Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Levande cellen avbildning av TGF-β/Smad3 signalering utbildningsavsnitt i In Vitro och In Vivo använder ett Adenovirus Reporter System

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för levande cell avbildning av TGF-β/Smad3 signalering verksamhet använder ett adenovirus reporter system. Detta system spårar transkriptionell aktivitet i realtid och kan användas till både enstaka celler in vitro- och in levande djurmodeller.

Abstract

Transforming Growth Factor-beta (TGF-β) signalering reglerar många viktiga funktioner som krävs för cellulära homeostas och är vanligt förekommande i många sjukdomar, inklusive cancer i ökad utsträckning. TGF-β är starkt inblandad i metastaser under sent stadium cancer progression, aktivera en delmängd av flyttfåglar och invasiv tumörceller. Nuvarande metoder för signalering utbildningsavsnitt analys fokuserar på endpoint modeller, som ofta försöker mäta signalering post-hoc- biologiska händelsen och återspeglar inte de progressiva naturen av sjukdomen. Här visar vi en roman adenovirus reporter systemet specifikt för den TGF-β/Smad3 signalväg som kan upptäcka transkriptionell aktivering i levande celler. Utnyttja en Ad-CAGA12-Td-Tom reporter, kan vi uppnå en 100% infektionsfrekvensen av MDA-MB-231 celler inom 24 h in vitro. Användning av en fluorescerande reporter möjliggör avbildning av levande enstaka celler i realtid med direkt identifiering av transcriptionally aktiva celler. Stimulering av infekterade celler med TGF-β visar endast en delmängd av celler som är transcriptionally aktiv och engagerad i specifika biologiska funktioner. Detta tillvägagångssätt möjliggör hög specificitet och känslighet på en enda cell-nivå att öka förståelsen av biologiska funktioner relaterade till TGF-β signalering i vitro. Smad3 transkriptionell aktivitet kan också rapporteras i vivo i realtid genom tillämpning av en Ad-CAGA12- Luc reporter. Ad-CAGA12- Luc kan mätas på samma sätt som traditionella stabilt transfekterade luciferas cellinjer. Smad3 transkriptionell aktiviteten i cellerna implanteras i vivo kan analyseras genom konventionella IVIS imaging och övervakas live under tumör progression, vilket ger unika insikter om dynamiken i den TGF-β signalvägen. Våra protokollet beskriver en fördelaktiga reporter leveranssystem möjliggör snabb hög genomströmning avbildning av levande cell signalering vägar både in vitro- och in vivo. Denna metod kan utökas till en rad bilden baserat analyser och presenterar som en känslig och reproducerbar metod för både grundläggande biologi och terapeutisk utveckling.

Introduction

Transforming Growth Factor beta (TGF-β) är en viktigt cytokin inblandad i mänsklig utveckling som signalerar genom en heterodimeriskt komplex bestående av typ II och typ I-receptorer1. Bindning till typ II receptor resulterar i rekrytering och fosforylering av typ I-receptorn, som i sin tur phosphorylates nedströms Smad2/3 proteiner2,3. Dessa aktiveras Smad2/3 proteiner binder till Smad4, bildar ett komplex som translocates in i cellkärnan och reglerar gen transkription4. Homeostatiska villkor TGF-β/Smad är signalering hårt reglerad; dock i många sjukdomar, signalvägen är avreglerade och ofta i ökad utsträckning leder till progression av sjukdomen5,6,7. Nyligen genomförda studier har visat att cellulära svar på TGF-β är heterogen och subpopulationer av TGF-β/Smad aktiva celler är ansvariga för biologisk funktion i en tidsberoende sätt8,9. Gemensam cellular analys av TGF-β/Smad signalering innebär användning av fast slutpunkt analyser som ger endast en ögonblicksbild av cellulär aktivitet och ofta kvantifiera de genomsnittliga TGF-β/Smad effekt10. Dessa metoder, men kan inte korrekt representera molekylär beteenden av TGF-β/Smad signalering i det fysiologiska tillståndet under sjukdomsförloppet. Image-baserad analys av levande celler fånga dynamiken i cellulär och biologiska processer med både rumsliga och tidsmässiga förståelse.

Vårt mål var att utveckla en känslig hög genomströmning metod för levande cell avbildning av TGF-β/Smad signalering med adenovirus-baserade reagens. Här, infekterade vi mänskliga bröstcancer cancer cell linjen MDA-MB-231 med ett adenovirus som uttrycker Smad3 CAGA motiv bindande sekvensen och ett luciferas (Luc) eller Td-tomat (Td-Tom) reporter gen. Adenovirala reporter system ger en snabb och billig metod för plasmid introduktion som kan resultera i en 100% infektionsfrekvensen i cancer cellinjer. Adenovirala reporter system har också tillämpats framgångsrikt på cellinjer som är svåra att transfect med konventionella plasmid11. I detta protokoll kommer vi att beskriva en reproducerbar och icke-invasiv process för att uppnå levande cell avbildning av den TGFβ/Smad signalvägen både i vivo och in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av University of Melbourne djur etikkommittén.

Obs: Sekvens-, bygg- och generation protokollet för den adenovirala vektorer pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP och pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom har varit tidigare beskrivna11,12, 13. Alla vektorer är kommersiellt tillgängliga.

1. virus titerbestämning med 50% vävnadskultur smittsam dos (TCID50)

  1. Bered 1 x 106 HEK293A celler i 10 mL DMEM + 10% FBS media.
  2. Utsäde 100 µL cellsuspension i varje brunn av en platta med 96 brunnar platt-nedersta cellen i kultur.
  3. Laga 1 mL av en 1: 100 utspädning av virus lager i komplett medium. Tillsätt 11 µL utspädda virus till varje brunn i kolumn 1.
  4. Utföra seriespädningar 10-faldig direkt i 96 väl plattan genom att blanda 11 µL utspädda virus med 100 µL cellsuspension tills en slutlig spädning 1 x1012 nås. Även om cellerna är icke-anhängare i detta skede, antalet celler överförs mellan brunnar förblir konstant.
  5. Pipettera 11 µL av varje utspädning i varje kolumn börjar med den högsta utspädningen av 104. Ersätta pipettspetsar med varje utspädning att begränsa cross-over av viruspartiklar.
  6. Tillsätt 11 µL virusfria komplett media i kolumn 12 som en negativ kontroll.
  7. Inkubera plattan i 7-10 dagar vid 37 ° C med 10% CO2.
  8. Med Mikroskop Poäng antalet brunnar i varje kolumn visar tecken på cytopatisk eller cytotoxiska effekter. Överväga en väl positiv om det finns några tecken på infektion.
  9. Beräkna andelen positiva brunnar för varje utspädning med Reed och Muench (1938) statistisk metod14.
  10. Beräkna den proportionella avstånd (PD): (A-50)/(A-B), där A är den procentuella Svaren ovan eller lika med 50% och B är den procentuella Svaren under 50%.
  11. Beräkna TCID50 : 10X-PD, där X är utspädningen ett svar som är större än 50%.
  12. Beräkna viral titer från använder följande: 0,69 / (0,011 x TCID50) PFU/mL

2. adenovirus MOI bestämning

  1. Utsäde 1,0-1,5 x 105 MDA-MB-231 celler med 500 μL av DMEM kultur media som innehåller 5% FBS i varje brunn en 12 väl plåt (35% cell konfluens, 6 brunnar totalt).
  2. Beräkna volymerna av Ad-CMV-Td-Tom lager krävs för 0, 250, 500, 2500 och 5000 MOI användande följande formel: MOI = (volym [μL] x PFU/μL) / antalet celler. För Ad-CMV-Td-Tom med en titer på 1 x 1010 (PFU/mL), volymerna av virusinfektion är krävs MOIs 0, 3,75, 7.5, 37,5 och 75 μl respektive.
  3. Infektera cellerna med de beräkna volymerna av Ad-CMV-Td-Tom i avsnitt 2.2 genom direkt pipettering viral lager i brunnar med omsorgsfull blandning.
  4. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C med 10% CO2 för 24 h.
  5. Ta bort mediet från brunnarna och omedelbart åtgärda cellerna med 500 μL 10% formalin för 5 min.
  6. Aspirera i formalin från brunnarna och Tvätta brunnarna med 500 μL av PBS en gång.
  7. Fläcken cellkärnan med 500 μL av Hoechst lösning för 5 min.
  8. Ta bort Hoechst lösningen och Tvätta brunnarna med 500 μL av PBS 3 gånger.
  9. Bild proteinet Td-tomat och cellkärnan signal med 200 X förstoring på fluorescens Mikroskop. Excitera Td-tomat protein på 554 nm och Hoechst färgämnet på 352 nm.
  10. Analysera bilder med ImageJ för att avgöra den arbetande MOI krävs för 100% infektion i Td-tomat15.

3. dual-adenovirus transduktion i levande enstaka celler

  1. Utsäde 1,0-1,5 x 105 MDA-MB-231 celler med 500 μL av DMEM kultur media som innehåller 5% FBS i varje brunn en 12 väl plåt (35% cell konfluens, 2 brunnar totalt).
  2. Infektera celler med 75 μL av Ad-CMV-GFP (titer = 5 x 109 PFU/mL) och 7,5 μL av Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL) att få en 2500 MOI, som kan uppnå 100% infektion positivitet.
  3. Behandla celler med eller utan 0,25 μL av TGF-β per brunn (10 mg/mL i lager, 5 ng/μl som slutliga koncentration) omedelbart efter adenovirus infektion.
  4. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C med 10% CO2 för 24 h.
  5. Bild levande celler med fas kontrast fluorescens Mikroskop. Excitera GFP vid 470 nm och Td-tomat protein på 554 nm.
  6. Fixa celler och fläcken cellkärnan som beskrivs i steg 1,6 - 1,9.
  7. Bild proteinet Td-tomat och Hoechst fläcken med fluorescens Mikroskop. Excitera Hoechst färgämnet på 352 nm.
  8. Använda ImageJ, beräkna procentandelen av god Jordbrukarsed och Td-tomat positiva celler15.

4. levande enda cellsignalering sårläkning i Assay

  1. Utsäde 4-5 x 105 MDA-MB-231 celler med 1 mL av DMEM kultur media som innehåller 5% FBS i varje brunn en 6 väl plåt (50% cell konfluens, 2 brunnar totalt).
  2. Infektera cellerna med 22,5 μL av Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500).
  3. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C med 10% CO2 för 24 h.
  4. Repa två korsade linjer på celllagrar av varje brunn med hjälp av en P200 pipettspetsen.
  5. Ta bort det gamla mediet från brunnar och ersätta med 2 mL färsk 5% FBS media med eller utan 0,5 μL av TGF-β per brunn (10 mg/mL i lager, 5 ng/μl som slutlig koncentration).
  6. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C med 10% CO2 för 5 min och ta bilder av valda såret områden med 100 X förstoring på fas kontrast Mikroskop.
  7. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C med 10% CO2 för 24 h.
  8. Ta bilder av sårslutning på samma områden som före.
  9. Fixa cellerna, fläcken cellkärnan som beskrivs i steg 1,6 - 1,9 och visualisera Td-tomat signal i sårområdet och icke-sårområdet med 200 X förstoring på fluorescens Mikroskop.
  10. Kvantifiera andelen Td-tomat positiva celler i såret och icke-sårområdet med ImageJ programvara15.

5. in Vitro luciferas Assay

  1. Förbered en cellsuspension av 3-5 x 104 MDA-MB-231 celler i 1 mL av DMEM media som innehåller 5% FBS.
  2. Infektera cellsuspension med 2,5 μl Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500).
  3. Utsäde de infektera cellerna i en 96 tallrik väl på 3 000 celler/100 µL per brunn.
  4. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C med 10% CO2 för 24 h.
  5. Ta bort gamla medier från brunnar och ersätta med 100 µL av färska 5% FBS media med eller utan 0.1 μl av TGF-β per brunn (1 mg/mL i lager, 1 ng/μl som slutliga koncentration) och i närvaro eller frånvaro av 0.17 μL av TGF-β-hämmare per brunn (7 mg/mL i lager 12 ng/μl som slutlig koncentration) (en roman TGF-β ligand fälla protein, Chen et al., opublicerade verk).
  6. Placera plattan i inkubatorn vid 37 ° C med 10% CO2 för 24 h.
  7. Tina upp luciferas assay system substratet och förbereda 1 x cell kultur lysis reagens i dubbel destillerat vatten (DDW).
  8. Ta bort medier från 96 brunnarna och lysera brunnar med 50 μL 1 x cell kultur lyseringsbuffert på is med orbitalskak med försiktig skakning i 30 min.
  9. Överföra 30 μL av lysat från varje brunn i en ogenomskinlig luciferas plattan och låt plåten värmas upp till rumstemperatur.
  10. Luminometer mjukvaran, skapa ett nytt protokoll. Välj för 1 insprutare med mätningar före och efter injektion. Ange mått före injektion på 1 s för både fördröjning i mätning och Integration tid. Efter injektion mätning, anges Injektionsvolymen till 40 µL med fördröjning i mätning 1 s efter injektion och 5 s Integration tid. Bekräfta inställningarna genom att välja OK.
  11. Ställ injektor röret i DDW och klicka på knappen insprutare 1 under Prime inställningar att rengöra spridare röret före användning. Nästa bort injektor röret från DDW och plats i luften följt av två ytterligare primtal av injektor 1 att spola alla lösning från röret. Ställ injektor röret i Firefly substrat och igen Prime två gånger för att förbereda underlaget.
  12. Placera ogenomskinlig luciferas plattan med prover i luminometern och välj alternativ på programvaran. Markera brunnarna av intresse och klicka på Verkställ. Tryck på Starta för att mäta luciferas signal.
  13. När mätningar är klar, ta ut och skölj plattan med vatten. Återställa alla återstående substrat i injektorn röret genom att placera röret i luft och Prime insprutare 1 tillbaka till firefly substrat tube. Ställ injektor röret i DDW och utföra två ytterligare primtal för att rengöra spridare röret av eventuella återstående substrat.

6. cell förberedelse för levande signalering Imaging In Vivo

  1. 48 timmar före tumör implantation, utsäde 2-3 x 106 MDA-MB-231 celler till 175 cm2 kolvar (10 flaskor totalt). Kultur celler i 20 mL DMEM media som innehåller 5% FBS vid 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 h senare lägga till 300 μL Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2500) i varje kolv. Hålla celler i kulturen för en annan 24 h.
  3. På dagen för implantation, ta bort det gamla mediet och tvätta adenovirus smittade cellerna en gång med 20 mL PBS, pH 7,4. Tillsätt 2 mL 0,05% trypsin-EDTA i kolven och skaka kolven lite för att tillåta trypsin att täcka alla kolv ytan. Placera kolven i inkubatorn 37 ° C, 10% CO2 för 3 min.
  4. Släcka trypsin genom att tillsätta 8 mL FBS-innehållande DMEM media till kolvar. Över alla cellsuspensioner till en glasflaska reagens.
  5. Räkna antalet cell med en hemocytometer och överföra 4.8 x 107 celler i två 50 ml centrifugrör.
  6. Centrifugera cellerna vid 400 x g i 5 min på RT ta bort trypsin och resuspendera cellerna i 720 mL färsk FBS-DMEM media.
  7. Överför cellsuspensioner till en steril 5 mL tub och tillsätt 160 μL Matrigel (10% totala matrigel suspension).
  8. Hålla celler på is tills implantation.

7. ortotop Implantation

  1. Väga 12 SCID möss och slumpmässigt fördela möss i kontroll- och behandlingsgrupperna grupper (6 möss/grupp).
  2. Utföra implantation i en steril bio-skåp att upprätthålla en steril miljö. Bedöva musen använder 2,5-4,5% isofluran med en syre flöde av 1 L/min. plats med musen på en hetta madrassera och fördela en droppe smörjande ögonsalva på båda ögonen att undvika korneal skada. Fixa musen till värme pad i ryggläge medan underhålla anestesi genom att placera nosen i en Kona ansluten till isofluran.
  3. Bekräfta framgången för anestesi av bristen på reaktion till tå nypa. Minska isofluran till en underhållsdos på 1,5-2,5% med 1 L/min syre för påminnelsen för implantation.
  4. Ren huden från fjärde bröstvårtan på båda sidor till mittlinjen med en bomullstuss doppad i 80% etanol.
  5. Hitta den 4: e mjölkkörtlar fett pad genom palpation och pressa fettet pad att ytterligare utsätta vävnaden.
  6. Blanda cellsuspensionen väl genom pipettering upp och ner. Försiktigt aspirera 50 µL av cell blandning i en 27G insulinspruta och injicera i mjölkkörtlar fettet pad på båda sidorna av musen.
  7. Bekräfta en framgångsrik injektion av känsla för svullnad av fett pad. Frigöra fettet pad försiktigt och Placera musen tillbaka i buren.
  8. Lämna burarna på värme pad för minst 30 min att låta mössen att få medvetande och sedan placera burar tillbaka i jordbruksföretaget rummet för 3 dagar.

8. IVIS Imaging

  1. Öppna programvaran Levande bild .
  2. Initiera IVIS systemet genom att klicka på knappen Initiera IVIS System på Kontrollpanelen. Vänta tills tecknet temperatur blir grön.
  3. Välj självlysande Imaging läge på Kontrollpanelen.
  4. Slå på isofluran anestesi till kammaren och IVIS system.
  5. Bedöva möss med 2,5-4,5% isofluran med 1 L/min syre. En gång bedövat, ange isofluran på 1,5-2,5% för underhåll. Injicera möss 150 mg/kg kroppsvikt av D-luciferin intraperitoneal (IP) injektion.
  6. Omedelbart överföra möss i IVIS systemet, placera dem på temperaturkontrollerade imaging plattformen och placera sin näsa i näsan konen.
  7. Klicka på knappen Sekvens inställningar på Kontrollpanelen och välj Medium Binning.
  8. Ställa in imaging exponeringstiden enligt följande: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s. Start imaging cirka 3 min efter luciferin injektionen och fortsätta att bild tills signalen börjar sjunka (normalt detta tar ca 20 min).
  9. Ta bort mössen från IVIS bibehållen isofluran narkosmedel genom en kona och behandla möss med 50 µL PBS eller 50 µL TGF-β signalering hämmare (50 μg/tumör) via intra-tumör injektion.
  10. Sätta mössen tillbaka i buren och lämna dem på värme pad för minst 30 min. Placera sedan buren tillbaka i jordbruksföretaget rummet.
  11. Upprepa IVIS imaging proceduren som beskrivs ovan dagen efter behandlingen.

9. dataanalys

  1. Öppna sparade filer i Living bildbehandlingsprogram.
  2. Hitta informationen i vyn | Bildinformation.
  3. Välj bilder tagna vid en liknande tid med samma exponeringstiden. Ladda bilder som en grupp.
  4. Avmarkera rutan enskilda i Bild justera att normalisera intensiteten.
  5. Välj Photon läge att analysera intensiteten. Kvantifiera intensiteten av signalen genom att välja knappen Regionen av intresse (ROI) i ROI-verktyg.
  6. Dra ROI cirkeln till regionen som innehåller självlysande signalen och klicka på måttknappen för att förvärva signalintensitet .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Live enda cell imaging in vitro-

För att korrekt bedöma aktivering av TGF-β/Smad signalering i enstaka celler med adenovirus baserat reagens, är det viktigt att först bestämma den optimala Multiplicity av infektion (MOI) för varje cellinje. Den optimala MOI bestäms när 100% av cellerna är positivt för adenovirala infektion utan närvarande cytopatisk eller cytotoxiska effekter. För att avgöra detta, använde vi en konstitutivt aktiv Ad-CMV-Td-Tom -reporter som agerat som en markör för positiva infektion. Procentandelen av adenovirus infekterade celler ökade på ett MOI beroende sätt från 0 till 5 000 MOI. Vid 2500 MOI observerade vi 100% Td-Tom uttryck i MDA-MB-231 celler (figur 1A, 1B). Pixel intensitet/cell ökade också med MOI, som ger förbättrad känslighet och detektion av transkriptionell utdata (figur 1 c). Därför användes en fungerande MOI på 2,500 att utföra en dubbel infektion där celler var infekterade med Ad-CMV-GFP (serveras som positiv kontroll för cell infektion) och Ad-CAGA12-Td-Tom samtidigt. Enstaka celler presenterade varierande nivåer av Td-Tom uttryck som anger heterogen aktivering av TGF-β/Smad3 transkription över celler i såväl fasta som levande celler. (Figur 2A, 2B). 100% av MDA-MB-231 celler presenteras med GFP uttryck medan endast cirka 26% av celler visas detekterbara TGF-β/Smad3 transkriptionell aktivitet 24 h efter TGF-β stimulering, jämfört med 0% positivitet utan TGF-β behandling (figur 2 c). För att använda adenovirus baserat reagensen för att undersöka aktiviteten TGF-β/Smad3 transkriptionell under biologiska processer, var MDA-MB-231 celler infekterade med Ad-CAGA12-Td-Tom på 2500 MOI och utsätts för en sårläkning assay. Infekterade MDA-MB-231 celler uppvisade normala migration beteende och celler behandlas med 5 ng/mL TGF-β visade förbättrad sårslutning jämfört med icke-TGF-β behandlade cellerna (figur 3A). Särskilt, cirka 62% celler i sårområdet fram positiva TGF-β/Smad3 transkriptionell aktivitet, vilket är betydligt högre än hos icke-sårområdet (32%) efter TGF-β behandling (figur3B). Som sådan, verifieras adenovirus-baserade reagenserna deras tillämpning för avbildning av den TGF-β signalvägen i levande enda cell i vitro.

Live TGF-β signalering imaging i vivo

Känsligheten hos Ad-CAGA12- Luc reportern var första testade in vitro- svar till TGF-β stimulering och förekomsten av TGF-β-hämmare. När infekterade MDA-MB-231 celler stimuleras med 1 ng/mL TGF-β, luciferas reporter aktivitet ökade 1,200-fold jämfört med basala obehandlad MDA-MB-231 nivåer. Detta svar var anmärkningsvärt blockeras av 12 µg/mL av TGF-β-hämmare (figur 4A). Den Ad-CAGA12- Luc reagens testades därefter i en bröst tumör ortotop implantation djurmodell. Både kontroll och den TGF-β-hämmaren behandlade grupper visat liknande luciferas reporter aktivitet innan behandling. Dock för kontrollgruppen ändras luciferas signalen inte efter PBS behandling, medan möss behandlades med den TGF-β-hämmare visade ca 3-faldig signal minskning (figur 4B, 4 C). Sammantaget visar dessa resultat potentialen för live och realtid övervakning av TGF-β signalering verksamhet i vivo utan behov av djuroffer.

Figure 1
Figur 1. Bestämning av MOI adenovirus-baserade reagens. MDA-MB-231 celler var infekterade med Ad-CMV-Td-Tom på olika MOI och seedad till en 12 brunnar platta. 24 h efter infektion, celler var fast och nukleära färgas av Hoechst. (A) bilder togs att visualisera Td-Tom positiva celler (röd) och nucleus (blå) och kvantifieras i ImageJ. (B) andel av Td-Tom positiva celler. (C) Td-Tom pixel intensitet/cell normaliserade till bakgrunden. Dessa siffror är representativa för minst 3 oberoende experiment. Data som visas är medel för exemplar ± SD. skala bar = 50 µm (200 X). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Enstaka cell tänkbar för dubbla infektion. MDA-MB-231 celler var dubbla infekterade med Ad-CMV-GFP och Ad-CAGA12-Td-Tom på MOI (2 500) och seedad till en 12 brunnar platta. 24 h efter infektion, celler behandlades med eller utan 5 ng/mL TGF-β. (A) 24 h efter behandling, celler var levande avbildas för att visualisera GFP positiva (grön) och Td-Tom positiva (röda) celler. Cellerna var sedan fixeras och nukleära färgas av Hoechst för kvantifiering. (B) bilder togs att visualisera GFP positiva (grön), Td-Tom positiva (röda) celler och nucleus (blå). (C) The GFP eller Td-Tom positiva celler kvantifierades genom ImageJ och andelen positiva celler har beräknats. Dessa siffror är representativa för minst 3 oberoende experiment. Data som visas är medel för exemplar ± SD. statistisk signifikans bestämdes av Students t-test (*** p ≤0.0001). Skalstapeln = 50 µm (200 X). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Levande cellsignalering TGF-β främjar cellmigration. MDA-MB-231 celler var infekterade med Ad-CAGA12-Td-Tom på MOI (2 500) och seedade på 6 wells plåt. 24 h efter infektion, celler var repad med en P200 pipettspetsen för att skapa ett sår och media ersättas med eller utan 5 ng/mL TGF-β. Efter en annan 24 h, celler var fast och nukleära färgas av Hoechst för visuell representation. (A) fas kontrasten i sårslutning, skala bar = 100 µm (100 X). (B) Td-Tom positiva (röda) celler och nucleus (blå). Skalstapeln = 50 µm (200 X) (C) Td-Tom positiva celler kvantifierades genom ImageJ och andelen positiva celler beräknades. Dessa siffror är representativa för minst 3 oberoende experiment. Data som visas är medel för exemplar ± SD. statistisk signifikans bestämdes av Students t-test (*** p ≤0.0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. In vivo live TGF-β signalering imaging. (A) MDA-MB-231 celler var infekterade med Ad-CAGA12- Luc och sedan seedade i 96 brunnarna plattan för 24 h. Därefter behandlades celler med eller utan 1 ng/mL TGF-β i närvaro eller frånvaro av 12 µg/mL TGF-β-hämmare över natten. Luciferas aktiviteten mättes baseras på hela cell lysate. Luciferas verksamhet presenterades som luckan av induktion normaliserade till ingen behandling kontroll. Data som visas är medel för exemplar ± SD. (B) MDA-MB-231 celler var infekterade med Ad-CAGA12- Luc 24 h före implantation. Cellerna var implanteras i mjölkkörtlar fett pad på båda sidor av SCID möss. 72 h senare IVIS imaging utfördes före och efter 24 h behandling (PBS för kontrollgruppen) och 50 µg/tumör TGF-β-hämmare för behandlingsgrupp. (C) Photon flux kvantifierades genom Living bildbehandlingsprogram. Data som visas är medel för varje behandlingsgrupp (n = 12) ± SD. statistisk signifikans bestämdes av Students t-test (** p ≤0.01, *** p ≤0.0001). p/s refererar till fotoner/s. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har utvecklat en teknik för att möjliggöra realtid avbildning av TGF-β/Smad3 signalering i enda levande celler. Med denna nya metod, har vi tidigare identifierat en subpopulation av celler med dynamisk TGF-β/Smad3 transkriptionell aktivitet som associerades med förbättrad invasion och migration8. Metoden förbättrar på traditionella analyser för TGF-β signalering, såsom western blotting av Smad3 fosforylering och TGF-β riktade genuttryck, genom att fånga heterogenitet av TGF-β/Smad3 signalering inom tumör befolkningen och lyfta fram den betydelsen av enstaka cellbiologi. Dessutom alternativa metoder för enstaka cell imaging såsom translokationen i cellkärnan kan vara tidskrävande och dyrt om utförs i levande celler och kan inte alltid översätta till genen transkription16,17. Medan dessa metoder är viktiga att undersöka de uppströms vägarna av signaltransduktion, ger adenovirus reporter systemet ett unikt perspektiv på TGF-β/Smad3 signalering i enskilda celler i förhållande till biologisk funktion.

Avsevärt, vår metod ger en känslig och reproducerbar metod för i vivo upptäckt av den TGF-β/Smad3 signalvägen i realtid under tumör progression och behandling. Liknar traditionella stabil luciferas i vivo imaging, upptäckt av TGF-β/Smad3 signalering inom musen är beroende på antalet celler och nivå av promotorn aktivitet18. Medan subkutana vävnaden innehåller lite störningar för analys, kommer att ökad skärpedjup celler minska känsligheten för signaldetektion. Det är möjligt att utöka metoden för användning i andra organ, såsom lungor och ben och andra cancerformer; dock rekommenderas signal optimering eller ex vivo imaging att uppnå den känslighet som krävs för cancer modell av intresse.

Ytterligare en fördel med att använda adenovirus reporter systemet är att dess tillämpning är sannolikt att expandera till analys av flera signalvägar samtidigt i levande celler. I figur 2Avisade vi att MDA-MB-231 celler kunde vara sensorik med 2 separata adenovirus vektorer, CMV-GFP och CAGA-TOM. Detta dubbla-infektion-system kan utökas ytterligare för att rapportera två olika signalvägar via både fluorescens reporter proteiner och luciferas reportrar (med Firefly och Guassia luciferas reporter proteiner). Vårt labb har uppnått samtidiga signalering av BMP/Smad1 och TGF-β/Smad3 signalvägar i ett antal levande cancer cellinjer (inga data anges).

Adenovirus reporter system ger en enkel och bekväm metod för levande cell avbildning av den TGF-β/Smad signalvägen både in vitro- och in-vivo. Detta system har tydliga fördelar jämfört med andra vanliga reporter system. För det första, adenovirus vektorer rapporteras att ha bland de högsta viral transduktion effekt, vilket gör dem ett optimalt system för cellinjer som är svåra att transduce19,20,21,22. Dessutom med nuvarande framstegen i viral teknik, kan 'feg' adenovirus vektorer genereras genom att ta bort de flesta av det virala genomet som möjliggör ökad exogent DNA kapacitet23. I jämförelse med icke-virala leveranssystem representerar adenovirus vektorer en kostnadseffektiv, snabb och enkel applicering för cell transduktion som resulterar i betydligt större leverans effektiviteten19,20,21 ,22.

Detta protokoll använder ett andra generationens adenovirus uttryck system, som är replikering-inkompetent i däggdjurs-celler som inte uttrycker E1a och E1b proteinerna, minimera biosäkerhet risk24. Men trots dessa förbättrade biosäkerhet funktioner, adenovirus partiklar kan fortfarande transduce primära mänskliga celler med hög effekt25,26. Amerikanska biosäkerhet nivå 2 och inneslutning av adenovirala vektorer rekommenderas när hantering och kassering av adenovirus kontaminerad utrustning. Storskaliga amplifiering av adenovirus i HEK293A celler kan resultera i en sällsynt generation av replikering-behöriga ”wild-type” adenovirus27. PCR-screening bör utföras för att identifiera vildtyp kontaminering27.

Replikering-inkompetent adenovirus vektorer är övergående i uttryck och integrerar inte med värd DNA20,21. Det rekommenderas att experimenter identifiera stabiliteten i uttryck av deras reporter protein när använda adenovirus reporter systemet för att bekräfta giltigheten av långsiktiga experiment. Uttryck är den adenovirus-vektorn i en cell proportionell till dess uppdelning av cellen och viral MOI. För att säkerställa reproducerbara resultat, är det viktigt att viral titern bestäms exakt för varje viral parti. Dessutom överdrivet höga volymer av adenovirus kan resultera i cytotoxiska eller cytopatisk och det är viktigt att en optimal MOI bestäms empiriskt för varje cell fodrad används för att säkerställa bästa resultat. Vidare kan i vivo användning av adenovirus vektorer framkalla immunsvar; om immunförsvaret inte är primära observationen av experimentet, rekommenderas nedsatt immunförsvar djur20,21. Ytterligare kvalitetskontroll krävs när du använder de adenovirala vektorerna till målet immunsvar, även om användningen av adenovirus har verifierats som ett adjuvans till vaccin terapier28,29.

Adenovirus reporter systemet kan användas på ett brett spektrum av primära och odlade cellinjer av både dela och icke-dividera natur20,22. Med hjälp av adenovirus reporter systemet, vi har uppnått 100% infektionsfrekvensen i ett antal cancer cell linjer inklusive hjärnan, bröstcancer, kolorektal som väl primära mus embryologiska Fibroblast (MEF) och Hundarnas njurar epitelial (MDCK) celler. Dessutom kan adenovirala vektorer ändras ytterligare för att öka affinitet för celltyp specifika receptorer, som ger förbättrad orgel inriktning och effekt för transduktion30,31.

Tillämpningar av denna metod kan utökas till andra signalvägar och cell värdar. Främsta fördelarna med adenovirala reporter systemet är billigt, hög transduktion effekt, experimentell Snabbinstallation och bristen på integration med värd DNA21,32. Denna metod kan tillämpas på många aktuella analyser och i vivo modeller, inklusive utvärdering av nya riktade therapeutics33. Vi hoppas att användningen av denna teknik kommer att öka vår förståelse av förhållandet mellan signalering vägar och biologiska processer som leder till nya biologiska upptäckter och utveckling av nya behandlingsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna rapportera inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från de nationella hälso- och medicinsk forskning rådet (NHMRC) till H-JZ. TMBW är en mottagare av en Australien forskarutbildning Award från den australiska regeringen och Ann Henderson Top-Up-stipendiet från Australian Rotary Health partner med Rotary i Södertälje och Dine efter ett botemedel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).

Tags

Cancerforskning frågan 137 TGF-β levande cell imaging adenovirus cell signalering breast cancer Smad3 transkriptionell aktivering
Levande cellen avbildning av TGF-β/Smad3 signalering utbildningsavsnitt i <em>In Vitro</em> och <em>In Vivo</em> använder ett Adenovirus Reporter System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., … More

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter