Summary
Kısa antianlamlı oligonucleotides fare beyin bölümlerde alternatif pre-mRNA yapıştırma desenleri algılamak için kullandığı bir in situ hibridizasyon (ISH) protokolü tanımlanır.
Abstract
Alternatif dikişi (AS) insan genlerinin fazla % 90 oluşur. Bir alternatif olarak spliced exon ifade desenini kez bir hücre türüne özgü biçimde düzenlenmiştir. Kalıpları genellikle RT-PCR ve RNA-seq tarafından incelenir ifadesi olarak hücreleri bir popülasyondan RNA numuneleri kullanılarak izole. İn situ incelenmesi belirli bir biyolojik yapısı için ifade desen olarak kullanarak exon özgü probları RNA in situ hibridizasyon tarafından (ISH) yapılabilir. Ancak, alternatif ekzonlar genellikle exon özgü probları tasarlamak için çok kısa olduğu için ISH belirli bu kullanımı sınırlı olmuştur. Bu raporda, BaseScope, RNA ISH, kısa antianlamlı oligonucleotides istihdam son zamanlarda gelişmiş bir teknoloji kullanımı olarak fare beyin bölümleri ifade desenleri analiz etmek için tanımlanır. EXoN 23a nörofibromatozis tip 1 (Nf1) örnek olarak kısa exon-exon junction probları RNA ISH analiz fare beyin bölümlerinde yüksek özgüllük ile sağlam hibridizasyon sinyalleri sergi göstermek için kullanılır. Daha da önemlisi, exon eklenmesi ve atlama-özel probları ile tespit sinyalleri güvenilir değerlerde Nf1 exon 23a ifade bir fare beynin farklı anatomik bölgelerde spliced yüzdesini hesaplamak için kullanılabilir. Deneysel protokol ve hesaplama yöntemi için analiz olarak sunulmaktadır. Sonuçlar BaseScope ifade desenleri in situdeğerlendirmek için güçlü bir yeni araç sağlar gösterir.
Introduction
Alternatif dikişi (AS) pre-mRNA olgunlaşma sırasında oluşan ortak bir süreçtir. Bu süreçte bir exon differentially olgun mRNA dahil edilebilir. Böylece, AS ile bir gen birçok mRNA'ların farklı protein ürünleri için bu kodu oluşturabilirsiniz. Bu tahmin edilmektedir insan genlerinin % 92-94 alternatif dikişi1,2tabi. Anormal alternatif uçbirleştirme desenleri sonuçlandı genetik mutasyonlar hastalıklar, amyotrofik lateral skleroz, miyotonik distrofi ve kanser3,4de dahil olmak üzere çok sayıda bağlantılı. Böylece araştırmak ve alternatif alışılageldik düzenleyici mekanizmaları insan hastalıkların yeni tedaviler bulmak için bir girişim daha iyi anlamak önemlidir.
GİBİ sık sık bir hücre türüne özgü biçimde düzenlenmiştir. Belirli bir biyolojik sisteminin belirli bir gen AS ifade desenini belirlemek önemlidir. Hücreleri, beyin veya kalp, gibi birçok farklı türde içeren karmaşık bir organ okudu ancak bu karmaşık olur. Bu durumda, ideal bir tahlil sisteminin belirli bir gen AS ifade desen birçok hücre tiplerinde aynı anda tespit edilebilir böylece RNA in situ hibridizasyon (ISH) doku kullanarak bölümleri seçimdir. Nitekim, exon özgü probları bir alternatif exon5,6,7' nin ifade düzeylerini değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, bu yaklaşım aşağıdaki nedenlerden dolayı iyi desen analiz için uygun değildir. İlk, geleneksel ISH yöntemleri genellikle probları 300'den daha uzun kullanın bp, omurgalı iç ekzonlar (değil ilk veya son exon) ortalama büyüklüğü 170 nükleotit8,9iken. Exon özgü sonda bir iç alternatif exon alışılageldik paterni incelemek için kullanıldığında, ikinci olarak, sondası tarafından algılanan tek mRNA izoformu exon tespit edilemez olmadan, mRNA izoformu ise exon içeren sıradır. Böylece, hesaplama için alternatif exon (PSI) değerindeki spliced yüzde karmaşıktır. Ayrıca, geleneksel floresan ISH kez ISH algılama verimliliği ve sağlamlık azaltan immunostaining ile bir araya getirir. Örneğin, stres kaynaklı araştırıldı bir çalışmada izoformu asetilkolinesteraz (ağrı) geçiş Uçbirleştirme mRNA, digoxigenin ISH sondayı dahil oldu ve anti-digoxigenin antikor kullanarak algılandı. Alternatif olarak, biotin etiketli sonda bir alkali fosfataz/streptavidin eşlenik ve alkalen fosfataz10için bir substrat tarafından tespit edildi. Ben de yöntemi herhangi bir güçlendirme stratejisi algılama hassasiyeti artırmak için kullanılır. Sonuç olarak, düşük seviyelerde ifade edilir mRNA transkript algılamak için meydan okuyor. Böylece, daha basit ve daha sağlam bir ISH tahlil sistem ifade desenleri in situanaliz etmek için gereklidir.
BaseScope son zamanlarda RNAscope, köklü bir platformda temel alınarak geliştirilmiş ve yaygın kullanılan ISH tahlil sistemi. Her iki tahlil sistemleri algılama11,12hassasiyeti artar bir hedef özgü güçlendirme teknolojisi kullanır. Birini diğerinden ayırt eder gibi kısa BaseScope için 50 nukleotid ve 300-1000 nükleotit RNAscope için hedef sırası uzunluğudur. Böylece, belirli alternatif mRNA izoformlarının algılamaya exon exon kavşak hedef tasarım probları mümkündür. Mevcut çalışmada, ifade desenleri nörofibromatozis 1 (Nf1) exon 23a, kapsamlı bir şekilde aynı laboratuvar13,14,15 ' te okudu bir alternatif exon yazarken incelemek için bir yordam kuruldu , 16 , 17, fare beyin bölümlerde. Sonuçları BaseScope Nf1 exon 23a içinde in situifade desen çalışması için ideal bir sistem olduğunu ispat. Bu tahlil sistemi gibi birçok alternatif ekzonlar ifade desenleri analiz etmek için adapte edilebilir gibi güçlü bir yeni araç as çalışmalarda temsil eder
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler ilgili deneyler burada açıklanan Case Western Reserve Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması. Başlık 2016-0068 protokolünün (PI: Hua Lou) "alternatif pre-mRNA'ın porno versiyonunu omurgalı gelişiminde rolü" olduğunu.
Not: Bilgiler, tüm ekipman, reaktifler ve bu protokol için kullanılan malzemeleri Malzemeler tablovardır.
1. Formalin hazırlayın sabit parafin gömülü (FFPE) bölümleri
-
1 CD1 fare ve 1 C57BL/6J fare tarafından servikal çıkığı ötenazi. Dikkatle cerrahi makas ve forseps ile kafatası kesmiş. Beyin bir kepçe ile kaldırın.
Not: 5 aylık CD1 erkek fare ve 3 aylık C57BL/6J erkek fare kullanılan ve benzer sonuçlar ortaya koydu.- PBS ile beyin yıkama. Tüm beyin % 10 formalin, oda sıcaklığında (RT) içeren bir çözüm ile 50 mL formalin çözüm tüm beyin koyarak için 30 h düzeltmek.
- Sabitleme çözüm değiştirin PBS'ye ve PBS beyin gecede 4 ° C'de kuluçkaya Kurutmak ve Ksilen ve standart prosedürler18kullanarak parafin ile beyin embed.
-
Bir microtome katıştırılmış doku 5 µm bölümler halinde kesmek için kullanın. Parafin kurdele bir RT su banyosunda önce ve sonra şerit i yaymak için bir 45 ° C su banyosunda koyun.
- Hemen kırışıklıklar ve kıvrımlar Şerit'teki yok zaman bölümler cam slaytlarda bağlayın. Gecede RT. Bake slaytlar için kullanmadan önce 60 ° C'de 1 h, Kuru slaytlar hava.
2. örnek Önarıtma
-
Doku bölümleri deparaffinize. Bir duman başlık olarak bu adımları uygulayın.
- İki bulaşık (Şekil 1A) 250 mL taze ksilen ve iki ile 250 mL % 100 etanol doldurmak. Doku slaytlar çamaşır raf içinde Tablo 1' de belirtilen sipariş ve kuluçka zaman aşağıdaki bulaşık yıkama raf (Şekil 1A) ve yer ekleyin.
- Her kuluçka sırasında çamaşır raf daha--dan 3 kere yukarı ve aşağı çamaşır bulaşık kaldır. Her kuluçka sonra hızlı bir şekilde doku bölümleri kurumasını önlemek için sonraki çamaşır bulaşık yıkama raf taşıyın.
- Kuluçka adımları tamamladıktan sonra çamaşır bulaşık yıkama raf slaytlar ile kaldırın. Raf 5 min için veya slaytları tamamen kuru olana 60 ° C kuluçka makinesine koyun.
- Doku bölümü hidrofobik bariyer kalemle çevreleyen bir 0,75 '' x 0,75 '' bariyer çizin. Hava kuru 3 dk RT. az için bariyer
-
Dilim pretreat
- Reaktifler ve donanımları hazırlamak
- Hibridizasyon fırını (Şekil 1B) ve sıcaklık 40 ° c 30 dk kullanmadan önce ayarlayın.
- Distile su ile tamamen ıslak nemlendirici kağıt (Şekil 1E) ve nem kontrolü tepsi (Şekil 1 d, sol) koydu. Nem kontrol tepsiyi hibridizasyon fırında tutun.
- Taze 1 x hedef alma reaktifler 700 mL 10 x hedef alma reaktifler 70 mL için dH2O 630 mL ekleyerek hazırlayın.
- Hidrojen peroksit uygulanır.
- Deparaffinized slaytlar bankta koymak. Hidrojen peroksit 5 – 8 damla doku tamamen kapsayacak bir bölümüne ekleyin. 10 dakika dik, kuluçkaya
- Hidrojen peroksit çözümü, bir defada bir slayt kaldırmak için emici kağıt parçası üzerinde slaytlar dokunun. Hemen bir çamaşır askısı slaytı eklemeden ve raf dH2ile O. dolu bir çamaşır bulaşık gitme
- Yukarı ve aşağı distile su içinde raf taşıyarak slaytları yıkama 3 – 5 kez. Distile su ve yıkama slaytlar ile bir kez daha dolu bir çamaşır bulaşık yıkama raf taşıyın.
- Hedef alma gerçekleştirmek
- 1000 mL Cam kabı sıcak bir tabağa yerleştirin. Taze 1 x hedef alma reaktifler 700 mL kabı ekleyin ve folyo ile kapatın. Ölçek folyo kapak (Şekil 1 c) aracılığıyla bir termometre yerleştirin. Sıcak plaka üzerinde açın ve 10-15 dk yüksek ayarlayın.
- Alma reaktifler sıcaklığını 98 ° C ulaştığında, sıcak plaka sıcaklık kontrolünü hafif çıban korumak için düşük yüksek geçin. 15 dk daha kaynatın değil.
- Bu arada, dikkatli bir şekilde folyo aç ve çamaşır raf içinde alma regent dilimlerle koy. Kabı tekrar kapak ve 15dk için kuluçkaya.
- DH2O ve durulama 15 için 200 mL ile raf bir çamaşır yemek kabı kaldırmak için kullanım forseps dolu s.
- Raf % 100 taze etanol içeren bir çamaşır bulaşık taşımak ve 3 dk. slaytlar kaldırmak ve onları 10 dk 60 ° C Kuluçka Makinası için oturup bekleyin.
- Proteaz III uygulamak
- Slaytları leke raf (Şekil 1 d, sağ) yerleştirin. Proteaz doku kapsayacak şekilde III 5 damla ekleyin. Dikkatle raf nem kontrol tepsi (Şekil 1 d, sol) yerleştirebilir ve tepsiyi 40 ° C hibridizasyon fırın içine takabilirsiniz. 30 dk için kuluçkaya.
- Slayt rafa kaldırmak ve tepsiyi fırına koy. Aşırı sıvı, bir defada bir slayt kaldırmak için slaytlar dokunun. Bir çamaşır rafa slaytı eklemeden ve yer çamaşır bulaşık içinde raf raf slaytlar için yukarı ve aşağı yıkamak için dH2ile O. hareket dolu 3 - 5 kez.
- Reaktifler ve donanımları hazırlamak
3. ISH tahlil
-
Malzemeleri hazırlamak
- 50 x 40 ° C kuluçka 20 dk. Mix 2.94 L dH2O ve 50 60 mL x 1 x yıkama tampon yapmak için yıkama arabellek için yıkama arabellek önceden ısıtmak.
- % 50 hematoksilen boyama çözüm Gill'in hematoksilen dH21 N amonyum hidroksit 1,43 mL 250 mL dH2O. karışımı ekleyerek O. Prepare %0.02 (w/v) Amonyaklı su 100 mL için bir kap içinde iyi 100 mL ekleyerek hazırlayın.
- Sonda ve AMP 0-6 koymak reaktifler RT 30 dk kullanmadan önce. Nem kontrol tepsiyi 40 ° C hibridizasyon fırında tutun.
-
ISH yordamı
Not: izoformlarının Uçbirleştirme Nf1 ifade inceleyin ve hesaplamak için exon 23a, exon izoformu 23a dahil, hedef üç farklı ISH problar (PSI) değerindeki spliced yüzde exon 23a hariç izoformu veya her iki izoformlarının kullanılan (Şekil 2 üzeresiniz ). Sondalar adjacently kesilmiş doku bölümler üzerinde kullanılır. Kritik üç doku bölümleri kabul edilir hesaplama doğruluğunu sağlamak için tam olarak aynı hibridizasyon, güçlendirme ve sinyal algılama adımda.- Hibridizasyon sonda.
- Slaytları çamaşır rafa kaldırmak ve slaytlardan aşırı sıvı dokunun. Slaytları leke rafa yerleştirin.
- Sonda adı ile slaytlar etiketlemek için bir kalem kullanın. Üç farklı Nf1 problar (Şekil 2) ile birlikte melezleşmiştir için üç adjacently kesilmiş beyin doku slayt koymak. Slaytların aynı sırada sonraki adımları uygulayın.
- Sonda doku kapsayacak şekilde 4 damla ekleyin. Bu bir slayt bölümleri kurumasını önlemek için bir anda yapmak. Leke raf içinde nem kontrol tepsi ve 2 h 40 ° C fırında içine yerleştirin.
- Slaytları iki kez arabellek yıkama ile yıkayın. Her yıkama için boyama bulaşık yıkama arabellek x 1 200 mL ile doldurun ve bir çamaşır rafa yerleştirin. Kağıt havlu bir slayt üzerindeki aşırı sıvı teker teker dokunun ve hızlı bir şekilde çamaşır raf ekleyebilirsiniz. Slayt raf yemek için yukarı ve aşağı hareket 3-5 defa için 2 dk az RT.
- İkinci yıkama için taze yıkama arabellek kullanın.
- Sinyal güçlendirme.
- Slaytları fazla yıkama arabelleğinden dokunun ve leke rafa koyun. Doku kapsayacak şekilde AMP 0 4 damla ekleyin. Leke raf içinde nem kontrol tepsi ve 40 ° C'de 30 dk fırında yerleştirin
- Slaytları iki kez arabellek yukarıda açıklandığı gibi yıkama ile yıkayın.
- 1-6 takip sipariş ve Tablo 2durumunu AMP ile bu adımı yineleyin. Slaytları iki kez her hibridizasyon adımdan sonra yıkayın.
- Sinyal algılama
- Slaytları fazla yıkama arabelleğinden dokunun ve leke rafa koyun. Hızlı kırmızı b 2 µL hızlı kırmızı 120 µL için ekleyin microcentrifuge tüp içinde (1:60 oranı). Mix iyi ve tam olarak doku bölümü kapsayacak şekilde ekleyin.
Not: Kırmızı a toplam hacim / B karışımı numarası ve doku bölümün boyutunu temel alır. 0,75 '' x 0,75 '' alan, 120 µL bir bölümü için yeterli. 5 dakika içinde karışımı kullanın ve mix doğrudan güneş ışığı veya UV ışık yay. - Kapatmak belgili tanımlık tepsi ve RT. Kaldır, 10 min için atık konteyner çözüm kuluçkaya ve hemen bir çamaşır raf slaytlar eklemek ve musluk suyu ile dolu bir çamaşır bulaşık raf yer. Tekrar taze musluk suyuyla durulayın.
- Slaytları fazla yıkama arabelleğinden dokunun ve leke rafa koyun. Hızlı kırmızı b 2 µL hızlı kırmızı 120 µL için ekleyin microcentrifuge tüp içinde (1:60 oranı). Mix iyi ve tam olarak doku bölümü kapsayacak şekilde ekleyin.
- Hibridizasyon sonda.
-
Slayt counterstaining
- Musluk suyundan çamaşır rafa kaldırmak ve hızlı bir şekilde ilave su kaldırmak için emici kağıt üzerine dokunun. Raf çözüm boyama % 50 hematoksilen koymak ve hemen raf birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dik, 2 min için kuluçkaya
- Slayt raf musluk suyu tabak içine aktarın. 3-5 kat raf yukarı ve aşağı hareket ve slaytları beyin dokuları mor kalırken, netlik kadar taze musluk suyu değiştirilerek yıkayın.
- Raf %0.02 Amonyaklı su içeren bir yemek için hareket. Dokular maviye kadar raf 2-3 kez yukarı ve aşağı hareket ettirin. Slaytlar 3-5 kat boyama bir tabak taze musluk suyu ile yıkayın.
-
Montaj örnekleri
- Slayt raf boyama yemek 60 ° C kuluçka taşımak ve slaytları tamamen kuru olana en az 15 dakikadır kuluçkaya.
- Orta slayt ve dikkatli bir şekilde montaj yer 40 µL 24 mm x 50 mm coverslip doku bölümünün üzerine yerleştirin. Hava kuru slaytlarını RT., 30 dk
4. veri toplama ve Analizi
Not: 40 X büyütmede görüntüleri taramak için bir slayt tarayıcı kullanın.
-
Pozitif ve negatif denetimleri
- Her deneme için pozitif ve negatif denetimler (Şekil 3) içerir. İyi bir pozitif kontrol sinyal 20-40 X büyütme punctate noktalar olarak görünür olmalıdır.
- Kullanım fare (Mm) - PPIB - 1ZZ pozitif kontrol olarak. Bu sonda bir genel temizlik hizmetleri gen PPIB hedefler. Negatif kontrol için kabul edilebilir her 20 X mikroskop alanı boyama arka plan görüntüleme her 20 hücrelere bir nokta var.
- DapB-1ZZ sonda bir negatif kontrol kullanın. Bu sonda bakteri gen dapB hedefler. Bu denetim probları birçok ISH deneyleri19' kullanılmıştır.
-
Sinyal algılama ve Nf1 exon 23a ifade kalıpları olarak Analizi
- Hibridizasyon sinyalleri punctate noktalardan olarak gösterilmiş, noktalar elle saymak. Nokta sayısı belirli bir yoklama ile tespit tutanakları düzeyiyle ilişkilidir. Not nokta sayısı da ImageJ veya SpotStudio yazılım tarafından analiz edilebilir.
- Üç sondalar exon 23a-içeren, exon izoformlarının 23a eksik veya toplam Nf1 transkript (Şekil 2) melezlemek için kullanın. Üç sondalar aynı anda kullanılamaz gibi her sonda melezlemek için üç bitişik beyin doku bölümleri kullanın.
- (PSI) exon 23a spliced yüzdesini hesaplamak için hücreleri ve bazı beyin bölgelerinde nokta sayısını saymak. Faiz her bölge için Şekil 4' te gösterildiği gibi birden fazla alt bölge üzerinden 400'den fazla hücreleri saymak.
- Aynı alt bölgelerdeki her üç sondalar için veri toplama. PSI exon 23a dahil sonda ile hücre başına nokta sayısı olarak hesaplamak / (exon 23a dahil sonda + hücre exon23a ile sonda atlama başına nokta sayısı ile hücre başına nokta sayısı) x %100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
BaseScope ISH üç fare suşları kullanılarak gerçekleştirildi: CD1 vahşi türü fareler, C57BL/6J vahşi türü fare ve hangi exon 23a bir sonucu olarak tüm hücre tipleri içinde dahil C57BL/6J arka plan Nf123aIN/23aIN mutant farelerde mühendislik splice sitesi mutasyonlar14,15.
İlk adım olarak, sağlanan şirket reaktifler kullanarak ISH tahlil sistem test edildi: 3T3 hücreleri ve negatif ve pozitif var slaytlar ISH sondalar. Pozitif kontrol sonda kullanıldığında birçok punctate noktalar tespit edildi ise negatif kontrol sonda kullanıldığında Şekil 3' te gösterildiği gibi hiçbir sinyal algılandı.
Ardından, ISH fare beyin bölümleri ve Nf1kullanılarak gerçekleştirilmiştir-exon 23a, içeren Nf1 transkript algılamak için tasarlanmış belirli probları atlamak exon 23a veya her iki izoformlarının (Şekil 2). Bu sonda belirli exon-exon kavşak hedef. İki beyin bölgeleri Nf1 exon 23a AS ifade paterni incelemek için seçildi: korteks ve hipokampus CA3 (Şekil 4). Her bölge için sayısı üç alt bölgeye, Şekil 4' te gösterildiği gibi hücre ve nokta numaraları kayıt. Her bölge için yaklaşık 400 hücreleri toplamda sayılır ve nokta/hücre oranı hesaplamak için kullanılır. AS ifade deseni için Nf1 exon 23a PSI hesaplanır.
ISH sinyalleri üç ile elde edilen Nf1 korteks sondaları ve hipokampus CD1 farelerin Şekil 5A' gösterilir-5F ve Tablo 3. C57BL/6J korteks bölgesinden Nf1+/ + ve Nf123aIN/23aIN fareler de analiz (Şekil 6).
Bu deneyler sonucu çeşitli sonuçlara yol açtı. Öncelikle, sinyalleri, nokta/hücre, exon 23a eklenmesi ve atlama özgü probları eşittir üç probları ile melezleşmiştir öneriyor sonda her iki izoformlarının (Tablo 3), hybridizing tarafından algılanan için tarafından algılanan olarak gösterilen toplamı Nf1 transkript benzer verimlilik ile. İkinci olarak, exon 23a korteks, % 10, PSI değerini içinde--dan yetişkin C57BL/6J fare beyin ardından toplam RNA izolasyon ve RT-PCR Analizi14,15korteks disseke daha önce raporlanmış RT-PCR sonucu ile tutarlıdır. Bu sonuç da anlaşılacağı BaseScope ISH kantitatif olarak ifade desenleri transkript düzeyleri doku bölümlerde ek olarak analiz etmek için kullanılabilir. Üçüncü olarak, hangi Nf1 transkript içeren exon 23a14,15, Nf123aIN/23aIN mutant beyin dokuları ile elde edilen sonuçlar gösterdi sinyalleri dahil özel zaman benzer düzeyleri ve Toplam probları kullanılmıştır Nf1 ve atlama-özel sonda kullanıldığında sinyal (Şekil 6), exon dahil hedefleme veya atlama iki problar çok özel olduğunu gösteren.
Şekil 1: makineleri içinde Ish. (A)bulaşık yıkama ve raf yıkama. (B) hibridizasyon fırın. (C) hedef alma kabı ve sıcak tabak seti. (D) nem tepsi kontrol ve raf leke. (E) kağıt nemlendirme nem kontrol tepsi içinde kırmızı bir ok ucu belirttiği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Probları Nf1 exon 23a gibi ifade desenleri algılamak için kullanılan. Tümü sondalar bir ZZ çifti oligonükleotid içerir. Ekzonlar kavşak dahil özel soruşturma (kırmızı) hedefleyen 23a ve 24, atlama-özel soruşturma (yeşil) hedefleyen ekzonlar 23 ve 24 kavşak ve ekzonlar 26 ve 27 kavşak Nf1 toplam sonda (mavi) hedefler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Negatif (A-B) ve 3T3 hücrelerde pozitif (C-D) denetimleri kullanarak Ish. 3T3 hücreleri içeren bir denetim slayt 2 (örnek Önarıtma) ve 3 (ISH yordam) iletişim kuralı yoluyla işlendi. Olumlu sinyaller kırmızı oklarla gösterilen Kırmızı punctate noktalar olarak gösterilir. B ve D Albümdeki yakınlaştırılmış A ve C, anılan sıraya göre. Ölçek çubuğu = 20 µm (A ve C); 5 mikron (B ve D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: resim bir fare beyin koronal bölümünün. Kırmızı kutuları, hücre ve sinyal rakamların korteks ve hipokampus CA3 bölgelerinde sayım için seçili alanları gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Nf1kullanarak tespit RNA ISH sinyalleri-belirli sonda ve fare beyin bölümleri. CD1 beyin protokol 1-4 adımda yoluyla işlenen. Kırmızı punctate noktalar olumlu gösteriyor ne zaman sinyalleri üç Nf1-belirli problar ( Şekil 3' te gösterilen) kullanılır. Korteks (A-C) ve hipokampus (D-F) gösterilir. NF1 Toplam sonda A kullanıldı ve D, K ve g dahil özel soruşturma ve atlama-özel yoklama C ve F. ölçek çubuğunda = 40 µm (A-C); 400 µm (D-F). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: RNA ISH sinyalleri tespit Nf1+/ + ve Nf123aIN/23aIN beyin bölümleri. Her iki fare suşları C57BL/6J arka planda vardır. Beyin protokol 1-4 adımda yoluyla işlendi. A-C. Nf1+/ + korteks. D-F. Nf123aIN/23aIN korteks. Nf1 toplam sonda A kullanıldı ve D, K ve g dahil özel soruşturma ve atlama-özel yoklama C ve F. ölçek çubuğunda 40 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Kuluçka sırasını | TT tabak içinde kimyasallar | Zaman |
| 1 | ksilen 250 mL | 5 dk |
| 2 | ksilen 250 mL | 5 dk |
| 3 | % 100 etanol 250 mL | 2 dk |
| 4 | % 100 etanol 250 mL | 2 dk |
Tablo 1: Kuluçka prosedürü adım 2.1.1.
| AMP çözüm | Kuluçka süresi | İnkübasyon sıcaklığı |
| AMP 1 | 15 dk | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 dk | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 dk | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 dk | 40 ° C |
| AMP 5-KIRMIZI | 30 dk | Oda sıcaklığında |
| AMP 6-KIRMIZI | 15 dk | Oda sıcaklığında |
Tablo 2: Sinyal güçlendirme prosedürü adım 3.2.2.
| Bölge | atlama | dahil etme | atlama + eklenmesi | Toplam | PSI |
| korteks | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3,22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5,56 | 5.65 | 3.71 |
Tablo 3: RNA ISH sonuçları hesaplanan Şekil 5' te gösterilen görüntüden. Nokta/hücresinde gösterilen sayılar, korteks ve CA3 üç alt bölgede dahil 400'den fazla hücreleri kullanılarak hesaplanmıştır (Şekil 4). Standart hataları dahil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim raporları BaseScope RNA ISH fare beyin bölümleri ifade desenleri olarak incelemek için kullanın. Bu anti-anlamda exon-exon junction 50 nukleotid exon içerme ve sağlam ve özellikle izoformlarının atlama hedefleyebilirsiniz daha kısa probları gösterilmiştir. Ayrıca, elde edilen sinyalleri bir alternatif exon PSI hesaplamak için kullanılabilir.
Birkaç varyasyon yordamda test edildi. Örneğin, donmuş doku bölümleri cryostat kesit tarafından oluşturulan test ve bu ISH iletişim kuralını kullanmak için başarılı olduğu gösterilmiştir. Bu durumda, ancak, 2.1 deparaffinization adımda, Ekim PBS ile 5 min için yıkama için değiştirildi. Buna ek olarak, ACD tarafından sağlanan hibridizasyon fırın kullanmak çok uygun olmasına karşın, immünhistokimya için kullanılan tepsi boyama bir slayt ile birlikte 40 ° C'de ayarla basit bir kuluçka makinesi kullanımı benzer sonuçlar verir. Önemli olan kutusunda Islak filtre kağıtları prosedürü boyunca ekleyerek nem tutmaktır.
Bu yordamdaki bir kısıtlamadır. Şu anda, çok renkli aynı doku slayt üzerinde etiketleme gerçekleştirmek mümkün değildir. Böylece, farklı sondalar sadece adjacently kesim, farklı bölümlerde kullanılabilir. Doğru PSI değerleri elde etmek için sonda hibridizasyon, kuluçka zaman sinyal güçlendirme ve algılama her doku bölüm için aynı olduğundan emin olmak için önemlidir. Gelecekte, çok renkli sonda kullanımı aynı doku slayt üzerinde uygulama RNAscope yordamlarda kullanılan son derece cazip olacaktır.
Bu raporda açıklanan RNA ISH kantitatif ifade desenleri in situanaliz etmek için güçlü bir yeni araç sağlar. Bu teknoloji pek çok alternatif ekzonlar çalışmaya uygulanır. Son raporda, sinir hücreleri ve oligodendrocytes hücresel çözünürlük20izoformlarının Uçbirleştirme fark ifade şekillerinin dört ErbB4 incelemek için başarıyla kullanıldı. Bu ve diğer pek çok rapor içinde gösterildiği gibi BaseScope RNA ISH kombinasyonu ile İmmünokimya yerelleştirme ve işlev differentially ifade alışılageldik izoformlarının6,20eğitim için güçlü bir yaklaşım olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser [Grant-in-Aid 0365274B H.L. için], Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen Ulusal Kanser Enstitüsü [GI SPORE P50CA150964] Z.W. için Ulusal Sağlık Enstitüleri [Office of araştırma altyapı paylaşılan araçları Grant S10RR031845 için Işık mikroskobu] Case Western Reserve Üniversitesi tesisinde görüntüleme ve Çin burs Konseyi'ne [X.G.].
Yazarlar ile slayt tarama ışık mikroskobu Imaging Core için onun yardım etmek içinde Richard Lee teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
