Denne protokollen demonstrerer hvordan å få en lav oppløsning ab initio modell og strukturelle detaljer i et vaskemiddel-solubilized membran protein i løsning med liten vinkel neutron spredning med kontrast-matching av vaskemiddel.
Biologiske liten vinkel neutron spredning apparatet med høy-Flux isotop reaktoren i Oak Ridge National Laboratory er dedikert til etterforskningen av biologisk materiale, biodrivstoff behandling og bio-inspirert materialer dekker nanometer til mikrometer lengde skalaer. Metodene presenteres her for å undersøke fysiske egenskaper (dvs. størrelse og form) av membran proteiner (her, MmIAP, en intramembrane aspartyl protease fra Methanoculleus marisnigri) i løsninger av micelle-forming vaskemidler er velegnet for liten vinkel neutron spredning instrumentet, blant andre. Andre Biofysiske karakterisering teknikker er hindret av deres manglende evne til å løse vaskemiddel bidragene i en protein-rengjøringsmiddel kompleks struktur. Dessuten gir tilgang til Bio-deuterasjon (deuterering) Lab unike muligheter for utarbeidelse store nærområdet og uttrykke deuterium-merket proteiner for forbedret spredning signalet fra protein. Mens denne teknikken gir ikke strukturelle detaljer i høy oppløsning, strukturelle kunnskapen hullet for membran proteiner inneholder mange adresserbare områder av forskning uten nær Atom løsning. For eksempel omfatter disse områdene fastsettelse av oligomeric stater, komplekse formasjon, conformational endringer under forstyrrelsene og folding/unfolding arrangementer. Disse undersøkelsene kan lett oppnås gjennom programmer av denne metoden.
Membran proteiner er kodet av anslagsvis 30% av alle gener1 og representerer en sterk flertallet av mål for moderne medisinsk narkotika. 2 disse proteinene utfører en rekke viktige cellulære funksjoner,3 men til tross for sine overflod og betydning, representerer bare ca 1% av totale strukturer avsatt i forskning Collaboratory for strukturelle bioinformatikk (RCSB) Protein Data Bank. 4 deres delvis hydrofobe naturen strukturelle fastsettelse av membran-bundet proteiner har vært meget utfordrende. 5 , 6 , 7
Som mange Biofysiske teknikker krever monodisperse partikler i løsningen for måling, har isolere membran proteiner fra innfødte membraner og stabilisere disse proteinene i en løselig etterligne av innfødte membraner vært et aktivt område av forskning i siste tiår. 8 , 9 , 10 disse undersøkelsene har ført til utviklingen av mange romanen amphiphilic samlinger til solubilize membran proteiner, slik som nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 og amphipols. 16 , 17 men bruk av vaskemiddel micelles fortsatt en av de vanligste og enkel tilnærmingene for å oppnå løselighet kravene til et bestemt protein. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 dessverre ingen enkelt vaskemiddel magisk blanding av vaskemidler ikke finnes eller som tilfredsstiller alle membran proteiner; Dermed må disse forholdene bli empirisk vist for de unike kravene hver protein. 26 , 27
Vaskemidler montere selv i løsning over deres kritisk micelle konsentrasjon skjemaet samlede strukturer kalt micelles. Micelles består av mange vaskemiddel monomerer (vanligvis varierer fra 20-200) med hydrofobe alkyl kjeder danner en micelle kjerne og hydrofile hodet grupper ordnet i et micelle ytterlag overfor vandig løsemiddelet. Virkemåten til vaskemidler og micelle formasjon har blitt klassisk beskrevet av Charles Tanford The hydrofobe,28 og størrelser og former av micelles fra vanlige vaskemidler i membranen protein studier har vært preget med liten vinkel spredning. 29 , 30 vaskemiddel organisasjon om membran proteiner også har vært studert, og dannelsen av protein-rengjøringsmiddel komplekser (PDC) forventes med vaskemiddel molekyler rundt protein i en ordning som ligner pen vaskemiddel micelles. 31
En ekstra fordel i bruker rengjøringsmidler er at de resulterende micelle egenskapene kan manipuleres ved å innlemme andre vaskemidler. Mange vaskemidler utstilling ideell blanding, og velg egenskaper av blandet micelles selv kan forutsies fra komponenter og forholdet mellom miksing. 22 men tilstedeværelsen av vaskemiddel kan fortsatt presentere utfordringer for Biofysiske karakteristikkene ved å bidra til det totale signalet. For eksempel røntgen og lysspredning teknikker er signal fra vaskemiddel i PDCEN nesten utvisket fra protein. 32 undersøkelser med enkelt-partikkel cryo-elektronmikroskop (cryo-EM) vanligvis stole på fanget (frossen) partikler; strukturelle detaljer i protein er fremdeles skjult av visse vaskemidler eller en høy konsentrasjon av vaskemiddel som legger til bakgrunnen. 33 alternative tilnærminger mot tolke full PDC strukturen (inkludert vaskemiddel) er gjort gjennom beregningsorientert metoder som søker å rekonstruere smuss rundt et gitt membran protein. 34
For tilfelle av neutron spredning produserer core-shell ordningen av vaskemiddel i micelle en formfaktor som bidrar til den observerte spredningen. Heldigvis kan løsningskomponenter endres slik at de ikke bidrar til netto observert spredning. Denne “kontrast matchende” prosessen oppnås ved å erstatte deuterium for hydrogen for å oppnå en spredning lengde tetthet som samsvarer med bakgrunnen (buffer). Et fornuftig valg av vaskemiddel (med tilgjengelig deuterated kolleger) og deres forhold blanding må vurderes. For vaskemiddel micelles, kan denne erstatningen utføres bruk et vaskemiddel med samme leder gruppen, men har en deuterated alkyl kjede (d-halen i stedet for h-tail). Siden vaskemidler er godt blandet,35 sine aggregater vil ha en spredning lengde tetthet som er en føflekk-brøkdel vektet gjennomsnitt av de to komponentene (h haler og d haler). Når denne gjennomsnittlig kontrast er konsekvent med at gruppen leder, samsvarer uniform samlet strukturer fullt for å fjerne alle bidrag til observert spredning.
Vi presenterer her en protokoll for å manipulere neutron kontrasten vaskemiddel micelles ved å innlemme kjemisk identisk vaskemiddel molekyler med deuterium-merket alkyl kjeder. 19 , 36 , 37 Dette tillater samtidig kontrast matching av micelle kjernen og shell, som er en unik evne neutron spredningsprosent. 35 , 38 med denne betydelig raffinert detaljnivå, kontrast matchende kan aktivere ellers unfeasible studier membran proteinstrukturer. I tillegg kan denne kontrast som utvides til andre systemer som involverer vaskemiddel, som polymer exchange reaksjoner39 og olje-vann dispergeringsmidler,40 eller til andre solubilizing stoffer, som bicelles,41 nanodiscs,42 eller blokker copolymers. 43 A lignende tilnærming som beskrevet i dette manuskriptet, men ansette én vaskemiddel Art med delvis deuterium erstatninger for alkyl kjede og/eller leder gruppen, ble nylig publisert. 37 mens dette kan forventes å forbedre tilfeldig fordeling av hydrogen og deuterium gjennom smuss sammenlignet tilnærmingen som presenteres her, begrenset antall tilgjengelige plasseringer i vaskemiddel for substitusjon og to-trinns vaskemiddel syntese kreves positurer flere utfordringer for vurdering.
Trinn 1 og 2 av protokollen vises nedenfor ofte overlapper siden første eksperiment planlegging må gjøres for å sende inn en kvalitet forslag. Men forslaget innlevering regnes som første skritt for å understreke at denne prosessen skal startes forveien en neutron eksperiment. Det bør også bemerkes at en forutsetning, som bør bli demonstrert av forslaget, er å ha biokjemiske og fysiske karakterisering (inkludert renhet og stabilitet) av prøven støtte behovet for Nøytron studier. En generell diskusjon om liten vinkel neutron spredning (San) er utenfor omfanget av denne artikkelen. En kort, men grundig innføring er tilgjengelig i den referanse arbeidet Karakterisering av materialer av Kaufmann,44 og en omfattende lærebok fokusert på biologiske liten vinkel løsning spredning er nylig publisert. 45 ytterligere anbefalt lesing er gitt under diskusjon. Liten vinkel spredning bruker såkalte spredning vektoren Q som sentrale antallet som beskriver spredning. Denne artikkelen bruker allment akseptert definisjon Q = 4π synd (θ) / λ, der θ er halvparten vinkelen mellom innkommende og spredt stråle og λ er bølgelengdeområdet av neutron stråling i Ångstrøm. Andre definisjoner finnes at bruk forskjellige symboler som er “for spredning vektoren, og at avvike ved en faktor 2π eller nanometer i stedet for Angstrom (se diskusjon av Figur 10).
Strukturell biologi forskere utnytte komplementære strukturelle teknikker som løsning spredning å hente biokjemiske og strukturelle detaljer (som størrelsen og form) fra biomolecules i løsningen. SANS er en spesielt attraktivt teknikk for å bestemme lav oppløsning strukturer av membran proteiner, en kjerne fokus på moderne strukturell biologi og biokjemi. SANS krever mengder renset proteiner sammenlignbare med krystallografisk forsøk (1 mg/sampling). Nylig voksende kommersielle tilgjengeligheten av høy renhetsg…
The authors have nothing to disclose.
Office av biologiske og miljøforskning støttes forskning på ORNL’S Center for strukturelle molekylærbiologi (CSMB) og Bio-SANS bruker fasiliteter støttes av vitenskapelige bruker fasiliteter divisjon, Office for energi basalfag, US Department energi. Strukturelle arbeidet på membran proteiner i Lieberman lab har blitt støttet av NIH (DK091357, GM095638) og NSF (0845445).
Amicon Ultra MWCO 50KDa concentrator | EMD Millipore | UFC905096 | labware |
Ammonium citrate dibasic | Fisher Scientific | A663 | medium component |
Ammonium sulfate | EMD Millipore | 2150 | medium component |
Bioflo 310 Bioreactor System | Eppendorf | M1287-2110 | equipment |
Calcium chloride dihydrate | Acros | 423525000 | medium component |
Carbenicillin | IBI Scientific | IB02025 | antibiotic |
Chloramphenicol | EMD Millipore | 3130 | antibiotic |
Cobalt (II) chloride | Acros | AC21413-0050 | medium component |
Copper (II) sulfate | Acros | AC19771-1000 | medium component |
Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 756822 | medium component |
Drierite Gas Purifier | W.A. Hammond Drierite Co. Ltd. | 27068 | |
EDTA, disodium, dihydrate | EMD Millipore | 4010 | medium component |
Emulsiflex-C3 | Avestin | EF-C3 | equipment |
Äkta Purifier UPC100 | GE Healthcare | equipment | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | medium component |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR column | GE Healthcare | 17116701 | |
Imidazole | VWR | 97064-622 | |
IPTG | Teknova | I3325 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | MP Biochemicals | ICN19404590 | medium component |
LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425-2 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | VWR | 97062-134 | medium component |
Manganese(II) sulfate monohydrate | Acros | AC20590-5000 | medium component |
MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | equipment |
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310T | |
n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside | Anatrace | D310A | |
Potassium phosphate monobasic | VWR | 97062-346 | medium component |
RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific Sorvall | 46910 | equipment |
SIGMAFAST protease inhibitor cocktail tablets, EDTA-free | Sigma-Aldrich | S8830 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | medium component |
Sterile 25mm syringe filter with 0.2µm PES membrane | VWR | 28145-501 | labware |
Sterile disposable bottle top filter with 0.2µm PES membrane | Thermo Scientific | 596-4520 | labware |
Superdex 200 10/300 GL | GE Healthcare | 17517501 | |
Superose-12 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517301 | |
Ultrospec 10 Cell Density Meter | GE Healthcare | 80211630 | equipment |
Zinc sulfate monohydrate | Acros | AC38980-2500 | medium component |