Summary
Описан в situ гибридизация (ISH) протокол, использующий короткий антисмысловых олигонуклеотидов для выявления альтернативных пре мРНК сплайсинга модели в разделах мозга мыши.
Abstract
Альтернативного сплайсинга (AS) происходит в более чем 90% генов человека. Выражения в качестве альтернативы сращивания экзона часто регулируется в моде определенного типа клеток. КАК выражение, что шаблоны обычно анализируются RT-PCR и РНК seq с использованием образцов РНК изолированы от популяция клеток. В situ экспертиза как выражение шаблоны для определенной биологической структуры может осуществляться путем РНК в situ гибридизация (ISH) с помощью конкретных Эксон зондов. Однако этого конкретного использования иш был ограниченным, поскольку альтернативные экзонов, как правило, слишком короткий для разработки конкретных Эксон зонды. В настоящем докладе использование BaseScope, недавно разработанная технология, которая использует короткие антисмысловых олигонуклеотидов в РНК-иш, описанных для анализа как выражение шаблоны в разделах мозга мыши. Экзона 23a нейрофиброматоз типа 1 (Nf1) используется в качестве примера для иллюстрации, что короткие Экзон экзона Джанкшен зонды exhibit надежные гибридизации сигналы с высокой точностью в РНК ISH анализа на участках мозга мыши. Что еще более важно сигналы обнаружены датчиками включения и пропуск конкретных Эксон может использоваться надежно рассчитать процент сращивания в значениях Nf1 экзона 23a выражения в различных анатомических областях мозга мыши. Экспериментальный протокол и метод расчета для анализа представлены. Результаты показывают, что BaseScope предоставляет новый мощный инструмент для оценки в качестве выражений шаблонов в situ.
Introduction
Альтернативного сплайсинга (AS)-это общий процесс, который происходит во время созревания пре мРНК. В этом процессе экзона дифференциально могут быть включены в зрелой мРНК. Таким образом через AS, один ген может генерировать много мРНК код для различных белковых продуктов. Предполагается, что 92 – 94% генов человека проходят альтернативного сплайсинга1,2. Аномальные альтернативного сплайсинга шаблоны в результате генетических мутаций были связаны с большое количество заболеваний, в том числе боковой амиотрофический склероз, Миотоническая Дистрофия и рак3,4. Таким образом, важно изучить и лучше понять альтернативного сплайсинга механизмов регулирования в попытке найти новые методы лечения заболеваний человека.
КАК часто регулируются на основе конкретного типа ячейки. Важно определить шаблон AS выражения определенного гена в данной биологической системе. Однако это становится сложным, когда сложный орган, который содержит много различных типов клеток, таких как мозг или сердце, изучается. В этом случае идеальный выбор системы анализа является РНК в situ гибридизация (ISH) с использованием ткани разделы, так как выражения определенного гена могут быть обнаружены во многих типах клеток одновременно. Действительно конкретных Эксон зонды были использованы для оценки уровня выражения альтернативных экзона5,6,7. Однако этот подход не является хорошо подходит для, как анализ по следующим причинам. Во-первых, обычные методы иш обычно используют датчики, больше чем 300 bp, в то время как средний размер позвоночных внутреннего экзонов (не первый или последний экзона) составляет 170 нуклеотидов8,9. Во-вторых когда конкретных Эксон зонда используется для изучения сплайсинга шаблон внутренней альтернативных экзона, только изоформы мРНК, обнаруженных зонд является тот, который содержит экзона, в то время как мРНК изоформы без экзона не могут быть обнаружены. Таким образом расчет процентов, сращивания (PSI) значение для альтернативных экзона является сложным. Кроме того обычные флуоресцентные иш часто сочетаются иш иммуноокрашивания, что снижает эффективность обнаружения и надежность. Например, в исследовании, которая расследовала стресс индуцированного сплайсинга изоформы переключение ацетилхолинэстеразы (АВО) мРНК, digoxigenin была включена в ISH зонд и обнаружить с помощью антител анти digoxigenin. Кроме того биотин меченых зонд был обнаружен конъюгата щелочной фосфатазы/стрептавидина и субстрата для10щелочной фосфатазы. Чтобы увеличить чувствительность обнаружения ни метод использует любой стратегии усиления. В результате это сложно обнаружить стенограммы мРНК, которые выражаются на низком уровне. Таким образом проще и более надежна иш пробирного система необходима для анализа как выражение шаблонов в situ.
BaseScope недавно была разработана на основе платформы RNAscope, устоявшихся и широко используется иш пробирного системы. Обе системы анализа используют амплификации целевые технологии, которая увеличивает чувствительность обнаружения11,12. Что отличает друг от друга — Длина последовательности целевых объектов, которая как 50 нуклеотиды для BaseScope и 300 – 1000 нуклеотидов для RNAscope коротким. Таким образом это возможно для дизайн зонды, выполняемых Экзон экзона развязок для выявления конкретных альтернативных мРНК изоформ. В текущем исследовании процедура была создана для изучения как выражение модели нейрофиброматоз типа 1 (Nf1) экзона 23a, альтернативных экзона, широко учился в13,же лаборатории,14,,15 , 16 , 17, в разделах мозга мыши. Результаты показывают, что BaseScope является идеальной системой для изучения моделей выражение Nf1 экзона 23a в situ. Как эта система анализа может быть адаптирована для анализа как выражение модели многих альтернативных экзонов, он представляет новый мощный инструмент в исследованиях AS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, описанные здесь, которые включают мышей были одобрены случае Western Reserve университета институциональных животных ухода и использования Комитетом. Название протокола 2016-0068 (PI: Hua Lou) является «Роль альтернативных пре мРНК сплайсинга в позвоночных развития».
Примечание: Информация о все оборудование, реактивы и материалы, используемые в настоящем Протоколе включен в Таблицу материалов.
1. Подготовьте формалин фиксированной парафин встроенные разделы (FFPE)
-
Усыпить 1 CD1 мышь и 1 C57BL/6J мышь на шейки матки дислокации. Аккуратно Разрежьте черепа с Ножницы хирургические и пинцет. Удаление мозга с шариком.
Примечание: 5-месячного CD1 самцов мышей и самцов мышей C57BL/6J 3-месячного были использованы и показали аналогичные результаты.- Мыть мозга с PBS. Исправить весь мозг раствором, содержащим формалина 10% при комнатной температуре (RT) для 30 h, поставив весь мозг в 50 мл раствора формалина.
- Изменить решение, крепления для PBS и инкубировать мозга PBS на ночь при 4 ° C. Обезвоживанию и внедрить мозга с ксилола и парафина, используя стандартные процедуры18.
-
Использование микротом сократить встроенных ткани разделов 5 мкм. Положите парафин ленты в водяной бане RT, а затем в водяной бане 45 ° C для распространения на ленте.
- Когда исчезают морщины и складки на ленте, сразу же монтировать разделы на стеклянных вставках. Воздух сухой слайды на ночь на RT. Bake слайды за 1 ч, при 60 ° C перед использованием.
2. пример предварительной обработки
-
Deparaffinize разделах ткани. Выполните эти шаги в зонта.
- Залейте 250 мл свежего ксилол и два с 250 мл 100% этанола два мытье посуды (рис. 1A). Вставьте слайды ткани в стиральной стойки (рис. 1A) и место стирки стойку в мытье посуды после заказа и инкубации время, указанные в таблице 1.
- Во время каждого инкубации Поднимите Стиральная стойку вверх и вниз более чем 3 раза в стиральной блюдо. После каждого инкубации быстро переместить Стиральная стойку в следующий Стиральная блюдо для предотвращения разделов ткани от высыхания.
- После завершения шагов инкубации, удалите из блюдо Стиральная Стиральная стойку с горками. Установите решетку на 60 ° C инкубатор для 5 минут или до тех пор, пока слайды полностью сухой.
- Нарисуйте 0,75 '' x 0,75 '' барьер вокруг секции ткани с ручкой гидрофобный барьер. Воздух сухой барьер для 3 мин на RT.
-
Предварительной обработки фрагментов
- Подготовить реагенты и оборудование
- Включите печь гибридизации (рис. 1B) и установите температуру 40 ° c 30 мин перед использованием.
- Полностью мокрой увлажнения бумаги (Рисунок 1E) с дистиллированной водой и положить его в лоток контроля влажности (рис. 1 d, слева). В печь гибридизации, держите лоток контроля влажности.
- Подготовка 700 мл свежего 1 x целевого поиска реагентов, добавив 630 mL dH2O 70 мл 10 x целевого поиска реагентов.
- Примените перекиси водорода.
- Положил deparaffinized слайды на скамейке. Добавьте 5-8 капель перекиси водорода в раздел, чтобы полностью покрыть ткани. Проинкубируйте втечение 10 мин на RT.
- Нажмите слайды на кусок фильтровальной бумаги, чтобы удалить раствором перекиси водорода, один слайд в то время. Сразу вставить слайд в стойку стиральные и переместить решетку Стиральная блюдо, заполнены с dH2O.
- Мыть слайды, перемещая стойку вверх и вниз в дистиллированной воде в течение 3 – 5 раз. Перемещение стойки Стиральная Стиральная блюдо наполнен свежими дистиллированной водой и вымыть слайды еще один раз.
- Цель получения
- Место 1000 мл стакан стекло на горячей плите. Добавить 700 мл свежего 1 x целевого поиска реагентов в стакан и накрыть фольгой. В стакане через крышку фольги (рис. 1 c), вставьте термометр. Поверните на горячей пластине и установите на высоко в течение 10-15 мин.
- Когда температура поиска реагентов достигает 98 ° C, переключатель контроля температуры горячей плиты от высокого до низкого поддерживать мягкий кипения. Не кипятить более чем на 15 мин.
- Тем временем тщательно открыть фольгу и положить Стиральная стойку с кусочками внутри извлечения регент. Обложка снова стакан и Инкубируйте 15 мин.
- Используйте щипцы для удаления стойки из стакан для стирки блюдо заполнены с 200 мл dH2O и полоскания для 15 s.
- Перемещение стойки для стирки блюдо, содержащий 100% свежие этанола и пусть сидят за 3 мин удалить слайды и высушить их в 60 ° C-инкубатор для 10 мин.
- Применить протеазы III
- Место слайды на пятно стойки (рис. 1 d, право). Добавьте 5 капель протеазы III для покрытия ткани. Осторожно поставьте решетку на панели контроля влажности (рис. 1 d, слева) и Вставьте лоток в печь гибридизации 40 ° C. Инкубируйте 30 мин.
- Удалить слайд стойку и поставить лоток обратно в печь. Выберите слайды, чтобы удалить лишнюю жидкость, один слайд в то время. Вставить слайд в стойку стиральные и место стойки в блюдо Стиральная заполнены с dH2O. Move стойку вверх и вниз, чтобы мыть слайды для 3 - 5 раз.
- Подготовить реагенты и оборудование
3. иш Assay
-
Подготовка материалов
- Предварительно теплой 50 x мыть буфера в инкубаторе 40 ° C на 20 мин Mix 2.94 L dH2O и 60 мл 50 x мыть буфер, чтобы сделать 1 x мыть буфера.
- Подготовка 50% гематоксилином окрашивание раствора, добавив 100 мл гематоксилином Гилл я до 100 мл dH2O. Подготовка 0,02% (w/v) аммиак водный, добавив 1,43 мл 1 гидроксида аммония N 250 мл dH2O. Mix хорошо в контейнере.
- Зонды и AMP 0 – 6 реагентов в RT 30 мин перед использованием. В печь гибридизации 40 ° C, держите лоток контроля влажности.
-
ISH процедура
Примечание: Для изучения выражение Nf1 сплайсинга изоформ и рассчитать процент сращивания (PSI) значение для экзона 23a, три различных датчиков иш, выполняемых экзона включены 23a изоформы, экзона исключенные 23А изоформы или обе изоформы являются используется (Рисунок 2 ). Зонды используются на разделах профильной резки ткани. Для обеспечения точности расчета, важно, что три ткани разделы обрабатываются точно так же в гибридизации, усилители и сигнал обнаружения шаги.- Зонд гибридизации.
- Удалите слайды из стойки стиральные и коснитесь избыток жидкости из слайдов. Место слайды в стойку пятно.
- Используйте карандаш, чтобы обозначить слайды с именем зонда. Положил три профильной резки мозга ткани слайды чтобы быть гибридизированных вместе с тремя различными зондами Nf1 (рис. 2). Осуществить последующие шаги в том же порядке слайдов.
- Добавьте 4 капли зонд для покрытия ткани. Сделайте этот один слайд в то время, чтобы предотвратить высыхание разделы. Установите решетку пятно на панели контроля влажности и вставьте его в 40 ° C духовке в течение 2 ч.
- Промойте слайды дважды отмывающим буфером. Для каждого мытья залейте 200 мл 1 x мыть буфера окрашивание блюдо и место Стиральная стойку в нем. Нажмите на бумажных полотенец один слайд избыток жидкости в то время и быстро вставить его в стойку стирки. Перемещение стойки слайд вверх и вниз в блюдо для 3 – 5 раз за 2 мин на RT.
- Для второй мыть используйте свежий мыть буфера.
- Усиления сигнала.
- Коснитесь значка буфера избыточного вымыть из слайдов и поместите их в стойку пятно. Добавьте 4 капли AMP 0 для покрытия ткани. Установите решетку пятно на панели контроля влажности и вставить его в духовке в течение 30 мин при 40 ° C.
- Промойте слайды дважды отмывающего буфера, как описано выше.
- Повторите этот шаг с AMP 1 – 6 после заказа и состояние в таблице 2. Вымойте слайды дважды после каждого шага гибридизации.
- Обнаружение сигнала
- Коснитесь значка буфера избыточного вымыть из слайдов и поместите их в стойку пятно. Добавить 2 мкл быстро красный B 120 мкл быстро красного (соотношение 1: 60) в пробки microcentrifuge. Хорошо перемешайте и добавьте для полного покрытия в разделе ткани.
Примечание: Общий объем красный A / B смесь на основе количества и размера разделов ткани. Для 0,75 '' x 0,75 '' области 120 мкл достаточно для одной секции. Используйте смесь в течение 5 мин и избегать воздействия прямых солнечных лучей или ультрафиолетового света смеси. - Закройте лоток и проинкубируйте втечение 10 мин на RT. удалить решение контейнер для отходов и сразу вставить слайды в стойку стиральная и установьте шкаф в стиральной блюдо с водопроводной водой. Снова сполосните свежей проточной водой.
- Коснитесь значка буфера избыточного вымыть из слайдов и поместите их в стойку пятно. Добавить 2 мкл быстро красный B 120 мкл быстро красного (соотношение 1: 60) в пробки microcentrifuge. Хорошо перемешайте и добавьте для полного покрытия в разделе ткани.
- Зонд гибридизации.
-
Counterstaining слайдов
- Снимите решетку Стиральная из водопроводной воды и быстро нажмите на абсорбирующий бумаги для удаления дополнительных воды. Положите решетку в 50% гематоксилином окрашивание раствора и немедленно переместить решетку вверх и вниз несколько раз. Проинкубируйте 2 мин на RT.
- Передача слайд стойку обратно в блюдо водопроводной воды. Вымойте 3 – 5 раз, перемещая стойку вверх и вниз и изменив пресной водопроводной воды до тех пор, пока слайды стало ясно, в то время как в тканях мозга остаются фиолетовый.
- Перемещение стойки в блюдо, содержащий 0,02% аммиачной воды. Перемещение стойки вверх и вниз 2-3 раза до тех пор, пока тканях синеет. Вымойте слайды 3 – 5 раз с пресной водопроводной водой в окрашивание блюдо.
-
Установка образцов
- Переместить слайд стойку из окрашивание блюдо в инкубатор 60 ° C и инкубировать и по крайней мере 15 минут до тех пор, пока слайды полностью сухой.
- Место 40 мкл монтажа средних на слайде и тщательно место 24 x 50 мм coverslip разделе ткани. Воздух сухой слайды для 30 мин на RT.
4. сбор данных и анализ
Примечание: Используйте слайд сканер для сканирования изображений на 40 кратном.
-
Позитивные и негативные элементы управления
- Для каждого эксперимента включают позитивные и негативные элементы (рис. 3). Как хороший положительный контроль сигнал должен быть виден как пунктата точек на 20-40 кратном.
- Использование мыши (мм) - PPIB - 1ZZ как позитивный элемент управления. Этот зонд цели общей уборки гена PPIB. Для отрицательного контроля одна точка на каждые 20 клеток, отображение фона, окрашивание за 20 X микроскопом поле является приемлемым.
- Используйте DapB-1ZZ зонда как отрицательный контроль. Этот зонд цели бактериальный ген dapB. Эти датчики контроля были использованы в много иш анализов19.
-
Сигнал обнаружения и анализа как выражение модели Nf1 экзона 23А
- Поскольку сигналы гибридизации обозначаются как пунктата точек, граф точки вручную. Количество точек коррелирует с уровнем стенограммы, обнаруженный конкретного ПЭП. Обратите внимание, что количество точек, также могут быть проанализированы программой ImageJ или SpotStudio.
- Используйте три зонды для гибридизируйте экзона 23А содержащих, 23А хватает изоформ экзона или всего Nf1 стенограммы (рис. 2). Как три зонды не могут использоваться одновременно, используйте три прилегающих мозга ткани разделы для гибридизируйте для каждого зонда.
- Чтобы вычислить процент сращивания в (PSI) для экзона 23a, подсчитать количество ячеек и точек в нескольких регионах мозга. Для каждого региона интерес рассчитывать более чем 400 клетки из нескольких субрегионах, как указано на рисунке 4.
- Сбор данных от же субрегионов для каждого из трех датчиков. Рассчитать PSI как количество точек на ячейку с датчика включения экзона 23a / (количество точек на ячейку с экзона 23a включение зонд + количество точек на ячейку с exon23a пропуск зонд) х 100%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ИШ BaseScope была проведена с использованием трех штаммов мыши: CD1 дикого типа мышей, мышей C57BL/6J дикого типа и Nf123aIN/23aIN мутантных мышей C57BL/6J на заднем плане, в котором экзона 23a включен во всех типах клеток в инженерии сращивания сайта мутации14,15.
В качестве первого шага, ISH пробирного система была протестирована с помощью компании при условии реагентов: слайды, которые имеют 3T3 клетки и отрицательной и положительной иш зонды. Как показано на рисунке 3, сигнал не был обнаружен, когда отрицательный контроль зонд был использован, в то время как многие пунктата точек были обнаружены, когда положительный контроль зонд был использован.
Далее, ISH осуществлялась с помощью мыши мозга секций и Nf1-конкретных зондами, которые предназначены для обнаружения Nf1 стенограмм, которые содержат экзона 23a, пропустить экзона 23a или обоих изоформ (рис. 2). Эти зонды целевых конкретных Эксон экзона развязок. Два мозга регионы были выбраны для изучения выражения как Nf1 экзона 23a: коры головного мозга и гиппокампе CA3 (рис. 4). Для каждого региона, всего трех субрегионов, как указано на рисунке 4, запись номера ячейки и точка. Для каждого региона примерно 400 клетки были подсчитаны в общей сложности и используется для вычисления соотношения точек/ячейки. Шаблон AS выражения для Nf1 экзона 23a рассчитывается как PSI.
ISH сигналы, полученные с тремя Nf1 зонды в коре головного мозга и гиппокампе CD1 мышей приводятся в Рисунок 5A-5F и таблице 3. Кора региона от C57BL/6J Nf1+/ + и мышей Nf123aIN/23aIN был также проанализированы (рис. 6).
В результате этих экспериментов привели к нескольким выводам. Во-первых, сумма сигналов, как точки/клетки, обнаруживаемых экзона 23a включение определенного и пропуск зонды равен, обнаруженный зонд гибридизировать в обоих изоформ (Таблица 3), который свидетельствует о том, что три зонды гибридизированных с Nf1 стенограммы с аналогичными эффективности. Во-вторых значение PSI экзона 23a в коре, 10%, согласуется с ранее сообщалось ПЦР-результат, в котором был расчлененный коры от взрослого мозга мыши C57BL/6J следуют общей изоляции РНК и ПЦР-анализа14,15. Этот результат свидетельствует о том, что иш BaseScope может использоваться для количественного анализа как выражение шаблоны помимо Стенограмма уровней в разделах ткани. В-третьих, результаты, полученные с Nf123aIN/23aIN мутантов мозга тканей, в которых все стенограммы Nf1 содержат экзона 23a14,15, показали аналогичные уровни сигналов при включении конкретных и Nf1 всего зонды были использованы и не сигнал, когда пропуск конкретных зонд был использован (рис. 6), указывая, что двух датчиков ориентации экзона включения или пропуска являются весьма специфический.
Рисунок 1: оборудование используется в ISH. (A) промывки блюдо и мытье стойку. (B) печь гибридизации. (C) Поиск стакан и поджарки набора. Влажность (D) контроль лоток и выведение стойку. (E) увлажнения бумаги обозначается красной стрелки внутри панели контроля влажности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Зонды используются для обнаружения Nf1 экзона 23a как шаблоны выражений. Все датчики содержат один ZZ пара олигонуклеотида. Включение конкретных зонд (красный) ориентирована на стыке экзонов 23А и 24, пропуск конкретных зонд (зеленый) ориентирована на стыке экзонов 23 и 24, и Nf1 всего зонд (синий) ориентирована на стыке экзонов 26 и 27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: ИШ, используя отрицательные (A-B) и позитивные элементы (C-D) на 3T3 клетки. Управления слайд, содержащий 3T3 клетки был обработан через шаги 2 (пример предварительной обработки) и 3 (иш процедура) в протоколе. Позитивные сигналы отображаются как красный пунктата точками обозначены красными стрелками. B и D масштаб изображения A и C, соответственно. Шкалы бар = 20 мкм (A и C); 5 мкм (B и D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: фотография мыши мозга корональных разделе. Красные поля обозначают областей, отобранных для подсчета числа клеток и сигнал в коре головного мозга и гиппокампе CA3 регионах. Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: РНК ISH сигналы обнаружены с помощью Nf1-конкретных зондов и мыши мозга секций. CD1 мозги были обработаны через шаги 1-4 в протоколе. Красный пунктата точки обозначают позитивные сигналы, когда три Nf1-используются конкретные зонды (показано на рис. 3). Показаны коры (A-C) и гиппокампа (D-F). NF1 всего зонд был использован в A и D, включение конкретных зонд в B и E и пропуск конкретных зонд в C и F. шкалы бар = 40 мкм (A-C); 400 мкм (D-F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: РНК ISH сигналы обнаружены в Nf1+/ + и секции мозга Nf123aIN/23aIN . На заднем плане C57BL/6J обе мыши штаммов. Мозги были обработаны через шаги 1-4 в протоколе. A-C. Nf1+/ + коры. D-F. Nf123aIN/23aIN коры. Nf1 всего зонд был использован в A и D, включение конкретных зонд в B и E и пропуск конкретных зонд в C и F. шкалы бар = 40 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Порядок инкубации | Химических веществ в TT блюдо | Время |
| 1 | 250 мл ксилол | 5 мин |
| 2 | 250 мл ксилол | 5 мин |
| 3 | 250 мл 100% этанола | 2 мин |
| 4 | 250 мл 100% этанола | 2 мин |
Таблица 1: Процедура инкубации шага 2.1.1.
| AMP решение | Время инкубации | Температура инкубации |
| AMP 1 | 15 мин | 40 ° C |
| AMP 2 | 30 мин. | 40 ° C |
| AMP 3 | 30 мин. | 40 ° C |
| AMP 4 | 15 мин | 40 ° C |
| AMP 5-КРАСНЫЙ | 30 мин. | Комнатной температуре |
| AMP 6-КРАСНЫЙ | 15 мин | Комнатной температуре |
Таблица 2: Сигнал усиления процедуры шаг 3.2.2.
| Регион | пропуск | Включение | пропуск + включение | Итого | PSI |
| Кора | 2.9±0.1 | 0.32±0.03 | 3.21 | 3.22 | 10 |
| CA3 | 5.37±0.2 | 0.2±0.04 | 5.56 | 5.65 | 3.71 |
Таблица 3: РНК ISH результаты рассчитаны на картинке показано на рисунке 5. Номера, указанные в точек/ячейку, были рассчитаны с использованием более чем 400 клеток, которые включены в трех субрегионах в коре и CA3 (рис. 4). Стандартные ошибки включены в стоимость номера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это сообщение сообщает использование BaseScope РНК ISH для изучения как выражение шаблоны в разделах мозга мыши. Доказано, что что анти чувство Экзон экзона Джанкшен зонды короче, чем 50 нуклеотидов можно ориентировать экзона включение и пропуск изоформ решительно и конкретно. Кроме того результирующий сигнал может использоваться для вычисления PSI альтернативного экзона.
Несколько вариантов были протестированы в процедуре. Например разделы замороженные ткани, порожденных криостата секционирование были проверены и быть успешным для использования в этом протоколе ISH. В этом случае однако, депарафинизации шаг в 2.1 было изменено на мытье OCT с PBS на 5 мин. Кроме того хотя это очень удобно использовать печь гибридизации, предоставляемый ACD, использование простой инкубатора на 40 ° C, в сочетании с слайд пятнать лоток для иммуногистохимии дает сопоставимые результаты. Важно, чтобы сохранить влагу в поле, включая мокрый фильтр документов на протяжении всей процедуры.
Существует ограничение в этой процедуре. В настоящее время не представляется возможным выполнять многоцветные маркировки на тот же слайд ткани. Таким образом различные датчики может использоваться только на профильной резки, различные секции. Для получения точных значений PSI, важно обеспечить что время инкубации зонд гибридизации, усиления сигнала и обнаружения является одинаковым для каждой секции ткани. В будущем использования многоцветные зонды на тот же слайд ткани, используемые в RNAscope процедур, будет весьма желательно.
ISH РНК, описанные в настоящем докладе дает новый мощный инструмент количественно анализировать как выражение шаблонов в situ. Эта технология может применяться для изучения многих альтернативных экзонов. В недавнем докладе он успешно использовался для изучения дифференциального выражение закономерности четырех ErbB4 сплайсинга изоформ нейронов и Олигодендроциты сотовой резолюции20. Как показано в этой и нескольких других докладов, комбинация BaseScope иш РНК с Иммунохимия будет мощный подход к изучению локализации и функции дифференциально выраженной сплайсинга изоформ6,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана американская ассоциация сердца [субсидий 0365274B к H.L.], Национальный институт рака [GI SPORE P50CA150964 к Z.W.], национальные институты здравоохранения [Управление из исследовательской инфраструктуры совместно инструментария Грант S10RR031845 для Световой микроскопии изображений объекта на Западный резервный университет Кейза] и Китай стипендию Совета [X.G.].
Авторы благодарят Ричард ли в свет микроскопии изображений ядре за его помощь с сканирование слайдов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Hybridization Oven | Advanced Cell Diagnostics | 241000ACD | |
| Humidity Control Tray (with lid) | Advanced Cell Diagnostics | 310012 | |
| Stain Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310017 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | 1160049SH | |
| Imperial III General Purpose Incubator | Lab-Line | 302 | |
| Slide Scanner | Leica | SCN400 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Pretreatment kit | Advanced Cell Diagnostics | 322381 | |
| Hydrogen Peroxide | Advanced Cell Diagnostics | 2000899 | |
| Protease III* | Advanced Cell Diagnostics | 2000901 | |
| 10x Target Retrieval | Advanced Cell Diagnostics | 2002555 | |
| BaseScope Detection Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 332910 | |
| AMP 0 | Advanced Cell Diagnostics | 2001814 | |
| AMP 1 | Advanced Cell Diagnostics | 2001815 | |
| AMP 2 | Advanced Cell Diagnostics | 2001816 | |
| AMP 3 | Advanced Cell Diagnostics | 2001817 | |
| AMP 4 | Advanced Cell Diagnostics | 16229B | |
| AMP 5-RED | Advanced Cell Diagnostics | 16229C | |
| AMP 6-RED | Advanced Cell Diagnostics | 2001820 | |
| Fast RED-A | Advanced Cell Diagnostics | 2001821 | |
| Fast RED-B | Advanced Cell Diagnostics | 16230F | |
| 50x Wash Buffer | Advanced Cell Diagnostics | 310091 | |
| Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701021 | |
| Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ | Advanced Cell Diagnostics | 701081 | |
| Control slide-mouse 3T3 cell pellet | Advanced Cell Diagnostics | 310045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other supplies | |||
| Humidifying Paper | Advanced Cell Diagnostics | 310015 | |
| Washing Rack | American Master Tech Scientific | 9837976 | |
| Washing Dishes | American Master Tech Scientific | LWS20WH | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| Glass Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Cover Glass, 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12--545-F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | 002689 | |
| 100% ethanol (EtOH) | Decon Labs | 2805 | |
| formalde solution | Fisher Scientific | SF94-4 | |
| Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | 17012359 | |
| Mounting Medium | Vector Labs | H-5000 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 173942 |
References
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).
- Cieply, B., Carstens, R. P. Functional roles of alternative splicing factors in human disease. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).
- Xiong, H. Y., et al. RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease. Science. 347, 1254806 (2015).
- Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites. Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).
- Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain. BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).
- Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing? Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).
- Cassidy, A., Jones, J. Developments in in situ hybridisation. Methods. 70, 39-45 (2014).
- Meshorer, E., et al. Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity. Science. 295, 508-512 (2002).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
- Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).
- Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons. Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).
- Nguyen, H. T., et al. Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice. Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).
- Zhou, H. L., et al. Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).
- Sharma, A., et al. Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).
- Adzemovic, M. Z., et al. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution. Molecular Neurobiology. , (2017).
