Ce protocole montre comment obtenir un modèle basse résolution ab initio et des détails de structure d’une protéine de membrane solubilisée détergent en solution par la diffusion des neutrons de petits angles avec filtrage de contraste du détergent.
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Article de méthode
Correspondance de contraste de détergent dans les expériences de diffusion de neutrons de petits angles pour l’analyse structurale de protéines membranaires et la modélisation de Ab Initio
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’instrument de diffusion de neutrons de petits angles biologique au haut Flux Isotope réacteur du Oak Ridge National Laboratory est dédié à l’étude des biomatériaux, biocarburants de traitement et les matériaux bio-inspirés couvrant nanomètre à échelles de micromètre de longueur. Les méthodes présentées ici pour étudier les propriétés physiques (p. ex., la taille et la forme) des protéines membranaires (ici, MmIAP, une protéase d’aspartyl intramembranaires de Methanoculleus marisnigri) dans les solutions micellaires formant des détergents sont bien adapté pour cet instrument de diffusion de neutrons de petits angles, entre autres. Autres techniques de caractérisation biophysique sont gênées par leur incapacité à régler les contributions de détergent dans une structure complexe de protéine-détergent. En outre, l’accès au laboratoire Bio-deutération fournit des capacités uniques pour la préparation des cultures à grande échelle et exprimant des protéines marquées du deutérium pour le signal de diffusion accrue de la protéine. Tandis que cette technique ne fournit pas de détails structuraux à haute résolution, ce manque de connaissances structurale des protéines membranaires contient plusieurs zones adressables de recherche sans nécessiter de résolution atomique près. Par exemple, ces domaines incluent la détermination des États oligomériques, formation d’un complexe, des changements conformationnels durant la perturbation et les événements de pliage/dépliage. Ces enquêtes peuvent être facilement exécutées via des applications de cette méthode.
Introduction
Les protéines membranaires sont codées par environ 30 % de tous les gènes1 et représentent une forte majorité des cibles pour des médicaments modernes. 2 ces protéines effectuent un large éventail de fonctions cellulaires vitales,3 mais en dépit de leur abondance et leur importance, ne représentent qu’environ 1 % du totales structures déposées dans le Research Collaboratory Structural Bioinformatics (RCSB) protéine Banque de données. 4 en raison de leur caractère hydrophobe partiellement, détermination structurale des protéines membranaires a été extrêmement difficile.
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Protocole
1. préparer et soumettre un Neutron installation faisceau temps Instrument et proposition
- Consulter les ressources en ligne pour l’identification des installations de diffusion de neutrons qui fournissent l’utilisateur générale neutrons faisceau temps accès, tels que l’Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Une carte des installations de neutrons et d’informations sur la recherche de neutrons dans le monde entier est disponible en ligne. 46 , sachez que ces installations ont généralement des appels à propositions ; Ceci permet de déterminer quand la prochaine fois de faisceau sera disponible. Neutrons sont utilisés pour une variété d’a....
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Résultats
Une proposition d’instrument et de temps de faisceau doit exprimer clairement toutes les informations nécessaires au Comité de surveillance ainsi qu’une évaluation valable de l’expérience proposée peut être faite. Communication avec un NSS est fortement recommandée pour les utilisateurs inexpérimentés. Le SNRS peut évaluer la faisabilité initiale et soumission de proposition de guide pour souligner la faisabilité, la sécurité et le potentiel de fort impact science. Les informations fourni.......
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Discussion
Chercheurs de biologie structurale tirer parti des techniques structurelles complémentaires comme solution de diffusion pour obtenir des détails biochimiques et structurales (tels que la taille globale et la forme) de molécules en solution. SANS est une technique particulièrement attractive pour la détermination des structures de faible résolution des protéines membranaires, un objectif de base de biochimie et de biologie structurale moderne. SANS nécessite des quantités de protéines purifiées comparables à ceux des essa.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss et Ryan C. Oliver sont transigés par l’entremise de UT-Battelle avec US DOE pour soutenir le programme d’utilisateur Science neutronique et Bio-SANS instrument à Oak Ridge National Laboratory utilisés dans cet Article.
Ce manuscrit a été co-écrit par UT-Battelle, LLC, sous contrat DE-AC05-00OR22725 avec le nous Department of Energy (DOE). Le gouvernement américain maintient et le serveur de publication, par l’acceptation de l’article pour publication, reconnaît que le gouvernement américain conserve une licence non exclusive, versée, irrévocable, mondiale, pour publier ou reproduire le formulaire publié de ce manuscrit ou d’autoriser d’autres de le faire, aux fins de le gouvernement américain. DOE fournira l’accès du public à ces résultats de recherche parrainé par le gouvernement fédéral conformément au Plan de l’accès Public DOE. 82
Remerciements
L’Office of Biological and Environmental Research appuyé la recherche au centre de ORNL pour biologie moléculaire structurale (CSMB) et Bio-SANS en utilisant les équipements pris en charge par le scientifique à la Division des installations, le Bureau des Sciences fondamentales de l’énergie, le département américain de l’énergie. Travaux structurels sur les protéines de la membrane dans le laboratoire de Lieberman a été soutenu par les NIH (DK091357, GM095638) et NSF (0845445).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Concentrateur Amicon Ultra MWCO 50KDa ; | Matériel de laboratoire | EMD Millipore | UFC905096 |
| Citrate d’ammonium dibasique | Fisher Scientific | A663 | Matériau moyen |
| Sulfate d’ammonium | EMD Millipore | 2150 | Composant moyen |
| Bioflo 310 Système de bioréacteur | Eppendorf | M1287-2110 | Équipement |
| Chlorure de calcium dihydraté | Acros | 423525000 | composant moyen |
| Carbenicilline | IBI | IB02025 | antibiotique |
| Chloramphénicol | EMD Millipore | 3130 | antibiotique |
| Chlorure de cobalt (II) | Acros | AC21413-0050 | Composant moyen |
| Sulfate de cuivre (II) | Acros | AC19771-1000 ; | Composant moyen |
| Oxyde de deutérium | Sigma-Aldrich | 756822 | moyen |
| composant Purificateur de gaz de drierite | W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. | 27068 | |
| EDTA, disodique, dihydraté | EMD Millipore | 4010 | composant moyen |
| Emulsiflex-C3 | Avestin | EF-C3 | équipement |
| et Auml ; purificateur kta UPC100 | GE Healthcare ; | équipement | |
| Glycérol | Sigma-Aldrich | G5516 | moyen composant |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR colonne | GE Healthcare ; | ||
| Imidazole | VWR | 97064-622 | |
| IPTG | Teknova | I3325 | |
| Chlorure de fer(III) hexahydraté | MP Produits biochimiques | ICN19404590 | composant moyen |
| LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425-2 | |
| Sulfate de magnésium heptahydraté | VWR | 97062-134 | composant moyen |
| Sulfate de manganèse(II) monohydraté | Acros | AC20590-5000 | moyen |
| MaxQ 6000 Agitateur incubé/réfrigéré | Thermo Scientific | SHKE6000-7 ; | équipement |
| n-Dodecyl-d25-&beta ;-D-maltopyranoside | Anatrace | D310T | |
| n-Dodecyl-&beta ;-D-maltopyranoside | Anatrace | D310A | |
| Phosphate de potassium monobasique | VWR | 97062-346 | composant moyen |
| RC 6 Plus Centrifugeuse Thermo | Scientific Sorvall | 46910 | équipement |
| SIGMAFAST inhibiteur de protéase comprimés cocktails, Sans EDTA | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Hydroxyde de sodium | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Phosphate de sodium dibasique | Sigma-Aldrich | S7907 | Composant moyen |
| Filtre à seringue stérile de 25 mm avec 0,2µ ; m membrane PES | VWR | 28145-501 | matériel de laboratoire |
| Filtre stérile jetable avec 0,2µ ; m membrane PES | Thermo Scientific | 596-4520 ; | Matériel de laboratoire |
| Superdex 200 10/300 GL ; | GE Healthcare ; | ||
| Superose-12 10/300 GL colonne ; | GE Healthcare ; | ||
| densimètre Ultrospec 10 cellules | GE Healthcare ; | Equipement | 80211630 |
| Sulfate de zinc monohydraté | Acros | AC38980-2500 ; | Composant moyen |
Références
- Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
- Tautermann, C. S. GPCR struc....
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Réimpressions et autorisations
