该协议演示了如何获得一个低分辨率的从头模型和洗涤剂-溶解膜蛋白在溶液中使用小角中子散射与洗涤剂的对比匹配的结构细节。
橡树岭国家实验室高通量同位素反应器生物小角中子散射仪致力于生物材料、生物燃料加工和生物启发材料的研究, 涵盖纳米到微米长度刻度。本文介绍了在胶束成型洗涤剂溶液中研究膜蛋白 (这里, MmIAP, intramembrane aspartyl 蛋白酶, Methanoculleus marisnigri) 的物理性质 (即尺寸和形状) 的方法。非常适合这种小角度中子散射仪器, 等等。其他生物物理表征技术由于无法在蛋白质洗涤剂复合结构中处理洗涤剂的贡献而受到阻碍。此外, 对生物氘化实验室的访问提供了独特的能力, 以制备大规模培养和表达氘标记蛋白, 增强散射信号从蛋白质。虽然这种技术不提供高分辨率的结构细节, 但膜蛋白结构知识缺口包含许多可寻址的研究领域, 而无需近原子分辨率。例如, 这些区域包括寡聚状态的测定、复杂的形成、摄动过程中的构象变化和折叠/展开事件。通过这种方法的应用, 可以很容易地完成这些调查。
膜蛋白是由估计的30% 的所有基因1编码, 并代表了大多数现代药物的目标。2这些蛋白质执行一系列重要的细胞功能,3但尽管它们的丰度和重要性-仅代表在结构生物信息学 (蛋白质) 蛋白研究磁场中沉积的总结构的约1%数据银行。4由于其部分疏水性, 对膜结合蛋白的结构测定一直是极其具有挑战性的。5,6,7
由于许多生物物理技术需要在溶液中单分散颗粒进行测量, 因此在本机膜中隔离膜蛋白和稳定这些蛋白质是近年来研究的一个活跃领域。几十 年。8,9,10这些调查导致许多新的两亲性组件的发展溶解膜蛋白, 如 nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15和 amphipols。16,17然而, 洗涤剂胶束的使用仍然是满足给定蛋白质溶解度要求的最常见和最直接的方法之一。18,19,20,21,22,23,24,25不幸的是, 目前尚无单一洗涤剂或混合洗涤剂, 满足所有膜蛋白的存在;因此, 这些条件必须经过经验筛选, 以满足每种蛋白质的独特要求。26,27
洗涤剂在其临界胶束浓度以上的溶液中自组装, 形成称为胶束的聚合结构。胶束由许多洗涤剂单体组成 (通常范围从 20-200), 疏水性烷基链形成胶束芯和亲水性头组排列在胶束壳层, 面对水性溶剂。洗涤剂和胶束形成的行为是典型的查尔斯 Tanford 在疏水性作用,28和大小和形状的胶束从常用洗涤剂在膜蛋白研究已采用小角度散射特征。29,30对膜蛋白的洗涤剂组织也进行了研究, 并预期蛋白质洗涤剂复合物 (PDCs) 的形成与洗涤剂分子周围的蛋白质在一个安排, 类似于整洁的洗涤剂胶 束。31
使用洗涤剂的一个优点是, 所产生的胶束特性可以通过结合其他洗涤剂来操作。许多洗涤剂表现出理想的混合, 而混合胶束的选择性能甚至可以从组分和混合比例预测。22然而, 洗涤剂的存在仍然会给整个信号带来生物物理表征的挑战。例如, 使用 X 射线和光散射技术, PDC 中洗涤剂的信号与蛋白质几乎没有区别。32使用单粒子低温电子显微镜 (低温 EM) 进行的调查通常依赖于被困 (冰冻) 粒子;蛋白质的结构细节仍然被某些洗涤剂或高浓度的洗涤剂掩盖, 增加了背景。33通过计算方法来解释整个 PDC 结构 (包括洗涤剂) 的替代方法, 它试图在给定的膜蛋白周围重建洗涤剂。34
在中子散射的情况下, 胶束中洗涤剂的芯壳排列会产生一种有助于观测散射的形状因子。幸运的是, 可以更改解决方案组件, 使其不会对观察到的网络散射造成影响。这种 “对比匹配” 过程是通过用氘代替氢气来实现与背景 (缓冲器) 相匹配的散射长度密度来实现的。明智的选择洗涤剂 (与可用的氘代对应) 和他们的混合比例必须考虑。对于洗涤剂胶束, 这种替代可以使用同一头组的洗涤剂进行, 但具有氘代烷基链 (d-尾部而不是 h 尾)。由于洗涤剂混合良好,35它们的骨料将具有散射长度密度, 这是两个分量 (h 尾和 d 尾) 的摩尔分数加权平均值。当这种平均对比度与头部组一致时, 可以完全匹配均匀骨料结构, 以消除所有对观测到散射的贡献。
我们在这里介绍了一种通过将化学相同的洗涤剂分子与氘标记的烷基链结合在一起来操纵洗涤剂胶束中子对比度的协议。19,36,37这使得胶束核和壳体的同时对比度匹配, 这是一种独特的中子散射能力。35,38有了这一显著细化的细节水平, 对比度匹配可以使膜蛋白结构的其他不可行的研究。此外, 这种对比匹配方法可以扩展到其他涉及洗涤剂的系统, 如聚合物交换反应39和油水分散剂,40甚至其他增溶制剂, 如 bicelles,41nanodiscs,42或嵌段共聚物。43本手稿中概述的类似方法, 但在烷基链和/或头组采用了单一的含氘替代剂, 最近发表。37虽然这可以预期改善氢和氘在整个洗涤剂中的随机分布与此处介绍的方法相比, 在替代品和两个步骤的洗涤剂的可用位置数量有限洗涤剂的合成需要考虑更多的挑战。
下面详细介绍的协议步骤1和2经常重叠, 因为必须进行初步的实验规划才能提交质量建议。然而, 提案提交在这里被认为是第一步, 强调这一过程应该在中子实验之前很好地开始。还应指出的是, 建议应说明的一个先决条件步骤是对需要进行中子研究的样品进行生化和物理表征 (包括纯度和稳定性)。关于小角中子散射 (san) 的一般讨论超出了本文的范围。考夫曼44材料的参考工作表征中提供了一个简短而全面的介绍, 最近出版了一本以生物小角度溶液散射为重点的综合教科书。45在讨论部分给出了进一步建议的阅读。小角度散射使用所谓的散射矢量 Q 作为描述散射过程的中心量。本文使用广泛接受的定义 Q = 4π sin (θ)/λ, 其中θ是入射和散射光束的一半角, λ是埃中子辐射的波长。还存在使用不同符号 (如 “散射矢量”) 的其他定义, 并且可能因2π或使用纳米代替埃而有所不同 (参见图 10的讨论)。
结构生物学研究人员利用互补的结构技术, 如溶液散射, 获得生物化学和结构细节 (如整体大小和形状) 从生物分子在溶液中。san 是一种特别吸引人的技术, 用于确定膜蛋白的低分辨率结构, 这是现代结构生物学和生物化学的核心重点。san 需要与晶体试验 (1 毫克/样品) 相媲美的纯化蛋白数量。最近扩大的商业可用性与膜蛋白研究相关的高纯度氘代洗涤剂使可获取的手段来操纵这种氢/氘含量的无膜蛋…
The authors have nothing to disclose.
生物和环境研究办公室支持 ORNL 的结构分子生物学 (CSMB) 和生物 san 中心的研究, 使用由美国能源部基础能源科学办公室科学用户设施部支持的设施。的能量。在利伯曼实验室的膜蛋白结构工作已得到 NIH (DK091357, GM095638) 和 NSF (0845445) 的支持。
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator | EMD Millipore | UFC905096 | labware |
Ammonium citrate dibasic | Fisher Scientific | A663 | medium component |
Ammonium sulfate | EMD Millipore | 2150 | medium component |
Bioflo 310 Bioreactor System | Eppendorf | M1287-2110 | equipment |
Calcium chloride dihydrate | Acros | 423525000 | medium component |
Carbenicillin | IBI Scientific | IB02025 | antibiotic |
Chloramphenicol | EMD Millipore | 3130 | antibiotic |
Cobalt (II) chloride | Acros | AC21413-0050 | medium component |
Copper (II) sulfate | Acros | AC19771-1000 | medium component |
Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 756822 | medium component |
Drierite Gas Purifier | W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. | 27068 | |
EDTA, disodium, dihydrate | EMD Millipore | 4010 | medium component |
Emulsiflex-C3 | Avestin | EF-C3 | equipment |
Äkta Purifier UPC100 | GE Healthcare | equipment | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | medium component |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17116701 | |
Imidazole | VWR | 97064-622 | |
IPTG | Teknova | I3325 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | MP Biochemicals | ICN19404590 | medium component |
LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425-2 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | 97062-134 | medium component |
Manganese(II) sulfate monohydrate | Acros | AC20590-5000 | medium component |
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | equipment |
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310T | |
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310A | |
Potassium phosphate monobasic | VWR | 97062-346 | medium component |
RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific Sorvall | 46910 | equipment |
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free | Sigma-Aldrich | S8830 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | medium component |
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane | VWR | 28145-501 | labware |
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane | Thermo Scientific | 596-4520 | labware |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17517501 | |
Superose-12 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517301 | |
Ultrospec 10 Cell Density Meter | GE Healthcare | 80211630 | equipment |
Zinc sulfate monohydrate | Acros | AC38980-2500 | medium component |