Summary
Se describe un protocolo en situ hibridación (ISH) que utiliza oligonucleótidos antisentidos corto para detectar patrones de splicing alternativo del pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón.
Abstract
Empalme alternativo (AS) ocurre en más del 90% de genes humanos. El patrón de expresión de un exón alternativamente empalmado a menudo está regulado de manera específica de tipo celular. COMO expresión patrones típicamente son analizados por RT-PCR y RNA-seq con muestras de RNA aislados de una población de células. In situ examen de como patrones de la expresión de una particular estructura biológica puede realizarse por el RNA en situ hibridación (ISH) utilizando sondas exón específico. Sin embargo, este uso particular del ISH ha sido limitada porque exones alternativos son generalmente demasiado cortos para el diseño de sondas exón específico. En este informe, el uso de BaseScope, una tecnología recientemente desarrollada que emplea cortos oligonucleótidos antisentidos en ARN ISH, se describe a analizar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Exón 23a de neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) se utiliza como ejemplo para ilustrar que corta exón-exón cruce sondas exhiben señales de hibridación robusto con alta especificidad en el análisis de ARN ISH en secciones de cerebro de ratón. Más importante aún, las señales detectadas con exón específico inserción y saltar las puntas de prueba pueden utilizarse para calcular fiablemente el porcentaje empalmado en los valores de expresión de 23a exón de Nf1 en diferentes áreas anatómicas del cerebro de un ratón. Presentan el protocolo experimental y el método de cálculo para análisis. Los resultados indican que BaseScope proporciona una nueva herramienta poderosa para evaluar como los patrones de expresión en situ.
Introduction
Empalme alternativo (AS) es un proceso común que ocurre durante la maduración del pre-mRNA. En este proceso, un exón puede incluirse diferencialmente en el mRNA maduro. Así, a través de AS, un gen puede generar mRNAs muchos ese código para productos diferentes de proteínas. Se estima que 92 – 94% de los genes humanos sufrir splicing alternativo del1,2. Alternativa anormal empalme patrones resultado de mutaciones genéticas se han ligado a un gran número de enfermedades, como esclerosis lateral amiotrófica, distrofia miotónica, cáncer3,4. Por lo tanto es crucial investigar y comprender mejor los mecanismos de splicing alternativos en un intento de encontrar nuevos tratamientos de enfermedades humanas.
COMO a menudo se regula de manera específica de tipo celular. Es importante determinar el patrón de expresión de AS de un gen específico en un sistema biológico dado. Sin embargo, esto se complica cuando se estudia un órgano complejo que contiene muchos tipos diferentes de células, como el cerebro o el corazón. En este caso, una opción ideal de sistema de ensayo es RNA en situ hibridación (ISH utilizando) las secciones por lo que el modelo AS de expresión de un gen específico puede ser detectado en muchos tipos celulares simultáneamente. De hecho, se han utilizado sondas exón específico para evaluar los niveles de expresión de un exón alternativo5,6,7. Sin embargo, este enfoque no es adecuado para análisis del patrón por las siguientes razones. En primer lugar, convencionales métodos ISH suelen utilizan sondas de más de 300 bp, mientras que el tamaño promedio de exones internos vertebrados (no primer o último exón) es 170 nucleótidos8,9. En segundo lugar, cuando una sonda de exón específico se utiliza para examinar el patrón de corte y empalme de un exón alternativo interno, la única isoforma de mRNA detectada por la sonda es la que contiene el exón, mientras que la isoforma de mRNA sin el exón no puede ser detectado. Así, el cálculo por ciento empalmado en valor (PSI) para el exón alternativo es complicado. Además, ISH fluorescente convencional a menudo combina ISH con inmunotinción, que reduce la eficiencia de la detección y la robustez. Por ejemplo, en un estudio que investigó la tensión inducida empalme isoform de la conmutación de la acetilcolinesterasa (AChE) mRNA, digoxigenina fue incorporado en la sonda ISH y detectado usando anticuerpo anti-digoxigenina. Alternativamente, la sonda marcada con biotina fue detectado por un conjugado de fosfatasa alcalina/estreptavidina y sustrato para fosfatasa alcalina10. Ni método utiliza cualquier estrategia de amplificación para aumentar la sensibilidad de detección. Como resultado, es difícil detectar las transcripciones del mRNA que se expresan en niveles bajos. Por lo tanto, es necesario un sistema de análisis ISH más simple y más robusto para analizar patrones de expresión en situ.
BaseScope es un reciente desarrollo basado en la plataforma de RNAscope, una bien establecida y ampliamente utilizado sistema de ensayo ISH. Ambos sistemas de ensayo emplean una tecnología de amplificación específico del destino que aumenta la sensibilidad de detección11,12. Lo que distingue una de la otra es la longitud de la secuencia de destino, que es tan corta como 50 nucleótidos para BaseScope y 300-1.000 nucleótidos de RNAscope. Por lo tanto, es posible sondas de diseño dirigidos a uniones exón-exón para detectar específico alternativo mRNA isoforms. En el presente estudio, se estableció un procedimiento para examinar como patrones de expresión de la neurofibromatosis tipo 1 (Nf1) exón 23a, un exón alternativo estudiado en el mismo laboratorio13,14,15 , 16 , 17, en secciones de cerebro de ratón. Los resultados demuestran que el BaseScope es un sistema ideal para el estudio de patrones de expresión de Nf1 exón 23a in situ. Como este sistema de análisis puede ser adaptado para analizar como patrones de expresión de muchos exones alternativos, representa una poderosa nueva herramienta en los estudios de AS.
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Protocol
Todos los experimentos descritos aquí que involucran ratones han sido aprobados por la Comisión de uso y de caso Western Reserve University institucional Animal Care. El título del protocolo 2016-0068 (PI: Hua Lou) es "Papel de splicing alternativo del pre-mRNA en el desarrollo de vertebrados".
Nota: Se incluye información de todos los equipos, reactivos y suministros utilizados en el presente Protocolo en la Mesa de materiales.
1. preparar formalina parafina fijo encajado (FFPE) secciones
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Eutanasia 1 ratón CD1 y 1 ratón C57BL/6J por dislocación cervical. Cuidadosamente corte el cráneo con tijeras quirúrgicas y pinzas. Quitar el cerebro con una cuchara.
Nota: ratones machos de 5 meses CD1 y ratones machos de 3 meses C57BL/6J se utiliza y mostraron resultados similares.- Lavar el cerebro con PBS. Fijar todo el cerebro con una solución que contiene 10% de formalina a temperatura ambiente (RT) de 30 h poniendo todo el cerebro en 50 mL de la solución de formalina.
- Cambiar la solución fijadora a PBS e incubar el cerebro en PBS durante la noche a 4 ° C. Deshidratar e incrustar el cerebro con xileno y parafina usando procedimientos estándar de18.
-
Utilizar un micrótomo para cortar tejidos embebidos en 5 secciones de μm. Poner la cinta de la parafina en baño de agua RT primero y después en un baño de agua de 45 ° C para difundir la cinta.
- Cuando desaparecen las arrugas y pliegues en la cinta, inmediatamente montar secciones en portaobjetos de vidrio. Aire seco diapositivas durante la noche en diapositivas RT. Cueza al horno por 1 h a 60 ° C antes de usar.
2. pretratamiento de la muestra
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Desparafinizar cortes de tejido. Llevar a cabo estos pasos en una campana de humos.
- Llene dos lavando platos (figura 1A) con 250 mL de xileno fresco y dos con 250 mL de etanol al 100%. Insertar diapositivas de tejidos en un estante de lavado (figura 1A) y el lavado del estante en lavar los platos después de la orden e incubación el tiempo indicado en la tabla 1.
- Durante cada incubación, levante la rejilla de lavado hacia arriba y hacia abajo más de 3 veces en el plato de lavado. Después de cada incubación, mover rápidamente la canasta de lavado en el siguiente plato lavarse para evitar que las secciones de tejido se seque.
- Después de completar los pasos de la incubación, saque la rejilla de lavado con diapositivas del plato de lavado. Coloque la rejilla en una incubadora de 60 ° C por 5 minutos o hasta que las diapositivas estén completamente secas.
- Dibujar una 0,75 '' x 0,75 '' barrera alrededor de la sección del tejido con un bolígrafo de la barrera hidrofóbica. Secar la barrera por 3 min a TA.
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Prepare las rebanadas
- Preparar reactivos y equipos
- Encender el horno de hibridación (figura 1B) y la temperatura a 40 ° C 30 min antes de su uso.
- Moje el papel de humidificación (Figura 1E) con agua destilada completamente y poner en bandeja de control de humedad (figura 1, izquierda). Mantener la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación.
- Preparar 700 mL de dulce 1 x objetivo recuperación de reactivos mediante la adición de 630 mL de dH2O a 70 mL de 10 x objetivo recuperación de reactivos.
- Aplicar peróxido de hidrógeno.
- Poner los portaobjetos deparaffinized en el Banco. Agregar 5 – 8 gotas de peróxido de hidrógeno a una sección para cubrir completamente el tejido. Incubar por 10 min a TA.
- Toque en las diapositivas en una hoja de papel absorbente para retirar la solución de peróxido de hidrógeno, una diapositiva a la vez. Insertar la diapositiva en un rack de lavado inmediatamente y mueve el estante a un plato de lavado con dH2O.
- Lavar los portaobjetos moviendo la rejilla hacia arriba y hacia abajo en agua destilada durante 3 a 5 veces. Hacia la canasta de lavado un plato de lavado llenado con agua destilada y diapositivas de lavado una vez más.
- Realizar recuperación de destino
- Coloque un vaso de precipitados de vidrio de 1000 mL en una placa caliente. Agregar 700 mL de dulce 1 x objetivo recuperación de reactivos en el vaso y cubrir con papel de aluminio. Inserte un termómetro en el vaso a través de la cubierta de aluminio (figura 1). Encender la placa y en alto durante 10 – 15 minutos.
- Cuando la temperatura de los reactivos de recuperación alcanza los 98 ° C, pasar el control de la temperatura de la placa de alto a bajo para mantener un hervor suave. No hervir más de 15 minutos.
- Mientras tanto, cuidadosamente abra la hoja y colocar la rejilla de lavado con rebanadas dentro el regente de la recuperación. Cubrir el vaso otra vez e incubar durante 15 minutos.
- Uso de fórceps para extraer la rejilla el vaso a un plato de lavado llenan con 200 mL de dH2O y enjuague por 15 s.
- Mueve el estante a un plato de lavado que contiene etanol fresco 100% y dejar reposar por 3 minutos eliminar diapositivas y seca en una incubadora de 60 ° C durante 10 minutos.
- Proteasa III se aplican
- Coloque el portaobjetos sobre la parrilla de tinción (figura 1, derecha). Añadir 5 gotas de proteasa III para cubrir el tejido. Con cuidado ponga la rejilla en la bandeja de control de humedad (figura 1, izquierda) e Introduzca la bandeja en el horno de hibridación de 40 ° C. Incubar durante 30 minutos.
- Retire la parrilla y coloque la bandeja en el horno. Toque el portaobjetos para eliminar el exceso de líquido, una diapositiva a la vez. Insertar la diapositiva en un rack de lavado y lugar la parrilla en un plato de lavado lleno de dH2O. mover el estante hacia arriba y hacia abajo para lavar los portaobjetos para 3 - 5 veces.
- Preparar reactivos y equipos
3. ISH ensayo
-
Preparar materiales
- Pre-calentar 50 x de tampón de lavado en una incubadora de 40 ° C durante 20 min mezcla 2.94 L dH2O y 60 mL de 50 x de tampón de lavado para hacer 1 x de tampón de lavado.
- Preparar solución tinción hematoxilina al 50% mediante la adición de 100 mL de hematoxilina de Gill I a 100 mL de dH2O. Prepare agua de amoníaco 0,02% (p/v) añadiendo 1,43 mL de hidróxido de amonio N 1 a 250 mL de dH2O. mezcla bien en un recipiente.
- Poner las puntas de prueba y AMP 0 – 6 reactivos a RT 30 min antes de su uso. Mantener la bandeja de control de humedad en el horno de hibridación de 40 ° C.
-
Procedimiento ISH
Nota: Para examinar la expresión de la Nf1 isoformas de empalme y calcular el porcentaje empalmado en valor (PSI) para el exón 23a, tres diferentes sondas ISH que exón 23a-incluido isoforma, exón excluidos 23a isoforma o ambas isoformas son usadas (figura 2 ). Las sondas se utilizan en las secciones de tejido adyacente corte. Para asegurar la exactitud del cálculo, es crítico que las secciones de tres tejido tratan exactamente el mismo en los pasos de detección de hibridación y amplificación de señal.- Sonda de hibridación.
- Quite las diapositivas de la canasta de lavado y aprovechar el exceso de líquido de las diapositivas. Coloque el portaobjetos en el canal de la mancha.
- Utilice un lápiz para rotular los portaobjetos con el nombre del sondeo. Poner las diapositivas de tejido cerebral adyacente corte tres que se hibridó con tres sondas diferentes de Nf1 (figura 2) juntos. Llevar a cabo los pasos siguientes en el mismo orden de diapositivas.
- Añadir 4 gotas de la sonda para cubrir el tejido. Do esta una diapositiva a la vez para evitar que las secciones se seque. Coloque la rejilla de la mancha en la bandeja de control de humedad e introducirlo en el horno de 40 ° C por 2 h.
- Lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado. Para cada lavado, llenar la cubeta de tinción con 200 mL de 1 x de tampón de lavado y ponga una rejilla de lavado en el mismo. Aprovechar el exceso de líquido sobre un un portaobjetos papel toalla en un momento y rápidamente lo introduzca en la canasta de lavado. Mueva la parrilla hacia arriba y hacia abajo en el plato para 3 a 5 veces por 2 min a TA.
- Para el segundo lavado Utilice el tampón de lavado fresco.
- Amplificación de la señal.
- Toque en el tampón de lavado excesiva de las correderas y los coloque en el canal de la mancha. Añadir 4 gotas de AMP 0 para cubrir el tejido. Coloque la rejilla de la mancha en la bandeja de control de humedad e introducir en el horno durante 30 min a 40 ° C.
- Lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado como se describió anteriormente.
- Repita este paso con AMP 1 al 6 siguiendo el orden y la condición del cuadro 2. Lave los portaobjetos dos veces después de cada paso de hibridación.
- Detección de señal
- Toque en el tampón de lavado excesiva de las correderas y colóquelas en mancha rack. Añadir 2 μl de rápido rojo B a 120 μl de Fast Red (relación de 1: 60) en un tubo de microcentrífuga. Mezclar bien y añadir para cubrir completamente la sección del tejido.
Nota: El volumen total de la Red A mezcla B se basa en el número y tamaño de las secciones de tejido. Para un área de 0,75 '' x 0,75 '', 120 μl es suficiente para una sección. Utilizar la mezcla dentro de 5 minutos y evitar la exposición de la mezcla a la luz solar directa o luz ultravioleta. - Cerrar la bandeja e incubar 10 min a RT. Retire la solución a un contenedor de basura inmediatamente Inserte las diapositivas en un rack de lavado y coloque la parrilla en un plato de lavado con agua del grifo. Enjuague nuevamente con agua fresca del grifo.
- Toque en el tampón de lavado excesiva de las correderas y colóquelas en mancha rack. Añadir 2 μl de rápido rojo B a 120 μl de Fast Red (relación de 1: 60) en un tubo de microcentrífuga. Mezclar bien y añadir para cubrir completamente la sección del tejido.
- Sonda de hibridación.
-
Contratinción de las diapositivas
- Retire la rejilla de lavado del agua de golpecito y rápidamente Pulse sobre papel absorbente para eliminar el agua extra. Poner la rejilla en una 50% la hematoxilina solución de tinción e inmediatamente mueve el estante arriba y abajo varias veces. Incubar durante 2 min a TA.
- Transferencia de la parrilla corrediza en el plato de agua del grifo. Lavar 3 – 5 veces mover el estante hacia arriba y hacia abajo y cambiando el agua fresca del grifo hasta que las diapositivas se convierten en claras, mientras que los tejidos cerebrales siendo púrpura.
- Mueve el estante a un plato que contiene agua de amoníaco 0,02%. Mover el estante hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces hasta que los tejidos se vuelven azules. Lave los portaobjetos 3 a 5 veces con agua de grifo en una cubeta de tinción.
-
Montaje de las muestras
- Mover la parrilla de la cubeta de tinción a una incubadora de 60 ° C e incube durante al menos 15 minutos hasta que las diapositivas estén completamente secas.
- 40 μl de medio de montaje sobre el portaobjetos y coloque cuidadosamente un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm en la sección del tejido. Aire seco diapositivas por 30 min a TA.
4. Análisis y recopilación de datos
Nota: Utilizar un escáner de diapositivas para escanear las imágenes con 40 aumentos.
-
Controles positivos y negativos
- Para cada experimento, incluir controles positivos y negativos (figura 3). Como un buen control positivo, señal debe ser visible como punteadas puntos con aumentos de 20-40.
- Uso del ratón (Mm) 1ZZ - PPIB - como control positivo. Este sondeo apunta a un gen común de limpieza PPIB. Para el control negativo, un punto a cada 20 células Mostrar fondo tinción por campo de microscopio de 20 X es aceptable.
- Usar la sonda DapB-1ZZ como control negativo. Este sondeo apunta la dapB gen bacteriano. Estas puntas de prueba de control se han utilizado en muchos ensayos ISH19.
-
Detección de señales y análisis de patrones de expresión de Nf1 exón 23a
- Como las señales de hibridación se indican como puntos punteadas, contar los puntos manualmente. El número de puntos se correlaciona con el nivel de las transcripciones que es detectado por un sensor específico. Tenga en cuenta que el número de puntos también puede ser analizado por el software ImageJ o SpotStudio.
- Utilice tres sondas para hibridar a exón que contiene 23a, exón 23a falta isoformas o transcripciones de Nf1 total (figura 2). Como las tres puntas de prueba no pueden utilizarse al mismo tiempo, utilizar tres secciones de tejido cerebral adyacente para hibridar a cada sonda.
- Para calcular el porcentaje empalmado en (PSI) para el exón 23a, contar el número de puntos en varias regiones del cerebro y las células. Para cada región de interés, cuenta más de 400 células de varias subregiones como se indica en la figura 4.
- Recopilar datos de las mismas subregiones de cada uno de los tres sondeos. Calcular PSI como número de puntos por la célula con la sonda de inserción exón 23a / (número de puntos por celular con la sonda de inserción exón 23a + número de punto por la célula con la exon23a salta sonda) x 100%.
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Representative Results
BaseScope ISH se llevó a cabo utilizando tres cepas de ratón: CD1 tipo salvaje ratones, C57BL/6J tipo salvaje ratones y ratones mutantes Nf123aIN/23aIN en el fondo de C57BL/6J, en qué exón 23a está incluido en todos los tipos de células como resultado del sitio del empalme de ingeniería las mutaciones14,15.
Como primer paso, el sistema de ensayo ISH fue probado utilizando los reactivos de la empresa proporcionado: sondas de ISH de diapositivas que tienen las células 3T3 y negativo y positivo. Como se muestra en la figura 3, no se detectó ninguna señal cuando la sonda de control negativo se utilizó, mientras que muchos puntos punteadas fueron detectados cuando la sonda de control positivo se utilizó.
A continuación, ISH se llevó a cabo mediante secciones de cerebro de ratón y de Nf1-sondas específicas que están diseñadas para detectar las transcripciones de la Nf1 que contienen exón 23a, omitir el exón 23a o ambas isoformas (figura 2). Estas puntas de prueba objetivo a uniones exón-exón específico. Se seleccionaron dos regiones del cerebro para examinar el patrón de expresión de AS de Nf1 exón 23a: corteza e hipocampo CA3 (figura 4). Para cada región, cuenta tres subregiones, como se indica en la figura 4, grabación de números de celular y punto. Para cada región, aproximadamente 400 células fueron contadas en total y permite calcular el cociente de puntos de la célula. El patrón de expresión de AS para Nf1 exón 23a se calcula como PSI.
La ISH señales obtenidas con los tres sondas de Nf1 en la corteza y el hipocampo de los ratones CD1 se muestran en la figura 5A-5F y tabla 3. La región de la corteza de C57BL/6J Nf1+ / + y ratones Nf123aIN/23aIN también fue analizado (figura 6).
El resultado de estos experimentos llegado a varias conclusiones. Primero, la suma de las señales, que se muestra como puntos/célula, detectada por exón 23a sondas específicas de inserción y saltar igual a la detectada por la sonda de hibridación de ambas isoformas (tabla 3), que sugiere que las tres sondas hibridación con la Nf1 transcripciones con similar eficacia. En segundo lugar, el valor PSI del exón 23a en corteza, 10%, es coherente con el resultado previamente divulgado de RT-PCR, en la cual fue disecada corteza de cerebro de ratón C57BL/6J adulto seguido de total aislamiento de RNA y RT-PCR Análisis14,15. Este resultado sugiere que el ISH BaseScope puede utilizarse para analizar cuantitativamente como patrones de expresión además de los niveles de transcripción en las secciones de tejido. En tercer lugar, los resultados obtenidos con los tejidos de cerebro mutante de Nf123aIN/23aIN , en el que todas las transcripciones de Nf1 contienen exón 23a14,15, mostraron niveles similares de señales cuando específicos de inclusión y Nf1 se utilizaron las puntas de prueba total y no hay señal cuando se utilizó la sonda específica de salto (figura 6), indicando que las dos sondas dirigidas a la inclusión del exón o saltar son altamente específicas.
Figura 1: equipo utilizado en ISH. (A) plato de lavado y lavar la rejilla. (B) horno de hibridación. (C) objetivo conjunto de vaso y plato caliente de recuperación. Humedad (D) control bandeja y estante de la mancha. (E) papel de humectación indicado por una flecha roja en la bandeja de control de humedad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Las puntas de prueba usan para detectar Nf1 exón 23a como patrones de expresión. Todas las puntas de prueba contienen un ZZ par de oligonucleótidos. La sonda de inserción específicos (roja) apunta a la Unión de los exones 23a y 24, la sonda específica de saltar (verde) objetivos de la Unión de los exones 23 y 24, y la punta de prueba total de Nf1 (azul) dirige la Unión de los exones 26 y 27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: ISH con negativo (A-B) y controles positivos (C-D) en las células 3T3. Un control deslizante que contiene las células 3T3 fue procesada a través de pasos 2 (pretratamiento de la muestra) y 3 (procedimiento de ISH) en el protocolo. Señales positivas se muestran como puntos rojos punteadas indicados por flechas rojas. B y D son zoom en las imágenes de A y C, respectivamente. Barra de escala = 20 μm (A y C); 5 μm (B y D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: imagen de una sección coronal del cerebro de ratón. Los cuadros rojos indican las áreas seleccionadas para el recuento de números de celular y señal en regiones de corteza e hipocampo CA3. Barra de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Señales de ARN ISH detectadas con Nf1-sondas específicas y ratón secciones del cerebro. CD1 cerebros fueron procesados a través de los pasos 1-4 en el protocolo. Rojo punteado indica positivo señales cuando los tres Nf1-se utilizan sondas específicas (se muestra en la figura 3). Corteza (A-C) y el hipocampo (D-F) se muestran. NF1 sonda total fue utilizado en el A y D, sonda de inserción específicas en B y E y sonda específica saltando en C y F. escala bar = 40 μm (A-C); 400 μm (D-F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: ARN ISH señales detectadas en Nf1+ / + y secciones del cerebro Nf123aIN/23aIN . Ambas cepas de ratón son en el fondo de C57BL/6J. Los cerebros fueron procesados a través de los pasos 1-4 en el protocolo. A-C. Nf1+ / + corteza. D-F. Corteza de Nf123aIN/23aIN . Punta de prueba total de Nf1 fue utilizado en el A y D, sonda de inserción específicas en B y E y sonda específica saltando en C y F. escala bar = 40 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Orden de incubación | Productos químicos en plato de TT | Tiempo |
| 1 | 250 mL de xileno | 5 min |
| 2 | 250 mL de xileno | 5 min |
| 3 | 250 mL de etanol al 100% | 2 min |
| 4 | 250 mL de etanol al 100% | 2 min |
Tabla 1: Procedimiento de incubación de paso 2.1.1.
| Solución AMP | Tiempo de incubación | Temperatura de incubación |
| AMP 1 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 min | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 min | 40 ° C |
| AMP 5-ROJO | 30 min | Temperatura ambiente |
| AMP 6-ROJO | 15 min | Temperatura ambiente |
Tabla 2: Señal de procedimiento de amplificación de paso 3.2.2.
| Región | saltar | inclusión | Salta + inclusión | total | PSI |
| corteza | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5.56 | 5.65 | 3.71 |
Tabla 3: ARN ISH resultados calculan a partir de la imagen se muestra en la figura 5. Los números que aparecen en puntos/célula, se calcularon mediante las células de más de 400 que se incluyen en las tres subregiones en la corteza y CA3 (figura 4). Se incluyen los errores estándar.
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Discussion
Esta comunicación informa el uso de BaseScope ARN ISH para examinar como patrones de la expresión en secciones de cerebro de ratón. Está demostrado que empalme exón-exón de anti-sentido sondas de menos de 50 nucleótidos pueden dirigirse a inclusión de exón y saltar isoformas robusta y específicamente. Además, la señal resultante puede utilizarse para calcular PSI de un exón alternativo.
Se analizaron algunas variaciones en el procedimiento. Por ejemplo, secciones congeladas del tejido generadas dividiendo el criostato fueron probadas y demostradas ser exitosa para el uso de este protocolo ISH. En este caso, sin embargo, el paso de la parafina en la 2.1 fue cambiado a lavado de OCT con PBS durante 5 minutos. Además, aunque es muy conveniente utilizar el horno de hibridación proporcionado por ACD, uso una incubadora simple fijado en 40 ° C combinado con un portaobjetos bandeja usada para immunohistochemistry de tinción da resultados comparables. Lo importante es mantener la humedad en la caja entre papeles de filtro húmedos durante todo el procedimiento.
Hay una limitación de este procedimiento. En la actualidad, no es factible realizar etiquetado de varios colores en la misma diapositiva de tejido. Así, diversas puntas de prueba pueden utilizarse en secciones de corte adyacente, diferentes. Para obtener valores exactos de la PSI, es fundamental para asegurar que el tiempo de incubación de la hibridación de la sonda, detección y amplificación de la señal es la misma para cada sección de tejido. En el futuro, implementar el uso de sondas múltiples colores en la misma diapositiva de tejido, como se utiliza en los procedimientos de RNAscope, será muy conveniente.
El RNA ISH descrito en este informe proporciona una nueva herramienta poderosa para analizar cuantitativamente como patrones de expresión en situ. Esta tecnología puede aplicarse para estudiar muchos exones alternativos. En un reciente informe, fue utilizado con éxito para examinar los patrones de expresión diferencial del ErbB4 cuatro isoformas en las neuronas y oligodendrocitos en celulares de resolución20de empalme. Como se muestra en este y varios otros informes, combinación de BaseScope ARN ISH con inmunoquímica será un poderoso enfoque para estudiar la localización y función de las isoformas que empalma diferencialmente expresados6,20.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association [subvenciones 0365274B a H.L.], Instituto Nacional del cáncer [esporas GI P50CA150964 a Z.W.], institutos nacionales de salud [Oficina de investigación infraestructura compartida instrumentación Grant S10RR031845 a la microscopia ligera imagen instalación en Case Western Reserve University] y China Scholarship Council [a X.G.].
Los autores agradecen a Richard Lee en la base de imágenes de microscopia de luz por su ayuda con la exploración de la diapositiva.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
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