fukter papir angitt av et rødt pilhode inne fuktighet kontroll skuffen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sonder brukes til å oppdage Nf1 ekson 23a som uttrykk mønstre. Alle sonder inneholder en ZZ par oligonucleotide. Inkludering-spesifikke sonden (rød) mål av exons 23a og 24, hoppe-spesifikke sonden (grønn) mål av exons 23 og 24, og Nf1 totale sonden (blå) mål av exons 26 og 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: ISH bruker negative (A-B) og positiv (C-D) kontroller i 3T3 celler. En kontroll-lysbildet som inneholder 3T3 cellene behandles med trinn 2 (eksempel forbehandling) og 3 (ISH prosedyre) i protokollen. Positive signaler vises som røde vises punctate prikker indikeres av røde piler. B og D er zoomet inn bilder av A og C, henholdsvis. Skala bar = 20 µm (A og C); 5 µm (B og D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: bilde av en mus hjernen koronale delen. De røde boksene angir områdene valgt for opptelling av cellen og signalet tall i cortex og hippocampus CA3 områder. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: RNA ISH signaler oppdaget bruker Nf1-spesifikke sonder og mus hjernen deler. CD1 hjernen ble behandlet gjennom trinn 1-4 i protokollen. Rød vises punctate prikker indikerer positiv når de tre Nf1-spesifikke sonder (vist i Figur 3) brukes. Cortex (Vekselstrøm) og hippocampus (D-F) vises. NF1 totalt sonde ble brukt i A og D, inkludering-spesifikke sonde i B og E og hoppe-spesifikke sonde i C og F. skala = 40 µm (-vekselstrøm); 400 µm (D-F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: RNA ISH signaler oppdaget i Nf1+/ + Nf123aIN/23aIN hjernen delene. Begge musen stammer er i C57BL/6J bakgrunnen. Hjernen ble behandlet gjennom trinn 1-4 i protokollen. A-C. Nf1+/ + cortex. D-F. Nf123aIN/23aIN cortex. Nf1 totale sonde ble brukt i A og D, inkludering-spesifikke sonde i B og E og hoppe-spesifikke sonde i C og F. skala = 40 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Inkubasjon-ordenen | Kjemikalier i TT rett | Tid |
| 1 | 250 mL xylen | 5 min |
| 2 | 250 mL xylen | 5 min |
| 3 | 250 mL av 100% etanol | 2 min |
| 4 | 250 mL av 100% etanol | 2 min |
Tabell 1: Inkubasjon prosedyren for trinn 2.1.1.
| AMP løsning | Inkubasjonstiden | Inkubasjon temperatur |
| AMP 1 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 5-RØD | 30 min | Romtemperatur |
| AMP 6-RØD | 15 min | Romtemperatur |
Tabell 2: Signal forsterkning prosedyren for trinn 3.2.2.
| Regionen | hopper over | inkludering | hoppe + inkludering | Totalt | PSI |
| cortex | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5,56 | 5.65 | 3.71 |
Tabell 3: RNA ISH resultatene beregnes fra bildet vist i figur 5. Tallene, vises i prikker-cellen, ble beregnet ved hjelp av mer enn 400 celler som er inkludert i de tre underregionene i cortex og CA3 (Figur 4). Standardfeil er inkludert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne kommunikasjonen rapporterer bruk av BaseScope RNA ISH undersøke som uttrykk mønstre i musen hjernen deler. Det er vist at anti-følelse ekson-ekson krysset sonder kortere enn 50 nukleotider kan målrette ekson inkludering og overshopping isoformene robustly og spesielt. Videre kan det resulterende signaler brukes til å beregne PSI i en alternativ ekson.
Noen varianter ble testet i prosedyren. For eksempel ble frossent deler generert av kryostaten snitting testet og vist seg å være vellykket for bruk i denne ISH protokollen. I dette tilfellet, men ble det deparaffinization trinnet i 2.1 endret til vask av OCT med PBS i 5 min. Dessuten, selv om det er veldig praktisk å bruke hybridisering ovnen levert av ACD, gir bruk av en enkel inkubator satt til 40 ° C kombinert med en flekker brett brukes for immunohistochemistry sammenlignbare resultater. Viktigste er å holde fuktighet i boksen ved å inkludere våt filter papir i hele denne prosedyren.
Det er en begrensning i denne fremgangsmåten. Foreløpig er det ikke mulig å utføre multi-farge merking i samme vev lysbilde. Dermed kan ulike sonder bare brukes på adjacently kuttet, ulike deler. For å oppnå nøyaktige PSI verdier, er det viktig å sikre at inkubasjon da sonden hybridisering, signalforsterkning og oppdagelsen er den samme for alle vev-delen. I fremtiden, blir implementere bruk av multi-farge sonder på samme vev lysbildet i den RNAscope prosedyrer, svært ettertraktet.
RNA-ISH som er beskrevet i denne rapporten gir et kraftig nytt verktøy kvantitativt analysere som uttrykk mønstre i situ. Denne teknologien kan brukes for å studere mange alternative exons. I en fersk rapport, ble det brukt til å undersøke differensial uttrykk mønstre av fire ErbB4 skjøting isoformene nevroner og oligodendrocytes på mobilnettet oppløsning20. Som vist i dette og flere andre rapporter, vil kombinasjonen av BaseScope RNA ISH med immunochemistry være en effektiv tilnærming til å studere lokalisering og funksjon av ulikt uttrykt skjøting isoformene6,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association [Grant-in-Aid 0365274B å H.L.], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964 å Z.W.], National Institutes of Health [Office for forskning infrastruktur delt instrumentering Grant S10RR031845 til den * lys Imaging anlegg ved Case Western Reserve University], og Kina stipend råd [X.G.].
Forfatterne takker Richard Lee i lys mikroskopi Imaging kjernen for hans hjelp med slide skanning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
