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Cancer Research

Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes d’activité signalisation TGF-β/Smad3 utilisant un système de reporter des adénovirus. Ce système suit l’activité transcriptionnelle en temps réel et peut être appliqué à ces deux cellules isolées in vitro et dans l’animal vivantmodèles.

Abstract

Transforming Growth Factor β (TGF-β) signalisation réglemente plusieurs fonctions importantes requises pour l’homéostasie cellulaire et se trouve souvent surexprimé dans de nombreuses maladies, y compris le cancer. TGF-β est fortement impliqué dans les métastases au cours de la progression tardive stade du cancer, activant un sous-ensemble de cellules tumorales migrateurs et envahissantes. Les méthodes actuelles d’analyse de la voie de signalisation se concentrent sur des modèles de point de terminaison, qui souvent tentent de mesurer la signalisation post-hoc de l’événement biologique et ne reflètent pas la nature progressive de la maladie. Ici, nous démontrons un adénovirus roman journaliste système spécifique pour la voie de signalisation TGF-β/Smad3 pouvant détecter l’activation de la transcription dans des cellules vivantes. Utilisant un journaliste Ad-CAGA12-Td-Tom , nous pouvons atteindre un taux de 100 % d’infection des cellules MDA-MB-231 dans 24h in vitro. L’utilisation d’un reporter fluorescent permet pour l’imagerie de cellules vivantes d’unique en temps réel avec une identification directe des cellules transcriptionnellement actives. La stimulation des cellules infectées avec le TGF-β affiche uniquement un sous-ensemble de cellules qui sont transcriptionnellement actif et impliqué dans des fonctions biologiques spécifiques. Cette approche permet de grande spécificité et sensibilité à un niveau de cellule unique pour favoriser la compréhension des fonctions biologiques associés à TGF-β signalisation in vitro. Smad3 activité transcriptionnelle peut également être signalés en vivo en temps réel par le biais de l’application d’une Ad-CAGA12- Luc journaliste. Ad-CAGA12- Luc peut être mesurée de la même manière que les lignées traditionnelles luciférase stablement transfectées. Smad3 activité transcriptionnelle de cellules implantées dans vivo peut être analysée par le biais de l’imagerie conventionnelle IVIS et suivie direct au cours de la progression tumorale, donnant un aperçu unique sur la dynamique de la voie de signalisation TGF-β. Notre protocole décrit un système de livraison de journaliste avantageuse permettant l’imagerie haut débit rapide des voies de signalisation de cellules vivantes in vitro et in vivo. Cette méthode peut être étendue à un éventail de tests image basée et présente une approche sensible et reproductible pour biologie fondamentale et développement thérapeutique.

Introduction

Facteur de croissance transformant β (TGF-β) est une cytokine essentiel impliqué dans le développement humain qui signale par un hétérodimère complexe composé de type II et récepteurs1de type I. Liaison au récepteur II de type résultats dans le recrutement et la phosphorylation de type I du récepteur, qui phosphoryle à son tour en aval Smad2/3 protéines2,3. Ces activé Smad2/3 protéines lié à Smad4, formant un complexe translocation dans le noyau, qui régule la transcription de gène4. Dans des conditions homéostatiques TGF-β/Smad signalisation est étroitement contrôlée ; Toutefois, dans de nombreuses maladies, la voie de signalisation est déréglementée et souvent surexprimé conduisant à la progression de la maladie5,6,7. Des études récentes ont démontré que la réponse cellulaire au TGF-β est hétérogène et sous-populations de cellules actives de TGF-β/Smad sont responsables de la fonction biologique dans une fonction du temps8,9. Commune analyse cellulaire de la signalisation TGF-β/Smad implique l’utilisation de tests de point de terminaison fixe qui fournissent seulement un instantané de l’activité cellulaire et souvent de doser la moyenne TGF-β/Smad effet10. Cependant, ces méthodes, ne représentent pas exactement les comportements moléculaires du TGF-β/Smad signalisation dans l’état physiologique au cours de la progression de la maladie. Analyse de cellules vivantes sur image capture la dynamique des processus biologiques et cellulaires, avec une compréhension à la fois spatiale et temporelle.

Notre objectif était de développer une méthode sensible de haut débit pour l’imagerie de cellules vivantes du TGF-β/Smad de signalisation à l’aide de réactifs à base d’adénovirus. Ici, nous avons infecté la lignée de cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 avec un adénovirus qui exprime l’ordre de liaison Smad3 CAGA motif et une luciférase (Luc) ou le gène rapporteur Td-tomate (Td-Tom). Systèmes de journaliste adénoviraux fournissent une méthode rapide et bon marchée pour l’introduction de plasmide qui peut entraîner un taux de 100 % d’infection en lignées de cellules cancéreuses. Systèmes viraux journaliste ont également été appliquées avec succès aux lignées de cellules qui sont difficiles à transfecter avec plasmide classique11. Dans ce protocole, nous allons décrire un processus reproductible et non invasif pour parvenir à l’imagerie de cellules vivantes de la voie de signalisation de TGFβ/Smad fois in vivo et in vitro.

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Protocol

Toutes les expériences animales ont été approuvés par l’Université de Melbourne Animal Ethics Committee.

Remarque : Le protocole de séquence, de construction et de production pour l’adénovirus vecteurs pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP et pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom ont été décrites précédemment11,12, 13. Tous les vecteurs sont disponibles dans le commerce.

1. virus titre détermination à l’aide de 50 % la Dose infectieuse culture tissulaire (TCID50)

  1. Préparer 1 x 106 cellules HEK293A dans 10 mL de DMEM + 10 % FBS media.
  2. Les semences 100 µL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture de cellules de 96 puits à fond plat.
  3. Préparer 1 mL d’une dilution au 1/100 des stocks de virus au milieu complet. Ajouter 11 µL de virus dilué dans chaque puits de la colonne 1.
  4. Effectuer des dilutions successives 10 fois directement dans la plaque 96 puits en mélangeant 11 µL du virus dilué à 100 µL de suspension cellulaire jusqu'à une dilution finale de 1 x1012 est atteinte. Bien que les cellules sont non adhérents à ce stade, le nombre de cellules transférés entre puits reste constant.
  5. Distribuer 11 µL de chaque dilution dans chaque colonne commençant par la plus forte dilution de 104. Remplacer les pointes de pipette avec chaque dilution pour limiter reglable de particules virales.
  6. Ajouter 11 µL des médias sans virus complet dans la colonne 12 comme témoin négatif.
  7. Incuber les plaques pendant 7 à 10 jours à 37 ° C, avec 10 % de CO2.
  8. À l’aide d’un microscope, marquer le nombre de puits dans chaque colonne présentant des signes d’effets cytopathogènes ou cytotoxiques. Considérer un bien positif si aucun signe d’infection est présente.
  9. Calculer la fraction de puits positifs pour chaque dilution à l’aide de la méthode statistique (1938) de Reed et Muench14.
  10. Calculer la distance proportionnelle (DP) à l’aide : (A-50)/(A-B), où A est la réponse de pourcentage supérieur ou égale à 50 % et B est la réponse de pourcentage inférieure à 50 %.
  11. Calculate TCID50 using: 10X-PD, where X is the dilution giving a response greater than 50%.
  12. Calculer le titre viral en faisant ce qui suit : 0,69 / (0,011 x TCID50) UFP/mL

2. adénovirus MOI détermination

  1. Semences 1,0-1,5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 500 μl de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 12 plaque bien (confluence de la cellule de 35 %, 6 puits au total).
  2. Calculer les volumes de stock Ad-CMV-Td-Tom requis pour 0, 250, 500, 2500 et 5000 MOI en utilisant la suite formule : MOI = (volume [μL] x PFU/μL) / nombre de cellules. Pour Ad-CMV-Td-Tom avec un titre de 1 x 1010 (UFP/mL), les volumes de viroses MOIs requis sont respectivement de 0, 3.75, 7.5, 37,5 et 75 μL.
  3. Infectent les cellules avec les volumes calculés de Ad-CMV-Td-Tom à la Section 2.2 de pipetage directement stock virale dans les puits avec mélange intime.
  4. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  5. Retirez le support des puits et fixer immédiatement les cellules avec 500 μL de formol 10 % pendant 5 min.
  6. Aspirer le formol des puits et laver une fois les puits avec 500 μl de PBS.
  7. Détachant le noyau de la cellule avec 500 μl de solution de Hoechst pendant 5 min.
  8. Enlever la solution de Hoechst et laver les puits avec 500 μl de PBS 3 fois.
  9. Image la protéine Td-tomate et noyau cellulaire signal en utilisant un grossissement de 200 X sur un microscope à fluorescence. Exciter la protéine Td-tomate à 554 nm et la teinture de Hoechst à 352 nm.
  10. Analyser les images à l’aide de ImageJ pour déterminer le travail que moi requis pour 100 % d’infection de Td-tomate15.

3. double-adénovirus Transduction dans des cellules vivantes unique

  1. Semences 1,0-1,5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 500 μl de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 12 plaque bien (confluence de la cellule de 35 %, 2 puits au total).
  2. Infecter les cellules avec 75 μl de Ad-CMV-GFP (titre = 5 x 109 UFP/mL) et 7,5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (titre = 5 x 1010 UFP/mL) afin d’obtenir un MOI 2 500, qui peut atteindre 100 % positivité de l’infection.
  3. Traiter les cellules avec ou sans 0,25 μL de TGF-β par puits (10 mg/mL en stock, 5 ng/μL comme la concentration finale) immédiatement après l’infection à adénovirus.
  4. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  5. Image des cellules vivantes présentant microscope à fluorescence contraste de phase. Exciter la GFP à 470 nm et protéine de Td-tomate à 554 nm.
  6. Difficulté des cellules et tacher le noyau de la cellule comme décrit dans les étapes 1,6 - 1,9.
  7. Image la protéine Td-tomate et Hoechst tachent à l’aide d’un microscope à fluorescence. Exciter le colorant Hoechst à 352 nm.
  8. À l’aide de ImageJ, calculer que le pourcentage de GFP et Td-tomate positif cellules15.

4. vivre seule cellule signalisation en cicatrisation Assay

  1. Semences de 4-5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 1 mL de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 6 bien sur plaque (confluence cellulaire de 50 %, 2 puits au total).
  2. Infectent les cellules avec 22,5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500).
  3. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  4. Scratch deux lignes croisées sur la couche de cellules de chaque puits à l’aide d’une pointe de pipette P200.
  5. Supprimer les anciens médias de puits et remplacez par 2 mL de frais 5 % médias FBS avec ou sans 0,5 μL de TGF-β par puits (10 mg/mL en stock, 5 ng/μL comme concentration finale).
  6. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 5 min et prendre des photos des zones sélectionnées plaie grossissement 100 X sur un microscope à contraste de phase.
  7. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  8. Prendre des photos de la fermeture de la plaie dans les mêmes secteurs qu’avant.
  9. Fixer les cellules, tacher le noyau de la cellule comme décrit dans les étapes 1,6 - 1,9 et visualiser les signaux Td-tomate dans la région de la plaie et la zone non enroulés en utilisant un grossissement de 200 X sur un microscope à fluorescence.
  10. Quantifier le pourcentage de cellules positives Td-tomate dans la plaie et la zone non-plaie à l’aide de logiciels ImageJ15.

5. in Vitro de luciferase

  1. Préparer une suspension de cellules de 3-5 x 10 cellules MDA-MB-231 du4 dans 1 mL de milieu DMEM contenant du 5 % FBS.
  2. Infecter de suspension cellulaire avec 2,5 μl de Ad-CAGA12- Luc (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500).
  3. Graines les cellules infectées dans un 96 plaque bien à 3 000 cellules/100 µL/puits.
  4. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  5. Supprimez les anciens médias provenant de puits et remplacez-les par 100 µL de supports FBS 5 % neufs avec ou sans 0,1 μL de TGF-β par puits (1 mg/mL en stock, 1 ng/μL comme la concentration finale) et en présence ou en absence de 0,17 μL d’inhibiteur de TGF-β par puits (7 mg/mL en stock 12 ng/μL comme concentration finale) (une protéine nouvelle de piège ligand de TGF-β, Chen et al., œuvre inédite).
  6. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.
  7. Dégeler le substrat de système de dosage de luciférase et préparer le 1 x cell culture lyse réactif à l’eau bidistillée (DDW).
  8. Retirez le support des 96 puits et lyse puits avec 50 μL 1 x cell culture de tampon de lyse sur glace à l’aide d’un agitateur orbital avec une agitation modérée pendant 30 min.
  9. Transférer 30 μL de lysat de chaque puits dans une plaque opaque luciférase et laissez la plaque à température ambiante.
  10. Sur le logiciel luminomètre, créez un nouveau protocole. Sélectionnez pour 1 injecteur avec les mesures avant et après l’injection. Fixer des mesures avant l’injection à 1 s pour retard dans la mesure et Temps d’intégration. Pour après la mesure de l’injection, réglez le Volume d’Injection à 40 µL avec un retard dans la mesure de 1 s après injection et 5 s Temps d’intégration. Confirmez les paramètres en sélectionnant OK.
  11. Placer le tube d’injecteur dans DDW, puis cliquez sur le bouton 1 injecteur sous les paramètres du premier pour nettoyer le tube injecteur avant utilisation. Ensuite, retirez le tube injecteur de la DDW et le déposer dans l’air, suivi par deux autres nombres premiers d’injecteur 1 afin d’éliminer toute la solution du tube. Placer le tube d’injecteur dans le substrat de Firefly et de nouveau premier deux fois pour préparer le substrat.
  12. Placer la plaque de la luciférase opaque avec les échantillons dans le luminomètre et sélectionnez Options du logiciel. Sélectionnez les puits d’intérêt, puis cliquez sur appliquer. Appuyez sur Start pour mesurer le signal de la luciférase.
  13. Une fois que les mesures sont terminées, retirer et rincer la plaque avec de l’eau. Récupérer n’importe quel substrat restant dans le tube injecteur en plaçant le tube dans l’air et premier injecteur 1 dans tube de substrat de firefly. Placer le tube d’injecteur dans DDW et effectuer deux autres nombres premiers pour nettoyer le tube injecteur de n’importe quel substrat restant.

6. cellule préparation pour Live signalisation imagerie In Vivo

  1. 48 h avant l’implantation de la tumeur, graines 2-3 x 106 MDA-MB-231 cellules dans des fioles de2 175 cm (10 flacons au total). La culture de cellules dans 20 mL de milieu DMEM contenant du 5 % FBS à 37 ° C, 10 % CO2.
  2. 24 h plus tard, ajouter 300 μL de Ad-CAGA12- Luc (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500) dans chaque fiole. Maintenir les cellules en culture pendant un autre 24 h.
  3. Le jour suivant l’implantation, supprimer les anciens médias et laver les cellules adénovirus infecté une fois avec 20 mL de PBS, pH 7,4. Ajouter 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA dans la fiole et agiter le flacon légèrement pour permettre à la trypsine couvrir toute la surface du ballon. Placer la fiole dans l’incubateur à 37 ° C, 10 % CO2 pendant 3 min.
  4. Étancher la trypsine en ajoutant 8 mL de médias DMEM contenant du FBS dans les fioles. Transférer toutes les cellules en suspension dans un flacon de verre doseur.
  5. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et transfert de 4,8 x 107 cellules dans deux tubes à centrifuger 50 ml.
  6. Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min à RT pour enlever la trypsine et remettre en suspension les cellules en 720 mL de supports FBS-DMEM neufs.
  7. Transférer les suspensions de cellules dans un tube stérile 5 mL et ajouter 160 μL Matrigel (suspension à 10 % total matrigel).
  8. Conservez les cellules sur la glace jusqu'à l’implantation.

7. l’Implantation orthotopique

  1. Pèse 12 souris SCID et allouer au hasard des souris en groupes de contrôle et de traitement (6 souris/groupe).
  2. Effectuer l’implantation dans une bio-armoire stérile pour maintenir un environnement stérile. Anesthésier la souris l’isoflurane de 2,5 à 4,5 % avec un débit d’oxygène de 1 L/min. Placer la souris sur une bouillote et déposer une goutte de lubrification onguent sur les deux yeux pour éviter des lésions cornéennes. Difficulté la souris à la bouillote en position couchée, tandis que le maintien d’anesthésie en plaçant le museau dans un cône de nez connecté à l’isoflurane.
  3. Confirmer le succès de l’anesthésie par l’absence de réaction à l’orteil pincée. Réduire l’isoflurane à une dose d’entretien de 1,5 à 2,5 % avec 1 L/min d’oxygène pour le rappel de l’implantation.
  4. Nettoyez la peau de la quatrième d’échappement des deux côtés de la ligne médiane avec le tampon de coton trempé dans de l’éthanol à 80 %.
  5. Trouver les 4 coussinets adipeux mammaireth par palpation et presser la grosse garniture pour exposer davantage les tissus.
  6. La composition de la suspension cellulaire bien de pipetage de haut en bas. Doucement aspirer 50 µL du mélange de cellule dans une seringue à insuline 27G et injecter dans les coussinets adipeux mammaire sur les deux côtés de la souris.
  7. Confirmer une injection réussie par la sensation de gonflement de la garniture. Débloquez les coussinets adipeux doucement et mettez la souris revenir dans la cage.
  8. Laissez les cages sur le coussin chauffant pendant au moins 30 minutes permettre aux souris prendre conscience et puis replacez les cages dans la salle de détention pendant 3 jours.

8. IVIS imagerie

  1. Ouvrez le logiciel Living Image .
  2. Initialiser le système IVIS en cliquant sur le bouton Initialiser IVIS système du panneau de commande. Attendez que le signe de température s’allume en vert.
  3. Sélectionnez le Mode d’imagerie Luminescent sur le panneau de configuration.
  4. Allumez anesthésie isoflurane à la chambre et le système IVIS.
  5. Anesthésier les souris à l’aide de 2,5 à 4,5 % isoflurane avec 1 L/min d’oxygène. Une fois anesthésié, fixé isoflurane à 1,5 à 2,5 % pour l’entretien. Injecter 150 mg/kg de poids corporel de D-luciférine souris par injection intrapéritonéale (i.p.).
  6. Transférer immédiatement la souris dans le système IVIS, placez-les sur la plate-forme d’imagerie à température contrôlée et mettre leur nez dans le cône de nez.
  7. Cliquez sur le bouton de la Séquence d’installation sur le panneau de configuration, puis sélectionnez Moyen Binning.
  8. Mettre en place le temps d’exposition d’imagerie comme suit : 10 s, 20 s, 30 s, 60 s et 120 s. début d’imagerie environ 3 min après l’injection de la luciférine et continuent de l’image jusqu'à ce que le signal commence à baisser (normalement, cela prendra environ 20 min).
  9. Retirer les souris de IVIS tout en conservant l’anesthésie isoflurane grâce à un cône de nez et de traiter les souris avec 50 µL PBS ou 50µl inhibiteur signalisation de TGF-β (50 μg/tumeur) par injection intra-tumeur.
  10. Remettre les souris dans la cage et les laisser sur la bouillote pendant au moins 30 min. Puis placez la cage dans la salle de détention.
  11. Répétez IVIS imagerie procédure comme décrit plus haut le jour qui suit le traitement.

9. analyse des données

  1. Ouvrir les fichiers enregistré dans le logiciel Living Image .
  2. Retrouvez les informations de l’image à l’aide de vue | Informations d’image.
  3. Sélectionnez les photos prises à un moment similaire avec le même temps d’exposition. Charger des photos en tant que groupe.
  4. Décochez la case individuelle dans l' Ajustement d’Image pour normaliser l’intensité.
  5. Sélectionnez le mode Photon pour analyser l’intensité. Quantifier l’intensité du signal en sélectionnant le bouton de la Région d’intérêt (ROI) dans les Outils de ROI.
  6. Faites glisser le cercle ROI pour la région contenant le signal de bioluminescent et cliquez sur le bouton de mesure pour acquérir l’intensité du signal.

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Representative Results

Vivre seule cellule imagerie in vitro

Pour évaluer avec précision l’activation de la signalisation TGF-β/Smad dans des cellules individuelles à l’aide de réactifs d’adénovirus basé, il est important de déterminer d’abord la multiplicité d’Infection (MOI) optimale pour chaque lignée cellulaire. Ministère de l’intérieur optimale est déterminée lorsque 100 % des cellules sont positifs pour l’infection adénovirale sans effets cytopathogènes ou cytotoxiques présents. Pour déterminer cela, nous avons utilisé un journaliste Ad-CMV-Td-Tom constitutivement actif qui a agi comme un marqueur d’infection positive. Le pourcentage de cellules adénovirus infecté a été augmenté d’une manière dépendante de MOI de 0 à 5 000 MOI. À 2 500 MOI, nous avons observé l’expression Td-Tom 100 % dans les cellules MDA-MB-231 (Figure 1 a, 1 b). Intensité/cellule de pixel a également augmenté avec MOI, fournissant une sensibilité accrue et détection de sortie de transcription (Figure 1). Par conséquent, un travail MOI de 2 500 a été utilisé pour effectuer une double infection où les cellules ont été infectées avec Ad-CMV-GFP (servi de témoin positif pour l’infection de cellules) et Ad-CAGA12-Td-Tom simultanément. Monocellules présentent différents niveaux d’expression de Td-Tom indiquant hétérogène d’activation de la transcription du TGF-β/Smad3 dans l’ensemble de cellules en cellules direct et fixes. (Figure 2 a, 2 b). 100 % des cellules MDA-MB-231, présentés avec l’expression de la GFP, tandis que seulement environ 26 % des cellules affichées détectable activité transcriptionnelle de TGF-β/Smad3 24h après stimulation du TGF-β, par rapport à 0 % de positivité sans traitement de TGF-β (Figure 2). Pour utiliser le réactif adénovirus basé à enquêter sur l’activité transcriptionnelle de TGF-β/Smad3 au cours de processus biologiques, cellules MDA-MB-231 ont été infectés par Ad-CAGA12-Td-Tom à 2500 MOI et soumis à un test de cicatrisation. Les cellules MDA-MB-231 infectées exposé comportement de migration normales et les cellules traitées avec 5 ng/mL TGF-β a montré la fermeture de la plaie améliorée par rapport aux cellules traitées non-TGF-β (Figure 3 a). Notamment, environ 62 % des cellules dans la région de la plaie présentaient activité transcriptionnelle TGF-β/Smad3 positive, qui est significativement plus élevée que celle observée en zone non-plaie (32 %) après le traitement de TGF-β (Figure3 b). Par conséquent, les réactifs à base d’adénovirus validé leur demande d’imagerie de la voie de signalisation TGF-β dans vivre seule cellule in vitro.

Vivre le TGF-β, signalisation d’imagerie in vivo

La sensibilité du reporter Ad-CAGA12- Luc était première testée in vitro en réponse à la stimulation de TGF-β et la présence d’un inhibiteur de TGF-β. Lorsque les cellules MDA-MB-231 infectées ont été stimulées avec 1 ng/mL TGF-β, activité de la luciférase journaliste a augmenté 1,200-fold par rapport aux taux de MDA-MB-231 base non traitée. Cette réponse a été remarquablement bloquée par 12 µg/mL d’inhibiteur de TGF-β (Figure 4 a). La Ad-CAGA12- Luc réactif a été testé par la suite dans un modèle animal du sein tumeur orthotopique implantation. L’inhibiteur de TGF-β et témoins traitement groupes démontrée luciferase reporter une activité similaire avant le traitement. Toutefois, pour le groupe témoin, le signal de la luciférase ne change pas après le traitement de PBS, tandis que, des souris traitées avec l’inhibiteur de TGF-β a montré la réduction du signal environ 3 fois (Figure 4 b, 4C). Collectivement, ces résultats démontrent le potentiel pour un contrôle direct et en temps réel du TGF-β signalisation activité in vivo sans besoin de sacrifices d’animaux.

Figure 1
Figure 1. Détermination du ministère de l’intérieur du réactif à base d’adénovirus. Les cellules MDA-MB-231 ont été infectés par Ad-CMV-Td-Tom à MOI différent et ensemencées dans une assiette de 12 puits. 24 heures après l’infection, les cellules ont été fixées et colorées nucléaire par Hoechst. (A) des Images ont été prises pour visualiser les cellules positives Td-Tom (rouges) et le noyau (en bleu) et quantifiés par ImageJ. (B) les cellules positives pourcentage de Td-Tom. (C) pixel Td-Tom intensité/cellule normalisée à fond. Ces chiffres sont représentatifs d’au moins 3 expériences indépendantes. Données présentées sont des moyens de réanalysés ± SD. échelle bar = 50 µm (200 X). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Imagerie de la cellule unique pour double infection. Les cellules MDA-MB-231 ont été doubles infectés par le CMV-Ad-GFP et Ad-CAGA12-Td-Tom à MOI (2 500) et de graines dans une assiette de 12 puits. 24 h après l’infection, les cellules ont été traitées avec ou sans 5 ng/mL TGF-β. (A) 24 h après le traitement, les cellules étaient vivants imagés pour visualiser GFP positif (vert) et des cellules positives (en rouge) Td-Tom. Cellules étaient alors fixées et colorées nucléaire par Hoechst pour la quantification. (B) Images ont été prises afin de visualiser la GFP positif (vert), des cellules positives (en rouge) Td-Tom et le noyau (bleu). (C) The GFP ou Td-Tom cellules positives ont été quantifiés par ImageJ et le pourcentage de cellules a été calculé. Ces chiffres sont représentatifs d’au moins 3 expériences indépendantes. Données présentées sont des moyens de réanalysés ± SD. Statistical signification a été déterminée par test t de Student (*** p ≤0.0001). Echelle = 50 µm (200 X). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Signalisation de cellules vivantes TGF-β favorise la migration cellulaire. Les cellules MDA-MB-231 ont été infectés par Ad-CAGA12-Td-Tom à MOI (2 500) et ensemencées sur une plaque de 6 puits. 24 heures après l’infection, les cellules ont été rayés à l’aide d’une pointe de pipette P200 pour créer une blessure et médias remplacé avec ou sans 5 ng/mL TGF-β. Après un autre 24 h, les cellules ont été fixées et colorées nucléaire par Hoechst pour représentation visuelle. (A) Phase contraste de fermeture de la plaie, échelle bar = 100 µm (100 X). (B) des cellules positives (en rouge) Td-Tom et le noyau (en bleu). Echelle = 50 µm (200 X) des cellules positives (C) Td-Tom ont été quantifiés par ImageJ et le pourcentage de cellules a été calculé. Ces chiffres sont représentatifs d’au moins 3 expériences indépendantes. Données présentées sont des moyens de réanalysés ± SD. Statistical signification a été déterminée par test t de Student (*** p ≤0.0001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
La figure 4. In vivo live imagerie signalisation TGF-β. (A) les cellules MDA-MB-231 ont été infectées par Ad-CAGA12- Luc et puis ensemencées en plaques 96 puits pendant 24 h. Par la suite, les cellules ont été traitées avec ou sans 1 ng/mL TGF-β en présence ou en absence d’inhibiteur de TGF-β 12 µg/mL pendant la nuit. L’activité de la luciférase a été mesurée selon le lysat de cellules entières. Activités de la luciférase étaient présentées comme le pli de l’induction normalisé à aucun contrôle de traitement. Données présentées sont des moyens de réanalysés étaient infectés par les cellules MDA-MB-231 SD. (B) ± Ad-CAGA12- Luc 24h avant l’implantation. Les cellules ont été implantés dans les coussinets adipeux mammaire des deux côtés de souris SCID. 72 h plus tard, IVIS d’imagerie a été réalisée avant et après traitement de 24h (PBS pour le groupe témoin) et inhibiteur de TGF-β 50 µg/tumeur pour groupe de traitement. (C) Photon flux a été quantifié par logiciel Living Image. Données présentées sont des moyens de chaque groupe de traitement (n = 12) ± SD. Statistical signification a été déterminée par le test t de Student (** p ≤0.01, *** p ≤0.0001). p/s se réfère à photons/s. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous avons développé une technique permettant l’imagerie en temps réel de la signalisation TGF-β/Smad3 dans des cellules vivantes unique. En utilisant cette nouvelle méthode, nous avons déjà identifié une sous-population de cellules avec la dynamique activité transcriptionnelle de TGF-β/Smad3 associée à l’invasion améliorée et migration8. Cette méthode améliore sur les dosages traditionnels pour la signalisation TGF-β, tels que les transferts de western de la phosphorylation Smad3 et TGF-β a ciblé l’expression des gènes, en capturant l’hétérogénéité du TGF-β/Smad3 signalisation au sein de la population de la tumeur et mettant en évidence la importance de la biologie cellulaire unique. En outre, les méthodes alternatives de cellule unique d’imagerie telles que la translocation nucléaire peut être fastidieuse et coûteuse si effectuée en vivent cellules et ne peuvent pas toujours traduire au gène transcription16,17. Bien que ces méthodes soient importants d’examiner les voies en amont de la transduction du signal, le système de journaliste adénovirus offre une perspective unique de signalisation TGF-β/Smad3 dans des cellules individuelles en ce qui concerne la fonction biologique.

Significativement, notre méthode fournit une méthode sensible et reproductible pour la détection in vivo de la voie de signalisation TGF-β/Smad3 dans en temps réel au cours de la progression tumorale et de traitement. Similaire à traditionnel luciférase stable en vivo imaging, détection du TGF-β/Smad3 signalisation au sein de la souris dépend le nombre de cellules et le niveau d' activité de promoteur18. Tandis que le tissu sous-cutané fournit peu d’interférence pour l’analyse, une profondeur accrue des cellules permettra de réduire la sensibilité de détection de signal. Il est possible d’étendre la méthode à utiliser dans d’autres organes, tels que les poumons et OS et d’autres cancers ; Cependant, optimisation du signal ou ex vivo imagerie est recommandé pour atteindre la sensibilité requise pour le modèle de cancer d’intérêt.

Un autre avantage d’utiliser le système de reporter des adénovirus est que son application est susceptible d’augmenter à l’analyse des multiples voies de signalisation simultanément dans des cellules vivantes. L' Figure 2 a, nous avons démontré que les cellules MDA-MB-231 pourraient être transduites avec 2 vecteurs adénovirus distinct, CMV-GFP et CAGA-TOM. Ce système de double infection peut être étoffé pour signaler deux différentes voies de signalisation par fluorescence journaliste protéines et reporters de luciférase (à l’aide de protéines de rapporteur luciférase Firefly et Guassia). Notre laboratoire a atteint simultanée de signalisation des voies de signalisation BMP/Smad1 et TGF-β/Smad3 dans un certain nombre de lignées cellulaires de cancer direct (données non présentées).

Adénovirus journaliste systèmes fournissent une méthode simple et pratique pour l’imagerie de cellules vivantes de la voie de signalisation TGF-β/Smad les deux in vitro et in vivo. Ce système a des avantages distincts sur les autres systèmes de journaliste couramment utilisés. Tout d’abord, les vecteurs adénovirus sont censés présenter parmi l’efficacité de la transduction virale plus élevée, rendant un système optimal pour les lignées de cellules qui sont difficiles à transduce19,20,21,22. En outre avec les progrès actuels en technologies virales, vecteurs adénovirus « lâche » peuvent être générés en enlevant la majeure partie du génome viral permettant une augmentation de capacité ADN exogène23. En comparaison de vecteurs non viraux, vecteurs adénovirus représentent une application rentable, rapide et facile pour la transduction cellulaire qui se traduit par une bien plus grande livraison efficacité19,20,21 ,,22.

Ce protocole utilise un système d’expression adénovirus de deuxième génération, qui est la réplique-incompétents dans les cellules de mammifères qui n’expriment pas les protéines E1a et E1b, minimisant la biosécurité risque24. Cependant, malgré ces biosécurité fonctionnalités, adénovirus particules peuvent encore améliorées transduce des cellules humaines primaires avec l’efficacité élevée25,26. US Biosafety Level 2 et le confinement des vecteurs adénoviraux est recommandé lorsque la manipulation et l’élimination des adénovirus vos équipements contaminés. Amplification à grande échelle d’adénovirus dans les cellules de HEK293A peut entraîner une génération rare d’adénovirus aptes à la réplication de « type sauvage »27. Criblage d’ACP devrait être effectuée pour déterminer la contamination sauvage27.

Vecteurs adénovirus réplique-incompétents sont transitoires dans expression et ne s’intègrent pas avec hôte ADN20,21. Il est recommandé que l’expérimentateur identifient la stabilité dans l’expression de leur protéine journaliste lorsque vous utilisez le système de journaliste d’adénovirus pour confirmer la validité des expériences à long terme. Le temps d’expression du vecteur adénovirus dans une cellule est proportionnel à l’époque de la division de la cellule et MOI virale. Afin d’assurer des résultats reproductibles, il est essentiel que le titre viral est déterminé avec précision pour chaque lot virale. En outre, des volumes trop élevés de l’adénovirus peuvent avoir des effets cytotoxiques ou cytopathiques et il est important qu’un MOI optimal est empiriquement déterminé pour chaque cellule bordée utilisé pour obtenir des résultats optimaux. En outre, in vivo l’utilisation de vecteurs adénovirus peut induire des réponses immunitaires ; où le système immunitaire n’est pas la principale observation de l’expérience, les animaux immunodéprimés est recommandés20,21. Contrôle de qualité supplémentaire est requis pour utiliser les vecteurs adénovirus pour cible des réponses immunitaires, bien que l’utilisation de l’adénovirus a été validée comme un adjuvant au vaccin thérapies28,29.

Le système de journaliste adénovirus peut être utilisé sur une large gamme de lignées cellulaires primaires et cultivées de diviser et non de division de la nature20,22. Grâce au système de journaliste d’adénovirus, nous avons obtenu 100 % taux d’infection dans un certain nombre de lignées de cellules cancéreuses, y compris le cerveau, du sein, colorectal comme cellules de fibroblaste embryonnaire de souris primaire (MEF) et épithéliale de rein canin (MDCK) bien. En outre, vecteurs viraux peuvent être modifiées ultérieurement afin d’augmenter l’affinité pour les récepteurs spécifiques de type cellulaire, prévoyant la transduction30,31, orgue amélioré le ciblage et l’efficacité.

Les applications de cette méthode peuvent être étendues à d’autres voies de signalisation et les cellules hôtes. Les principaux avantages du système adénoviraux journaliste comprennent la transduction bon marché et de haute efficacité, la rapide montage expérimental et la manque d’intégration avec hôte ADN21,32. Cette méthode peut être appliquée à de nombreux tests actuellement et modèles in vivo , y compris dans l’évaluation des nouvelles thérapies ciblées33. Nous espérons que l’utilisation de cette technique permettra d’améliorer notre compréhension de la relation entre la signalisation des voies et des processus biologiques conduisant à de nouvelles découvertes biologiques et le développement de nouvelles thérapies.

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Disclosures

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) à H-JZ. TMBW est récipiendaire de la bourse postdoctorale Australie le gouvernement australien et la bourse de recharge Ann Henderson de Australian Health Rotary en partenaire avec le Rotary de Templestowe et Dine d’un remède.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

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References

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