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Cancer Research

Proyección de imagen de células del TGF-β/Smad3 señalización vía In Vitro y In Vivo utilizando un Adenovirus reportero sistema en vivo

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes de células vivas de la actividad de señalización de TGF-β/Smad3 utilizando un adenovirus reportero sistema. Este sistema rastrea actividad transcripcional en tiempo real y puede ser aplicado a ambas células en vitro y en animales vivosmodelos.

Abstract

Transformación de Factor de crecimiento β (TGF-β) señalización regula muchas funciones importantes para la homeostasis celular y se encuentra comúnmente sobre expresa en muchas enfermedades, incluyendo cáncer. TGF-β está implicado fuertemente en metástasis durante la progresión del cáncer de etapa tardía, activando un subconjunto de las células del tumor invasivo y migratorias. Los métodos actuales de análisis de la vía de señalización se centran en modelos de punto final, que a menudo tratan de medir señales post-hoc del evento biológico y no reflejan la naturaleza progresiva de la enfermedad. Aquí, demostramos un adenovirus novela reportero sistema específico para la vía de señalización de TGF-β/Smad3 que puede detectar la activación transcripcional en células vivas. Utilizando un reportero Ad-CAGA12-Td-Tom , podemos lograr una tasa de infección del 100% de las células MDA-MB-231 dentro de 24 h in vitro. El uso de un reportero fluorescente permite la proyección de imagen de células vivas en tiempo real con identificación directa de las células transcripcionalmente activas. Estimulación de las células infectadas con TGF-β muestra sólo un subconjunto de las células que son transcripcionalmente activas y participan en funciones biológicas específicas. Este enfoque permite alta especificidad y sensibilidad a un nivel unicelular para mejorar la comprensión de las funciones biológicas relacionadas con TGF-β señalización en vitro. Smad3 actividad transcripcional puede ser también registrados en vivo en tiempo real a través de la aplicación de un Ad-CAGA12- Luc reportero. Ad-CAGA12- Luc puede medirse de la misma manera que las líneas celulares de luciferase estable transfected tradicional. Smad3 actividad transcripcional de las células implantadas en vivo se puede analizar a través de la proyección de imagen convencional de IVIS y seguimiento directo durante la progresión del tumor, proporcionando una visión única en la dinámica de la vía de señalización de TGF-β. Nuestro protocolo describe un sistema reportero ventajosa que permite proyección de imagen de alto rendimiento rápido de vías de señalización de células vivas in vitro e in vivo. Este método puede ser ampliado a una gama de análisis de imagen basado y presenta como un enfoque sensible y reproducible para la biología básica y desarrollo terapéutico.

Introduction

Factor de crecimiento de transformación β (TGF-β) es una citoquina fundamental implicado en el desarrollo humano que las señales a través de un complejo de tipo II heterodiméricos y tipo de receptores1. Unión a receptor II tipo resultados en el reclutamiento y la fosforilación del tipo I del receptor, que a su vez fosforila Smad2/3 aguas abajo proteínas de2,3. Estos activan bind Smad2/3 de proteínas a Smad4, formando un complejo que se transloca en el núcleo y regula la transcripción de gen4. Condiciones homeostáticas de TGF-β/Smad signaling es estrictamente regulado; sin embargo, en muchas enfermedades, la vía de señalización está desregulada y sobreexpresa con frecuencia conducen a la progresión de la enfermedad5,6,7. Estudios recientes han demostrado que la respuesta celular a TGF-β es heterogénea y subpoblaciones de células activadas TGF-β/Smad son responsables de la función biológica en una forma dependiente del tiempo8,9. Análisis celular común de señalización de TGF-β/Smad implica el uso de ensayos de punto final fijo que ofrecen sólo una instantánea de la actividad celular y con frecuencia cuantificar el promedio de efecto de TGF-β/Smad10. Estos métodos, sin embargo, pueden no exactamente representan el comportamiento molecular de señalización de TGF-β/Smad en el estado fisiológico durante la progresión de la enfermedad. Análisis basado en imágenes de células vivas capturar la dinámica de procesos celulares y biológicos con una comprensión espacial y temporal.

Nuestro objetivo fue desarrollar un método sensible de alto rendimiento para obtener imágenes de células vivas de TGF-β/Smad signaling reactivos basados en adenovirus. Aquí, estamos infectados por la línea de celular del cáncer de mama MDA-MB-231 con un adenovirus que expresan la secuencia de enlace de adorno de CAGA de Smad3 y luciferasa (Luc) o gen reportero de Td-tomate (Td-Tom). Adenoviral reportero sistemas proporcionan un método rápido y barato para la introducción de plásmidos que puede resultar en una tasa de infección del 100% en líneas celulares de cáncer. Sistemas de adenoviral reportero también se han aplicado con éxito a líneas celulares difíciles de transfectar con plásmido convencional11. En este protocolo se describe un proceso reproducible y no invasivo para obtener células vivas imágenes de la vía de señalización TGFβ/Smad tanto en vivo como en vitro.

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Protocol

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Universidad de Melbourne Comité de ética Animal.

Nota: El protocolo de secuencia, la construcción y la generación para el adenoviral vectores pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP y pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom se han descrito previamente11,12, 13. Los vectores están disponibles en el mercado.

1. virus título determinación utilizando dosis infectiva de cultivo de tejidos 50% (TCID50)

  1. Preparar 1 x 106 células de HEK293A en 10 mL de DMEM + 10% FBS media.
  2. Semilla 100 μl de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pozos de fondo plano.
  3. Preparar 1 mL de una dilución 1: 100 de stock de virus en el medio completo. Añadir 11 μl de virus diluido en cada pocillo de la columna 1.
  4. Realizar diluciones seriadas 10 veces directamente en la placa de la pozo 96 mezclando 11 μl de virus diluido con 100 μl de suspensión celular hasta la dilución final de 1 x10 se llega a12 . Aunque las células son no adherente en este momento, el número de células entre pozos permanece constante.
  5. Pipeta de 11 μl de cada dilución en cada columna a partir de la dilución más alta de 104. Vuelva a colocar las puntas de pipeta con cada dilución para limitar el cruce de partículas virales.
  6. Añadir 11 μl de medios libre de virus completo a la columna 12 como control negativo.
  7. Incubar la placa durante 7-10 días a 37 ° C con 10% CO2.
  8. Utilizando un microscopio, anotar el número de pozos en cada columna mostrando signos de efectos citopáticos o citotóxicos. Considerar un bien positivo si hay cualquier signo de infección.
  9. Calcular la fracción de pozos positivos de cada dilución con la Reed y Muench (1938) método estadístico14.
  10. Calcular la distancia proporcional (DP) utilizando: (A-50)/(A-B), donde A es la respuesta de porcentaje superior o igual al 50% y B es la respuesta de porcentaje por debajo del 50%.
  11. Calcular TCID50 uso: 10X-PD, donde X es la dilución dando una respuesta superior al 50%.
  12. Calcular el título viral de siguiente: 0,69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. adenovirus MOI determinación

  1. Semillas 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 células con 500 μL de DMEM medios de cultivo que contiene 5% FBS en cada pozo de 12 bien la placa (confluencia celular 35%, 6 pozos en total).
  2. Calcular los volúmenes de stock Ad-CMV-Td-Tom para 0, 250, 500, 2500 y 5000 MOI utilizando las siguientes fórmula: MOI = (volumen [μL] x PFU/μL) / número de células. Ad-CMV-Td-Tom con un título de 1 x 1010 (PFU/mL), los volúmenes de la infección del virus requiere MOIs son 0, 3.75, 7.5, 37.5 y 75 μL respectivamente.
  3. Infectar las células con los volúmenes calculados de Ad-CMV-Td-Tom en la sección 2.2 transfiriendo directamente acciones virales en los pozos con mezcla completa.
  4. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  5. Quitar los medios de comunicación de los pozos y reparar inmediatamente las células con 500 μL de formalina al 10% durante 5 minutos.
  6. La formalina de los pozos de aspirar y lavar los pocillos con 500 μL de PBS una vez.
  7. Tiñen el núcleo de la célula con 500 μL de solución de Hoechst durante 5 minutos.
  8. Retirar la solución de Hoechst y lavar los pocillos con 500 μL de PBS 3 veces.
  9. Imagen la proteína Td-tomate y núcleo de la célula la señal de 200 aumentos en un microscopio de fluorescencia. Excitar la proteína Td-tomate a 554 nm y el tinte de Hoechst en 352 nm.
  10. Análisis de imágenes mediante ImageJ para determinar el funcionamiento que Moi necesario para 100% de infección de tomate Td15.

3. dual-adenovirus transducción en células vivas individuales

  1. Semillas 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 células con 500 μL de DMEM medios de cultivo que contiene 5% FBS en cada pozo de 12 bien la placa (confluencia celular 35%, 2 pozos en total).
  2. Infectar células con 75 μL de Ad-CMV-GFP (título = 5 x 109 PFU/mL) y 7.5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (título = 5 x 1010 PFU/mL) para obtener un MOI 2.500, que puede alcanzar el 100% de positividad de la infección.
  3. Tratar las células con o sin 0,25 μL de TGF-β por pozo (10 mg/mL en la acción, 5 ng/μL como la concentración final) inmediatamente después de la infección del adenovirus.
  4. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  5. Imagen en las células con el microscopio de fluorescencia contraste de fase. Excitar la GFP a 470 nm y proteína Td-tomate a 554 nm.
  6. Fijar las células y mancha el núcleo de las células como se describe en pasos 1.6 - 1.9.
  7. Imagen la proteína Td-tomate y Hoechst manchan usando un microscopio de fluorescencia. Excitar el tinte de Hoechst en 352 nm.
  8. ImageJ, calcular que el porcentaje de positivos GFP y Td-tomate células15.

4. viva sola célula de señalización en la cicatrización de heridas ensayo

  1. Semillas 4-5 x 105 MDA-MB-231 células con 1 mL de DMEM medios de cultivo que contiene 5% FBS en cada pozo de 6 bien la placa (confluencia del 50% de la célula, 2 pozos en total).
  2. Infectar las células con 22,5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (título = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  4. Rayar dos líneas cruzadas en la capa celular de cada pocillo utilizando una pipeta de P200.
  5. Retire los medios viejos pozos y reemplazar con 2 mL de dulce 5% media FBS con o sin 0,5 μL de TGF-β por pozo (10 mg/mL en la acción, 5 ng/μL como concentración final).
  6. Colocar la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 5 minutos y tomar imágenes de zonas seleccionadas de la herida de 100 aumentos en un microscopio de contraste de fase.
  7. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  8. Tomar imágenes de la clausura de herida en las mismas zonas que antes.
  9. Fijar las células, núcleo de la célula de la mancha como se describe en pasos 1.6 - 1.9 y visualizar señal Td-tomate en el área de la herida y el área de la herida no de 200 aumentos en un microscopio de fluorescencia.
  10. Cuantificar el porcentaje de células positivas de Td y tomate en la herida y el área de la herida no utilizar ImageJ software15.

5. in Vitro ensayo de luciferasa

  1. Preparar una suspensión de 3-5 x 104 MDA-MB-231 células en 1 mL de medio DMEM que contenía 5% FBS.
  2. Infectar la suspensión celular con 2,5 μL de Ad-CAGA12- Luc (título = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Semilla de las células infectadas en un 96 placa bien a 3.000 células/100 μL/pocillo.
  4. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  5. Eliminar medios viejos pozos y reemplazar con 100 μl de fresco 5% SFB los medios de comunicación con o sin 0.1 μL de TGF-β por pozo (1 mg/mL en la acción, 1 ng/μL como la concentración final) y en la presencia o ausencia de 0.17 μL de inhibidor del TGF-β por pozo (7 mg/mL en stock 12 ng/μL como concentración final) (obra inédita una novela proteína TGF-β ligando trampa, Chen et al.,).
  6. Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C con 10% de CO2 durante 24 h.
  7. Descongele el sustrato de sistema de ensayo de luciferasa y preparar 1 x celular cultura reactivo de lisis en agua bidestilada (DDW).
  8. Quitar los medios de comunicación de 96 pocillos y lyse pozos con 50 μL de 1 x celular cultura tampón de lisis en hielo con agitación suave durante 30 min con un agitador orbital.
  9. Transferencia 30 μL de lisado de cada bien en una placa opaca luciferase y permiten que la placa a temperatura ambiente.
  10. En el software del luminómetro, crear un nuevo protocolo. Seleccione para 1 inyector con mediciones antes y después de la inyección. Ajustar las mediciones antes de la inyección en 1 s por retraso en la medición y Tiempo de integración. Para después de la medición de inyección, ajuste el Volumen de inyección 40 μl con un retraso en la medición de 1 s después de la inyección y 5 s Tiempo de integración. Confirmar la configuración seleccionando OK.
  11. Coloque el tubo de inyector en DDW y haga clic en el botón inyector 1 bajo la configuración de primer para limpiar el tubo del inyector antes de su uso. Luego retire el tubo del inyector del DDW y lugar seguido de otros dos primos del inyector 1 para eliminar toda la solución del tubo de aire. Coloque el tubo de inyector en sustrato de Firefly y otra vez primer dos veces para preparar el sustrato.
  12. Coloque la placa de luciferase opaco con las muestras en el luminómetro y seleccione Opciones en el software. Destacar los pozos de interés y haga clic en aplicar. Presione Inicio para medir señal de luciferasa.
  13. Una vez medidas, quitar y lavar la placa con agua. Recuperar cualquier substrato restante en el tubo del inyector colocando el tubo en el aire y el primer inyector 1 en tubo del substrato de firefly. Coloque el tubo de inyector en DDW y realizar otros dos primos para limpiar el tubo inyector de cualquier sustrato restante.

6. célula preparación para vivo señalización de proyección de imagen In Vivo

  1. 48 h antes de la implantación del tumor, de la semilla 2-3 x 106 MDA-MB-231 células en frascos de 175 cm2 (10 frascos en total). Cultivo de células en 20 mL de medio DMEM que contenía 5% SBF a 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 h más tarde, añadir 300 μL de Ad-CAGA12- Luc (título = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) en cada matraz. Mantener las células en cultura por otro 24 h.
  3. En el día de implantación, quitar los viejos medios de comunicación y lavar las células adenovirus infectadas una vez con 20 mL de PBS, pH 7,4. Añadir 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA en el matraz y agite el matraz ligeramente para permitir que la tripsina cubrir toda la superficie del frasco. Coloque el matraz en a la incubadora de 37 ° C, 10% CO2 durante 3 minutos.
  4. Saciar la tripsina por adición de 8 mL de medio DMEM que contiene FBS en frascos. Transferencia de suspensiones celulares todo en un frasco de reactivo.
  5. Contar el número de celular utilizando un hemocitómetro y transferencia de 4.8 x 107 células en dos tubos de centrífuga de 50 ml.
  6. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar tripsina y resuspender las células en 720 mL de medio de FBS-DMEM fresco.
  7. Transfiera las suspensiones de células en un tubo estéril 5 mL y añadir 160 μL Matrigel (matrigel total 10% suspensión).
  8. Mantener las células en hielo hasta la implantación.

7. ortotópico implantación

  1. Pesan 12 ratones de SCID y asignar al azar ratones en grupos control y tratamiento (6 ratones/grupo).
  2. Realizar la implantación en un gabinete de bio estéril para mantener un ambiente estéril. Anestesiar el ratón utilizando isoflurano 2.5-4.5% con una tasa de flujo de oxígeno de 1 L/min Coloque el ratón sobre una almohadilla de calor y colocar una gota de lubricante pomada ocular en ambos ojos para evitar el daño de la córnea. Fijar el ratón a la almohadilla de calor en una posición supina mientras mantener anestesia colocando el hocico en un cono de nariz conectado para el isoflurano.
  3. Confirman el éxito de la anestesia por la falta de reacción a los pies, pizca. Reducir el isoflurano a una dosis de mantenimiento de 1.5-2.5% de oxígeno de 1 L/min para el recordatorio de la implantación.
  4. Utilizando la torunda de algodón sumergida en etanol al 80% para limpiar la piel del pezón cuarto en ambos lados de la línea media.
  5. Encontrar la 4 almohadilla grasa mamariath a través de la palpación y apriete la almohadilla de grasa para exponer más el tejido.
  6. Mezclar la suspensión de células bien transfiriendo hacia arriba y hacia abajo. Suavemente Aspire 50 μl de mezcla de célula en una jeringa de insulina 27G e inyectar en la almohadilla de grasa mamaria en ambos lados del ratón.
  7. Para confirmar una inyección acertada sensación de inflamación de la almohadilla de grasa. Suelte suavemente la almohadilla de grasa y coloque el ratón en la jaula.
  8. Salir de las jaulas sobre la almohadilla de calor durante al menos 30 minutos permitir que los ratones ganar conciencia y luego volver a colocar las jaulas en la sala de celebración durante 3 días.

8. proyección de imagen de IVIS

  1. Abra el software de Imagen de vida .
  2. Inicializar el sistema IVIS haciendo clic en el botón Inicializar IVIS sistema en el panel de control. Espere hasta que la señal de temperatura se vuelve verde.
  3. Seleccione el modo de proyección de imagen de luminiscente en el panel de control.
  4. Encienda la anestesia isoflurano a la cámara y sistema IVIS.
  5. Anestesiar los ratones mediante el uso de 2.5-4.5% isoflurano con oxígeno de 1 L/min. Una vez anestesiado, establecer isoflurane 1.5-2.5% para el mantenimiento. Inyecte 150 mg/kg de peso corporal de D-luciferin en ratones por inyección intraperitoneal (i.p.).
  6. Inmediatamente transferir ratones en el sistema IVIS, colocar en la plataforma de proyección de imagen con control de temperatura y su nariz en el cono de nariz.
  7. Haga clic en el botón Configuración de la secuencia en el panel de control y seleccione Medio Binning.
  8. Establecer el proyección de imagen tiempo de exposición como sigue: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, 120 s. Inicio de aproximadamente 3 minutos después de la inyección de luciferin y continúan hasta que la señal empiece a caer la imagen (normalmente esto le llevará alrededor de 20 minutos).
  9. Retirar los ratones del IVIS isoflurane anestésico a través de un cono de la nariz y tratar a los ratones con 50 μl PBS o inhibidor de la señalización de la TGF-β 50 μl (50 μg/tumor) vía la inyección intra-tumor.
  10. Vuelva a colocar los ratones en la jaula y dejarlos en la almohadilla de calor durante al menos 30 minutos. Luego vuelva a colocar la jaula en la sala de celebración.
  11. Repita IVIS imagen procedimiento como se describe anteriormente el día después del tratamiento.

9. Análisis de datos

  1. Abrir archivos guardado en Imagen de vida software.
  2. Encontrar la información de la imagen usando la vista | Información de la imagen.
  3. Seleccione fotos tomadas en un momento similar con el mismo tiempo de exposición. Cargar fotos como grupo.
  4. Desmarque la casilla Individual de Ajuste de la imagen a normalizar la intensidad.
  5. Seleccione el modo de fotones para analizar la intensidad. Cuantificar la intensidad de la señal seleccionando el botón Región de interés (ROI) en Herramientas de ROI.
  6. Arrastre el círculo de retorno de la inversión a la región que contiene la señal bioluminiscente y haga clic en el botón de la medida para adquirir la intensidad de la señal.

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Representative Results

Vivo sola célula en vitro

Evaluar con precisión la activación de TGF-β/Smad de señalización en las células adenovirus basado en reactivos, es importante primero determinar el óptimo multiplicidad de infección (Ministerio del interior) para cada línea celular. El Ministerio del interior óptima se determina cuando 100% de las células son positivas para infección adenoviral sin efectos citopáticos o citotóxicos presentes. Para determinar esto, se utilizó un reportero Ad-CMV-Td-Tom constitutivamente activo que actuaba como un marcador de infección positiva. El porcentaje de células infectadas por adenovirus se incrementó de una manera dependiente del MOI de 0 a 5.000 MOI. En MOI 2.500, se observó expresión de Tom Td 100% en las células MDA-MB-231 (figura 1A, 1B). Intensidad de pixel/celda también aumentó con MOI, proporcionando sensibilidad mejorada y detección de salida transcripcional (figura 1). Por lo tanto, un trabajo MOI de 2.500 fue utilizado para llevar a cabo una infección dual donde las células fueron infectadas con el CMV-Ad-GFP (sirve como control positivo para la infección de la célula) y Ad-CAGA12-Td-Tom simultáneamente. Las células presentan diferentes niveles de expresión de Td-Tom indicando heterogénea activación de TGF-β/Smad3 transcripción en las células en células vivas y fijadas. (Figura 2A, 2B). 100% de las células MDA-MB-231 presentadas con expresión de GFP mientras que sólo el 26% de las células aparece perceptible actividad transcripcional de TGF-β/Smad3 24 h después del estímulo de TGF-β, en comparación con 0% de positividad sin tratamiento de TGF-β (figura 2). Para utilizar el reactivo de adenovirus basado para investigar la actividad transcripcional de TGF-β/Smad3 durante los procesos biológicos, las células MDA-MB-231 fueron infectadas con Ad-CAGA12-Td-Tom en 2500 MOI y sometidas a un ensayo de cicatrización. Infectadas las células MDA-MB-231 exhibieron comportamiento de migración normal y las células tratadas con TGF-β mostró mayor herida cierre comparado con las células tratadas de TGF-β (Figura 3A) de 5 ng/mL. En particular, alrededor del 62% las células en el área de la herida presentan positiva actividad transcripcional de TGF-β/Smad3, que es significativamente mayor que la observada en el área de la herida no (32%) después del tratamiento de TGF-β (figura3B). Así, los reactivos basados en adenovirus validan su uso para la proyección de imagen de la vía de señalización de TGF-β en vivo sola célula en vitro.

TGF-β imágenes en vivo en vivo

La sensibilidad del reportero Ad-CAGA12- Luc era primer probado en vitro en respuesta a la estimulación de TGF-β y la presencia de un inhibidor del TGF-β. Cuando las células MDA-MB-231 infectadas fueron estimuladas con TGF-β de 1 ng/mL, actividad de reportero de luciferasa aumentó 1,200-fold en comparación con niveles basales de MDA-MB-231 no tratados. Esta respuesta notable fue bloqueada por 12 μg/mL de inhibidor del TGF-β (Figura 4A). El Ad-CAGA12- Luc reactivo fue probado posteriormente en un modelo animal mama tumor ortotópico implantación. Control y el inhibidor del TGF-β trataron grupos demostraron luciferase reporter actividad similar antes del tratamiento. Sin embargo, para el grupo control, la señal de la luciferasa no cambió después del tratamiento de PBS, mientras que ratones trataron con el inhibidor del TGF-β mostró reducción de señal alrededor 3-fold (Figura 4B, 4C). Colectivamente, estos resultados demuestran el potencial para el monitoreo directo y en tiempo real de TGF-β señalización actividad en vivo sin necesidad de sacrificio de animales.

Figure 1
Figura 1. Determinación de MOI de reactivos basados en adenovirus. Las células MDA-MB-231 fueron infectadas con Ad-CMV-Td-Tom en MOI diferentes y sembradas en una placa de 12 pozos. 24 h después de la infección, las células se fijaron y tiñeron nuclear por Hoechst. (A) imágenes tomadas para visualizar las células positivas de Td-Tom (rojo) y el núcleo (azul) y cuantificados mediante ImageJ. (B) las células positivas porcentaje de Td-Tom. (C) Td-Tom pixel intensidad/célula normalizada a fondo. Estas cifras son representativas de al menos 3 experimentos independientes. Datos mostrados son triplicados ± SD. escala de la barra = 50 μm (200 X). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Proyección de imagen de célula para infección dual. Las células MDA-MB-231 eran duales infectado con CMV-Ad-GFP y Ad-CAGA12-Td-Tom en MOI (2.500) y sembradas en una placa de 12 pozos. 24 h después de la infección, las células fueron tratadas con o sin TGF-β de 5 ng/mL. (A) 24 h después del tratamiento, las células fueron energizadas imagen para visualizar GFP positivas (verde) y células (rojo) positivo Td-Tom. Las células entonces se fijaron y nuclear teñido por Hoechst para la cuantificación. (B) imágenes fueron tomadas para visualizar GFP positivas (verde), células (rojo) positivo Td-Tom y el núcleo (azul). Las células positivas (C) la GFP o Td-Tom se cuantificaron mediante ImageJ y se calculó el porcentaje de células positivas. Estas cifras son representativas de al menos 3 experimentos independientes. Datos mostrados son triplicados ± significado estadístico SD. se determinó mediante la prueba t de Student (*** p ≤0.0001). Barra de escala = 50 μm (200 X). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Señalización de TGF-β vivo de la célula promueve la migración celular. Las células MDA-MB-231 fueron infectadas con Ad-CAGA12-Td-Tom en MOI (2.500) y sembradas en una placa de 6 pozos. 24 h después de la infección, las células fueron rayadas utilizando una pipeta de P200 para crear una herida y los medios de comunicación reemplazada con o sin TGF-β de 5 ng/mL. Después otra 24 h, las células se fijaron y nuclear teñido por Hoechst para representación visual. (A) fase de contraste de encierro de la herida, escala de la barra = 100 μm (100 X). (B) células (rojo) positivo Td-Tom y el núcleo (azul). Barra de escala = 50 μm (200 X) células positivas (C) Td-Tom se cuantificaron mediante ImageJ y se calculó el porcentaje de células positivas. Estas cifras son representativas de al menos 3 experimentos independientes. Datos mostrados son triplicados ± significado estadístico SD. se determinó mediante la prueba t de Student (*** p ≤0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. En vivo en vivo imágenes de señalización de TGF-β. (A) las células MDA-MB-231 fueron infectadas con Ad-CAGA12- Luc y luego sembrado en placa de 96 pocillos para 24 h. Después de eso, las células fueron tratadas con o sin 1 ng/mL TGF-β en la presencia o ausencia de inhibidor de TGF-β de 12 μg/mL durante la noche. La actividad luciferasa fue medida basada en el lisado de células enteras. Las actividades de la luciferasa se presentaron como el pliegue de inducción normalizado a ningún control de tratamiento. Datos mostrados son triplicados ± SD (B) MDA-MB-231 las células fueron infectadas con Ad-CAGA12- Luc 24 h antes de la implantación. Las células se implantaron en la almohadilla de grasa mamaria en ambos lados de los ratones de SCID. 72 h después, IVIS la proyección de imagen se realizó antes y después del tratamiento de 24 h (PBS para el grupo de control) y 50 μg, tumor TGF-β inhibidor para el grupo de tratamiento. Fotón (C) flujo se cuantificó por software de imágenes de vida. Datos mostrados son medios de cada grupo de tratamiento (n = 12) ± SD. estadísticos de significación se determinó mediante la prueba t de Student (** p ≤0. 01, *** p ≤0.0001). p/s se refiere a fotones/s. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hemos desarrollado una técnica para permitir la proyección de imagen en tiempo real de señalización de TGF-β/Smad3 en células vivas individuales. Mediante este novedoso método, previamente hemos identificado una subpoblación de células con actividad transcripcional del TGF-β/Smad3 dinámico que se asoció con mayor invasión y migración8. Este método mejora los análisis tradicionales de señalización de TGF-β, como manchas blancas /negras occidentales de fosforilación del Smad3 y TGF-β dirigida de la expresión génica, capturando la heterogeneidad de TGF-β/Smad3 señalización dentro de la población de tumor y destacando la importancia de la biología de la célula. Además, métodos alternos de célula la proyección de imagen tales como translocación nuclear puede ser desperdiciador de tiempo y costoso si se realiza en viven las células y no pueden traducir siempre a gene transcripción16,17. Si bien estos métodos son importantes para examinar las aguas arriba vías de transducción de la señal, el sistema de reportero de adenovirus proporciona una perspectiva única sobre la señalización de TGF-β/Smad3 en celdas individuales en relación con la función biológica.

Significativamente, nuestro método proporciona un método sensible y reproducible para la detección en vivo de la vía de señalización de TGF-β/Smad3 en tiempo real durante la progresión del tumor y tratamiento. Similar al tradicional luciferase estable en vivo la proyección de imagen, detección de señalización de TGF-β/Smad3 en el ratón es dependiente en el número de células y el nivel de promotor actividad18. Tejido subcutáneo proporciona poca interferencia para el análisis, mayor profundidad de las células reduce la sensibilidad de detección de señales. Es posible ampliar el método para su uso en otros órganos, como pulmón, hueso y otros tipos de cáncer; sin embargo, se recomienda lograr la sensibilidad necesaria para el modelo de cáncer de interés optimización de señal o ex vivo la proyección de imagen.

Un beneficio adicional del uso del reportero adenovirus es que su aplicación es probable que ampliar al análisis de múltiples vías de señalización en células vivas simultáneamente. En la figura 2A, demostramos que las células MDA-MB-231 podrían ser transduced con 2 vectores de adenovirus separado, CMV-GFP y CAGA-TOM. Este sistema de doble infección puede ampliarse aún más para reportar dos diferentes vías de señalización a través de proteínas de reportero de fluorescencia y reporteros de luciferasa (utilizando proteínas de reportero de luciferasa Firefly y Guassia). Nuestro laboratorio ha logrado simultánea de señalización de vías de señalización BMP/Smad1 y TGF-β/Smad3 en un número de líneas celulares de cáncer vivo (datos no mostrados).

Adenovirus reportero sistemas proporcionan un método fácil y conveniente para la proyección de imagen de células vivas de la vía de señalización de TGF-β/Smad tanto en vitro como in vivo. Este sistema tiene ventajas sobre otros sistemas utilizados reportero. En primer lugar, vectores de adenovirus son informó que entre la más alta eficacia de transducción viral, haciéndolos un óptimo sistema para las líneas celulares que son difíciles de transducir19,20,21,22. Además con los actuales avances en tecnologías virales, vectores de adenovirus "gutless" pueden generarse mediante la eliminación de la mayor parte del genoma viral para ADN exógeno aumento capacidad23. En comparación con los sistemas de vectores no virales, vectores de adenovirus representan una aplicación fácil, rápida y rentable para la transducción de células que resulta en mayor entrega eficiencia19,20,21 ,22.

Este protocolo utiliza un sistema de expresión de adenovirus de segunda generación, que es incompetente la replicación en células de mamífero que no expresan las proteínas E1a y E1b, minimizando riesgos de bioseguridad24. Sin embargo, a pesar de estas mejoradas características de seguridad de la biotecnología, adenovirus partículas aún transducir las células humanas primarias con alta eficacia25,26. Estados Unidos nivel de bioseguridad 2 y contención de los vectores adenoviral se recomienda manejo y eliminación de adenovirus contaminados equipos. Amplificación a gran escala de adenovirus en células HEK293A puede resultar en una generación rara de réplica-competente adenovirus "tipo salvaje"27. Detección de PCR debe realizarse para identificar la contaminación de tipo salvaje27.

Vectores de adenovirus replicación incompetente son transitorios en la expresión y se integra con host ADN20,21. Se recomienda que el experimentador identificar la estabilidad en la expresión de su proteína de reportero al utilizar el sistema de reportero de adenovirus para confirmar la validez de los experimentos a largo plazo. El tiempo de la expresión del vector de adenovirus dentro de una celda es proporcional al tiempo de la división de la célula y MOI viral. Para obtener resultados reproducibles, es fundamental que el título viral es determinar con precisión para cada lote de viral. Además, excesivamente altos volúmenes de los adenovirus pueden causar efectos citotóxicos o citopáticos y es importante que un MOI óptima se determina empíricamente para cada celda alineado utilizado para asegurar los mejores resultados. Además, en vivo uso de adenovirus vectores puede inducir respuestas inmunes; donde la respuesta inmune no es la principal observación del experimento, los animales inmuno-comprometidos se recomiendan20,21. Control de calidad adicional es necesaria para usar los vectores adenoviral objetivo inmune respuestas, aunque el uso de los adenovirus se ha validado como un adyuvante para vacunas terapias28,29.

El sistema de reportero de adenovirus puede utilizarse en una amplia gama de líneas de células primarias y culta de dividir y dividir no naturaleza20,22. Usando el sistema de reportero de adenovirus, hemos alcanzado las tasas de infección del 100% en una serie de líneas celulares de cáncer incluyendo cerebro, mama, colorrectal como células del fibroblasto embriológico primario de ratón (MEF) y canino epitelial de riñón (MDCK) bien. Además, los vectores adenoviral pueden modificarse más para aumentar la afinidad por receptores específicos del tipo de la célula, proporcionando órgano mejor focalización y eficacia de transducción30,31.

Aplicaciones de este método pueden ser ampliados a otras vías de señalización y anfitriones de la célula. Las principales ventajas del sistema adenoviral reportero incluyen eficacia de transducción barato, alta, rápida instalación experimental y falta de integración con el anfitrión DNA21,32. Este método puede ser aplicado a muchos ensayos actuales y los modelos en vivo , incluyendo en la evaluación de nuevas terapias selectivas33. Esperamos que el uso de esta técnica mejorará nuestra comprensión de la relación entre la señalización de vías y procesos biológicos que llevan a nuevos descubrimientos biológicos y el desarrollo de nuevas terapias.

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Disclosures

Los autores no divulgan conflictos de interés.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a H-JZ. TMBW es un recipiente de un premio de postgrado Australia del gobierno australiano y la beca de Top-Up de Ann Henderson de Australian Health de Rotary en pareja con Rotary de Alicante y Cene una cura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

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References

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Investigación de cáncer número 137 TGF-β en vivo la proyección de imagen de la célula adenovirus celular de señalización activación transcripcional de Smad3 cáncer de mama
Proyección de imagen de células del TGF-β/Smad3 señalización vía <em>In Vitro</em> y <em>In Vivo</em> utilizando un Adenovirus reportero sistema en vivo
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Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

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