Summary

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Published: August 26, 2018
doi:

Summary

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Abstract

Splicing alternativa (AS) ocorre em mais de 90% dos genes humanos. O padrão de expressão de um exon alternativamente emendado frequentemente é regulado de forma de tipo específico de célula. COMO expressão de padrões normalmente são analisados por RT-PCR e RNA-seq usar amostras do RNA isolado de uma população de células. Em situ exame de como os padrões de expressão para uma particular estrutura biológica pode ser realizada por RNA em situ da hibridação (ISH) usando sondas específicas do exon. No entanto, este uso particular do ISH tem sido limitado porque exões alternativos geralmente são muito curtos para projetar sondas específicas do exon. Neste relatório, o uso de BaseScope, uma tecnologia desenvolvida recentemente que emprega oligonucleotides antisentidos curtos no RNA ISH, é descrito para analisar como padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Exon 23a de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) é usado como um exemplo para ilustrar que curto exon-exon junction sondas exibem sinais de hibridização robusto com alta especificidade na análise de RNA ISH em seções de cérebro de rato. Mais importante, sinais detectados com sondas de inclusão e saltando-específicas do exon podem ser usados para confiantemente, calcular a porcentagem emendada em valores de Nf1 exon 23a expressão em diferentes áreas anatômicas de um cérebro de rato. O protocolo experimental e o método de cálculo para análise são apresentados. Os resultados indicam que o BaseScope oferece uma nova ferramenta poderosa para avaliar como expressão padrões em situ.

Introduction

Splicing alternativa (AS) é um processo comum que ocorre durante a maturação de pre-mRNA. Neste processo, um exon diferencialmente pode ser incluído no mRNA maduro. Assim, AS, através de um gene pode gerar muitos mRNAs esse código para produtos diferentes da proteína. Estima-se que os 92 – 94% dos genes humanos sofrem alternativas emenda1,2. Alternativa anormal, padrões de emenda resultou de mutações genéticas têm sido associadas a um grande número de doenças, incluindo câncer,3,4, distrofia miotônica e esclerose lateral amiotrófica. Assim, é crucial investigar e entender melhor os mecanismos reguladores splicing alternativos na tentativa de encontrar novos tratamentos de doenças humanas.

COMO muitas vezes é regulada de forma de tipo específico de célula. É importante determinar o padrão de expressão de AS de um gene específico em um determinado sistema biológico. No entanto, isso se torna complicado quando um órgão complexo que contém muitos tipos diferentes de células, tais como o cérebro ou no coração, é estudado. Neste caso, a escolha ideal do sistema de ensaio é RNA em situ hibridação (ISH) usando tecido seções para que o padrão de expressão de AS de um gene específico pode ser detectado em muitos tipos de células simultaneamente. Com efeito, sondas específicas do exon têm sido utilizadas para avaliar os níveis de expressão de uma alternativa exon5,6,7. No entanto, essa abordagem não é adequada para análise do padrão pelas seguintes razões. Em primeiro lugar, convencionais métodos ISH geralmente usam sondas mais de 300 bp, enquanto o tamanho médio dos vertebrados exões internos (não primeiro ou último exon) é 170 nucleotídeos8,9. Em segundo lugar, quando uma sonda exon-específico é usada para examinar o padrão de emenda de um exon alternativo interno, a única isoforma de mRNA detectada pela sonda é aquele que contém o exon, enquanto a isoforma de mRNA sem o exon não pode ser detectado. Assim, o cálculo por cento emendados em valor (PSI) para o exon alternativo é complicado. Além disso, ISH fluorescente convencional muitas vezes combina ISH com imunocoloração, que reduz a eficiência de deteção e robustez. Por exemplo, em um estudo que investigou a induzida por estresse, Emendando isoform comutação da acetilcolinesterase (AChE) mRNA, Digoxigenina foi incorporada a sonda ISH e detectado usando anticorpo anti-Digoxigenina. Alternativamente, biotina-rotulado sonda foi detectada por um fosfatase alcalina/estreptavidina conjugado e um substrato para a fosfatase alcalina10. Nenhum método usa qualquer estratégia de amplificação para aumentar a sensibilidade da deteção. Como resultado, é difícil detectar as transcrições de mRNA que são expressos em níveis baixos. Assim, é necessário um sistema de ensaio ISH mais simples e mais robusto para analisar como expressão padrões em situ.

BaseScope foi recentemente desenvolvido com base na plataforma de RNAscope, uma bem estabelecida e amplamente utilizado o sistema de ensaio ISH. Ambos os sistemas de ensaio utilizam uma tecnologia de amplificação de destino específico que aumenta a sensibilidade da deteção11,12. O que distingue um do outro é o comprimento da sequência de destino, que é tão curto quanto 50 nucleótidos para BaseScope e 300 – 1.000 nucleotídeos para RNAscope. Assim, é possível a concepção sondas junções exon-exon para detectar alternativa específica do mRNA isoformas de destino. No estudo atual, foi estabelecido um procedimento para examinar como testes padrões da expressão de neurofibromatose tipo 1 (Nf1) exon 23a, um exon alternativo extensivamente estudado no mesmo laboratório13,14,15 , 16 , 17, nas seções de cérebro de rato. Os resultados demonstram que o BaseScope é um sistema ideal para estudar os padrões de expressão de Nf1 exon 23a in situ. Como este sistema de ensaio pode ser adaptado para analisar como padrões de expressão de muitos exões alternativos, representa uma nova ferramenta poderosa nos estudos de AS.

Protocol

Todos os experimentos descritos aqui que envolvem ratos foram aprovados pelo Comitê de utilização e caso Western Reserve University institucional Cuidado Animal. O título do protocolo de 2016-0068 (PI: Hua Lou) é “Papel de alternativo pre-mRNA emendar no desenvolvimento de vertebrados”. Nota: Informações de todos os equipamentos, reagentes e suprimentos utilizados neste protocolo são incluídas na Tabela de materiais. 1. prepare a formalina pa…

Representative Results

BaseScope ISH foi realizado utilizando três estirpes de rato: CD1 selvagem tipo ratos, C57BL/6J selvagem tipo ratos e ratos mutantes de Nf123aIN/23aIN em background C57BL/6J, em qual exon 23a está incluído em todos os tipos de células como resultado de engenharia local da tala mutações de14,15. Como primeiro passo, o sistema de ensaio ISH foi t…

Discussion

A presente comunicação relata o uso de BaseScope RNA ISH para examinar como os padrões de expressão nas seções de cérebro de rato. Está demonstrado que essa junção exon de anti-sentido-exon sondas menor do que 50 nucleótidos podem direcionar exon inclusão e saltando isoformas robusta e especificamente. Além disso, os sinais resultantes podem ser usados para calcular PSI de um exon alternativo.

Algumas variações foram testadas no procedimento. Por exemplo, seções de tecido cong…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela associação americana do coração [subsídio 0365274B para H.L.], National Cancer Institute [P50CA150964 GI SPORE para Z.W.], National Institutes of Health [escritório de pesquisa infra-estrutura compartilhada instrumentação Grant S10RR031845 para a microscopia de luz imagem facilidade na Case Western Reserve University] e China Scholarship Conselho [X.G.].
Os autores graças a Richard Lee do núcleo de Imaging de microscopia de luz por sua ajuda com a digitalização de slides.

Materials

Equipment
Hybridization Oven Advanced Cell Diagnostics 241000ACD
Humidity Control Tray (with lid) Advanced Cell Diagnostics 310012
Stain Rack Advanced Cell Diagnostics 310017
Hot plate Fisher Scientific 1160049SH
Imperial III General Purpose Incubator Lab-Line 302
Slide Scanner Leica SCN400
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Pretreatment kit Advanced Cell Diagnostics 322381
Hydrogen Peroxide Advanced Cell Diagnostics 2000899
Protease III* Advanced Cell Diagnostics 2000901
10X Target Retrieval Advanced Cell Diagnostics 2002555
BaseScope Detection Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 332910
AMP 0 Advanced Cell Diagnostics 2001814
AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 2001815
AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 2001816
AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 2001817
AMP 4 Advanced Cell Diagnostics 16229B
AMP 5-RED Advanced Cell Diagnostics 16229C
AMP 6-RED Advanced Cell Diagnostics 2001820
Fast RED-A Advanced Cell Diagnostics 2001821
Fast RED-B Advanced Cell Diagnostics 16230F
50X Wash Buffer Advanced Cell Diagnostics 310091
Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ Advanced Cell Diagnostics 701021
Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ Advanced Cell Diagnostics 701081
Control slide-mouse 3T3 cell pellet Advanced Cell Diagnostics 310045
Name Company Catalog Number Comments
Other supplies
Humidifying Paper Advanced Cell Diagnostics 310015
Washing Rack American Master Tech Scientific 9837976
Washing Dishes American Master Tech Scientific LWS20WH
Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratory H-4000
Glass Slides Fisher Scientific 12-550-15
Cover Glass, 24 x 50 mm Fisher Scientific 12–545-F
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Ammonium hydroxide Fisher Scientific 002689
100% ethanol (EtOH) Decon Labs 2805
formalde solution Fisher Scientific SF94-4
Hematoxylin I American Master Tech Scientific 17012359
Mounting Medium Vector Labs H-5000
Xylene Fisher Scientific 173942

References

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Guo, X., Zhao, Y., Nguyen, H., Liu, T., Wang, Z., Lou, H. Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e57889, doi:10.3791/57889 (2018).

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