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Cancer Research

लाइव सेल इमेजिंग के TGF-β/Smad3 संकेतन मार्ग में इन विट्रो और Vivo में एक एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम TGF के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत-β/Smad3 संकेतन गतिविधि एक एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग कर । इस प्रणाली को वास्तविक समय में transcriptional गतिविधि पटरियों और इन विट्रो में और जीवित पशु मॉडल में दोनों एकल कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

परिवर्तन वृद्धि कारक β (TGF-β) संकेतन सेलुलर homeostasis के लिए आवश्यक कई महत्वपूर्ण कार्यों को नियंत्रित करता है और आमतौर पर कैंसर सहित कई रोगों में व्यक्त किया जाता है । TGF-β जोरदार देर स्टेज कैंसर प्रगति के दौरान मेटास्टेसिस में फंसाया, प्रवासी और इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं का एक सबसेट को सक्रिय. संकेत मार्ग विश्लेषण के लिए वर्तमान तरीकों समापन बिंदु मॉडल पर ध्यान केंद्रित है, जो अक्सर को मापने के लिए प्रयास की जैविक घटना के बाद हॉक और रोग के प्रगतिशील प्रकृति को प्रतिबिंबित नहीं करते । यहां, हम TGF के लिए विशिष्ट एक उपंयास एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली प्रदर्शित β/Smad3 संकेत मार्ग है कि जीवित कोशिकाओं में transcriptional सक्रियण का पता लगा सकते हैं । एक विज्ञापन का उपयोग -CAGA12-टीडी-टॉम रिपोर्टर, हम इन विट्रो में24 ज के भीतर एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के १००% संक्रमण दर हासिल कर सकते हैं । एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग transcriptionally सक्रिय कोशिकाओं की प्रत्यक्ष पहचान के साथ वास्तविक समय में लाइव एकल कोशिकाओं के इमेजिंग के लिए अनुमति देता है । TGF-β के साथ संक्रमित कोशिकाओं की उत्तेजना transcriptionally सक्रिय और विशिष्ट जैविक कार्यों में शामिल हैं कि कोशिकाओं का केवल एक सबसेट प्रदर्शित करता है । इस दृष्टिकोण उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के लिए एक एकल कोशिका स्तर पर TGF-β मेंसंकेतन से संबंधित जैविक कार्यों की समझ को बढ़ाने के लिए अनुमति देता है । Smad3 transcriptional गतिविधि भी vivo में एक विज्ञापन-CAGA12-ल्यूक रिपोर्टर के आवेदन के माध्यम से वास्तविक समय में सूचित किया जा सकता है । Ad-CAGA12-ल्यूक पारंपरिक छुरा transfected luciferase सेल लाइनों के रूप में एक ही तरीके से मापा जा सकता है । Smad3 transcriptional vivo में प्रत्यारोपित कोशिकाओं की गतिविधि पारंपरिक IVIS इमेजिंग के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है और निगरानी लाइव ट्यूमर प्रगति के दौरान, TGF-β संकेतन मार्ग की गतिशीलता में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान. हमारे प्रोटोकॉल एक लाभप्रद रिपोर्टर वितरण लाइव सेल के दोनों विट्रो में और vivo मेंसंकेत रास्ते के त्वरित उच्च प्रवाह इमेजिंग के लिए अनुमति देने प्रणाली का वर्णन है । इस विधि छवि की एक सीमा के लिए विस्तारित किया जा सकता है आधारित परख और प्रस्तुत दोनों बुनियादी जीव विज्ञान और चिकित्सीय विकास के लिए एक संवेदनशील और reproducible दृष्टिकोण के रूप में ।

Introduction

बदलने के विकास कारक β (TGF-β) एक आवश्यक cytokine मानव विकास में फंसा है कि एक heterodimeric परिसर के माध्यम से संकेत प्रकार द्वितीय और प्रकार मैं1रिसेप्टर्स से मिलकर. भर्ती और प्रकार मैं रिसेप्टर, जो बारी phosphorylates बहाव Smad2/3 प्रोटीन2,3में फास्फारिलीकरण में द्वितीय रिसेप्टर परिणाम टाइप करने के लिए बाध्यकारी । इन सक्रिय Smad2/3 प्रोटीन Smad4 को बांध, एक जटिल है कि नाभिक में translocates बनाने और जीन प्रतिलेखन4को नियंत्रित करता है । Under समस्थिति conditions TGF-β/Smad संकेतन कसकर विनियमित है; हालांकि, कई रोगों में, संकेतन मार्ग विनियमित है और अक्सर5,6,7रोग की प्रगति के लिए अग्रणी व्यक्त । हाल के अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि सेलुलर रिस्पांस TGF-β heterogenous है और TGF-β/Smad के उपजनसंख्या सक्रिय कोशिकाओं को एक समय पर निर्भर तरीके से जैविक समारोह के लिए जिंमेदार है8,9। TGF के आम सेलुलर विश्लेषण-β/Smad सिग्नलिंग निश्चित समापन बिंदु परख है कि सेलुलर गतिविधि का केवल एक स्नैपशॉट प्रदान करते है और अक्सर औसत TGF-β/Smad प्रभाव10quantitate का उपयोग शामिल है । इन विधियों, तथापि, सही TGF के आणविक व्यवहार का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं-β/Smad रोग प्रगति के दौरान शारीरिक स्थिति में संकेतन. छवि आधारित लाइव कोशिकाओं के विश्लेषण दोनों एक स्थानिक और लौकिक समझ के साथ सेलुलर और जैविक प्रक्रियाओं की गतिशीलता पर कब्जा ।

हमारा लक्ष्य TGF के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक संवेदनशील उच्च प्रवाह विधि विकसित करना था-β/Smad एडीनोवायरस-आधारित रिएजेंट का उपयोग कर संकेतन । यहां, हम संक्रमित मानव स्तन कैंसर सेल लाइन एमडीए-एमबी-२३१ एक एडीनोवायरस व्यक्त Smad3 CAGA आकृति बाध्यकारी अनुक्रम और एक luciferase (ल्यूक) या टीडी-टमाटर (टीडी-टॉम) रिपोर्टर जीन के साथ । Adenoviral रिपोर्टर सिस्टम प्लाज्मिड परिचय है कि कैंसर सेल लाइनों में एक १००% संक्रमण दर में परिणाम कर सकते है के लिए एक त्वरित और सस्ते विधि प्रदान करते हैं । Adenoviral रिपोर्टर सिस्टम भी सफलतापूर्वक सेल लाइनों है कि पारंपरिक प्लाज्मिड11के साथ transfect मुश्किल है के लिए लागू किया गया है । इस प्रोटोकॉल में हम एक reproducible और इनवेसिव प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए TGFβ के लाइव सेल इमेजिंग/Smad संकेत मार्ग दोनों vivo में और इन विट्रो मेंप्राप्त होगा ।

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Protocol

मेलबोर्न पशु आचार समिति के सभी पशु प्रयोगों को विश्वविद्यालय ने अनुमोदित कर दिया.

नोट: अनुक्रम, निर्माण और जनरेशन प्रोटोकॉल adenoviral वैक्टर पी विज्ञापन के लिए-सीएमवी-टीडी-टॉम, पीविज्ञापन-सीएमवी-GFP और पीविज्ञापन-CAGA12-ल्यूक/टीडी-टॉम पहले वर्णित किया गया है11,12, 13. सभी वैक्टर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं ।

1. वायरस Titer निर्धारण ५०% ऊतक-संस्कृति संक्रामक खुराक (TCID५०) का उपयोग

  1. DMEM + 10% FBS मीडिया के 10 मिलीलीटर में 1 x 106 HEK293A कोशिकाओं को तैयार करें ।
  2. बीज १०० µ एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे सेल संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुआं में सेल निलंबन के एल ।
  3. पूरा माध्यम में एक 1:100 वायरस स्टॉक के कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर तैयार । 1 कॉलम के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला वायरस के 11 µ एल जोड़ें ।
  4. 1 x1012 के अंतिम कमजोर पड़ने तक सेल निलंबन के १०० µ एल के साथ पतला वायरस के 11 µ एल मिश्रण द्वारा ९६ खैर प्लेट में सीधे धारावाहिक 10 गुना कमजोर पड़ने प्रदर्शन । हालाँकि कोशिकाएँ इस स्तर पर गैर-अनुयाई हैं, लेकिन कुओं के बीच स्थानांतरित कक्षों की संख्या निरंतर बनी रहती है.
  5. 104के उच्चतम कमजोर पड़ने के साथ शुरू प्रत्येक कॉलम में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 11 µ एल पिपेट । प्रत्येक कमजोर पड़ने के साथ पिपेट सुझावों को बदलने के लिए वायरल कणों के पार से अधिक सीमा ।
  6. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 12 कॉलम के लिए वायरस से मुक्त पूरा मीडिया के 11 µ एल जोड़ें ।
  7. 10% CO2के साथ ३७ ° c पर 7-10 दिनों के लिए थाली मशीन ।
  8. एक खुर्दबीन का प्रयोग, cytopathic या साइटोटोक्सिक प्रभाव के लक्षण प्रदर्शित प्रत्येक स्तंभ में कुओं की संख्या स्कोर । एक अच्छी तरह से सकारात्मक पर विचार अगर संक्रमण के किसी भी संकेत मौजूद है ।
  9. प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए सकारात्मक कुओं के अंश की गणना रीड और Muench (१९३८) सांख्यिकीय विधि14का उपयोग कर ।
  10. का उपयोग कर आनुपातिक दूरी (पीडी) की गणना: (a-50)/(a-B), जहां एक प्रतिशत प्रतिक्रिया के ऊपर या बराबर ५०% है और B प्रतिशत प्रतिक्रिया ५०% से नीचे है ।
  11. गणना TCID५० का उपयोग कर: 10x-पीडी, जहां एक्स कमजोर पड़ने एक प्रतिक्रिया दे ५०% से अधिक है ।
  12. निम्न का उपयोग करने से वायरल titer की गणना: 0.69/(0.011 x TCID५०) PFU/एमएल

2. एडीनोवायरस MOI निर्धारण

  1. बीज १.०-१.५ x 105 एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं DMEM संस्कृति मीडिया के ५०० μL के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली (३५% सेल के प्रवाह, कुल 6 कुओं) के प्रत्येक कुआं में 5% FBS युक्त ।
  2. के संस्करणों की गणना Ad-सीएमवी-Td-टॉम स्टॉक के लिए आवश्यक 0, २५०, ५००, २५००, और ५००० MOI सूत्र का उपयोग: MOI = (volume [μL] x PFU/μL) कोशिकाओं के/number । Ad-सीएमवी-टीडी-टॉम के लिए एक titer के साथ 1 x 1010 (PFU/एमएल), वायरस के संक्रमण के संस्करणों के लिए आवश्यक MOIs 0, ३.७५, ७.५, ३७.५, और ७५ μL क्रमशः हैं ।
  3. खंड २.२ में Ad-सीएमवी-Td-टॉम की गणना की मात्रा के साथ कोशिकाओं को संक्रमित सीधे pipetting वायरल स्टॉक द्वारा पूरी तरह से मिश्रण के साथ कुओं में ।
  4. मशीन में ३७ ° c पर 10% CO2 के साथ 24 घंटे के लिए प्लेट प्लेस
  5. मीडिया को कुएं से निकाल दें और तुरंत 5 मिनट के लिए 10% formalin के ५०० μL के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
  6. महाप्राण वेल्स से formalin और एक बार पंजाब के ५०० μL के साथ कुओं धोने ।
  7. 5 मिनट के लिए Hoechst समाधान के ५०० μL के साथ सेल नाभिक दाग ।
  8. Hoechst सॉल्यूशन निकालें और वेल्स को 3 बार पंजाब के ५०० μL से धोएं ।
  9. छवि टीडी-टमाटर प्रोटीन और सेल नाभिक एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर 200X आवर्धन का उपयोग कर संकेत । ५५४ एनएम पर टीडी टमाटर प्रोटीन उत्तेजित और ३५२ एनएम पर Hoechst डाई ।
  10. ImageJ का उपयोग कर MOI टीडी-टमाटर15के १००% संक्रमण के लिए आवश्यक काम निर्धारित छवियों का विश्लेषण ।

3. दोहरे एडीनोवायरस Transduction लाइव एकल कोशिकाओं में

  1. बीज १.०-१.५ x 105 एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं DMEM संस्कृति मीडिया के ५०० μL के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली (३५% सेल के प्रवाह, कुल में 2 कुओं) के प्रत्येक कुआं में 5% FBS युक्त ।
  2. विज्ञापन के ७५ μL के साथ संक्रमित कोशिकाओं -सीएमवी-GFP (titer = 5 x 109 PFU/एमएल) और ७.५ μL के विज्ञापन-CAGA12-टीडी-टॉम (titer = 5 एक्स 1010 PFU/एमएल) एक २,५०० MOI प्राप्त करने के लिए, जो १००% संक्रमण धनात्मकता प्राप्त कर सकते हैं ।
  3. के साथ या बिना कोशिकाओं का इलाज ०.२५ μL के TGF-β प्रति अच्छी तरह से (10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक में, 5 एनजी/μL अंतिम एकाग्रता के रूप में) एडीनोवायरस संक्रमण के तुरंत बाद ।
  4. मशीन में ३७ ° c पर 10% CO2 के साथ 24 घंटे के लिए प्लेट प्लेस
  5. चरण कंट्रास्ट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ छवि लाइव कोशिकाओं. ४७० एनएम और टीडी-५५४ एनएम में टमाटर प्रोटीन पर GFP उत्तेजित ।
  6. फिक्स कोशिकाओं और दाग सेल नाभिक के रूप में चरण १.६-१.९ में वर्णित है ।
  7. छवि टीडी-टमाटर प्रोटीन और Hoechst एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग दाग । ३५२ एनएम पर Hoechst डाई उत्तेजित ।
  8. ImageJ का प्रयोग, GFP और टीडी-टमाटर सकारात्मक कोशिकाओं15के प्रतिशत की गणना ।

4. लाइव एकल कोशिका घाव भरने परख में संकेतन

  1. बीज 4-5 x 105 एमडीएस-एमबी-DMEM संस्कृति मीडिया की 1 मिलीलीटर के साथ २३१ कोशिकाओं एक 6 अच्छी तरह से थाली (५०% सेल के प्रवाह, कुल में 2 कुओं) के प्रत्येक कुआं में 5% FBS युक्त ।
  2. २२.५ μL के साथ कोशिकाओं को संक्रमित Ad-CAGA12-टीडी-टॉम (titer = 5 एक्स 1010 PFU/एमएल, MOI = २,५००) ।
  3. मशीन में ३७ ° c पर 10% CO2 के साथ 24 घंटे के लिए प्लेट प्लेस
  4. एक अच्छी तरह से एक P200 पिपेट टिप का उपयोग कर के सेल परत पर दो पार लाइनों खरोंच ।
  5. कुओं से पुराने मीडिया को हटा दें और के साथ या बिना ताजा 5% FBS मीडिया के 2 मिलीलीटर की जगह-TGF के ०.५ μL-β प्रति अच्छी तरह से (10 मिलीग्राम/
  6. मशीन में ३७ ° c पर 10% CO2 के साथ थाली प्लेस 5 मिनट के लिए और एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप पर 100X आवर्धन का उपयोग कर चयनित घाव क्षेत्रों की छवियों को ले लो ।
  7. मशीन में ३७ ° c पर 10% CO2 के साथ 24 घंटे के लिए प्लेट प्लेस
  8. पहले की तरह ही क्षेत्रों में घाव बंद करने की छवियों को ले लो ।
  9. ठीक कोशिकाओं, दाग सेल नाभिक के रूप में कदम १.६-१.९ में वर्णित है और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर 200X आवर्धन का उपयोग घाव क्षेत्र और गैर घाव क्षेत्र में टीडी-टमाटर संकेत कल्पना ।
  10. ImageJ सॉफ्टवेयर15का उपयोग कर घाव और गैर घाव क्षेत्र में टीडी-टमाटर सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत को बढ़ाता है ।

5. इन विट्रो Luciferase परख

  1. 5% FBS युक्त DMEM मीडिया के 1 मिलीलीटर में 3-5 x 104 एमडीएस-एमबी-२३१ कोशिकाओं के एक सेल सस्पेंशन तैयार करें ।
  2. विज्ञापन के २.५ μL के साथ संक्रमित सेल सस्पेंशन -CAGA12-ल्यूक (titer = 5 x 1010 PFU/एमएल, MOI = २,५००) ।
  3. संक्रमित कोशिकाओं को ३,००० कोशिकाओं पर एक ९६ अच्छी तरह थाली में बीज/100 µ l/
  4. मशीन में ३७ ° c पर 10% CO2 के साथ 24 घंटे के लिए प्लेट प्लेस
  5. कुओं से पुराने मीडिया को हटा दें और के साथ या ०.१ μL TGF के बिना ताजा 5% FBS मीडिया के १०० µ एल की जगह-β प्रति अच्छी तरह से (1 मिलीग्राम/1 एनजी/μL अंतिम एकाग्रता के रूप में) और उपस्थिति या अनुपस्थिति में ०.१७ μL की TGF-β अवरोधक प्रति अच्छी तरह से (7 मिलीग्राम/ , अंतिम एकाग्रता के रूप में 12 एनजी/μL) (एक उपंयास TGF-β ligand जाल प्रोटीन, चेन एट अल., अप्रकाशित कार्य) ।
  6. मशीन में ३७ ° c पर 10% CO2 के साथ 24 घंटे के लिए प्लेट प्लेस
  7. गल बाहर luciferase परख प्रणाली सब्सट्रेट और डबल आसुत जल (DDW) में 1x सेल संस्कृति lysis एजेंट तैयार करते हैं ।
  8. 30 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ एक कक्षीय शेखर का उपयोग बर्फ पर 1x सेल संस्कृति lysis बफर के ५० μL के साथ ९६ कुओं और लाइसे कुओं से मीडिया को हटा दें ।
  9. एक अपारदर्शी luciferase प्लेट में एक अच्छी तरह से lysate के 30 μL हस्तांतरण और थाली कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  10. luminometer सॉफ़्टवेयर पर, एक नया प्रोटोकॉल बनाएं । इंजेक्शन से पहले और बाद माप के साथ 1 इंजेक्टर के लिए का चयन करें । माप और एकीकरण समय में दोनों देरी के लिए 1 s पर इंजेक्शन से पहले माप सेट. इंजेक्शन माप के बाद, इंजेक्शन की मात्रा सेट और 5 एस एकीकरण समयके बाद 1 एस के माप में देरी के साथ ४० µ l के लिए । ठीकका चयन करके सेटिंग्स की पुष्टि करें ।
  11. DDW में इंजेक्टर ट्यूब प्लेस और प्रयोग से पहले इंजेक्टर ट्यूब को साफ करने के लिए प्रधानमंत्री सेटिंग्स के तहत 1 बटन इंजेक्टर क्लिक करें । अगले DDW से इंजेक्टर ट्यूब निकालें और हवा में जगह 1 इंजेक्टर के दो और प्रधानमंत्री द्वारा पीछा करने के लिए ट्यूब से सभी समाधान फ्लश । सब्सट्रेट तैयार करने के लिए जुगनू सब्सट्रेट और फिर प्रधानमंत्री दो बार में इंजेक्टर ट्यूब प्लेस ।
  12. luminometer में नमूनों के साथ अपारदर्शी luciferase प्लेट प्लेस और सॉफ्टवेयर पर विकल्प का चयन करें । ब्याज की कुओं पर प्रकाश डाला और लागूक्लिक करें । प्रेस शुरू luciferase संकेत को मापने के लिए ।
  13. एक बार माप पूरा कर रहे हैं, हटाने और पानी के साथ थाली कुल्ला । हवा और प्रधानमंत्री इंजेक्टर में ट्यूब डाल द्वारा इंजेक्टर ट्यूब में किसी भी शेष सब्सट्रेट पुनर्प्राप्त करें वापस जुगनू सब्सट्रेट ट्यूब में । DDW में इंजेक्टर ट्यूब प्लेस और किसी भी शेष सब्सट्रेट के इंजेक्टर ट्यूब साफ करने के लिए दो और प्रधानमंत्री प्रदर्शन करते हैं ।

6. Vivo में लाइव सिग्नलिंग इमेजिंग के लिए सेल की तैयारी

  1. ट्यूमर आरोपण से पहले ४८ ज, बीज 2-3x106 एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं में १७५ सेमी2 कुप्पी (कुल में 10 कुप्पी). ३७ ° c, 10% सह2पर 5% FBS युक्त DMEM मीडिया के 20 मिलीलीटर में संस्कृति कोशिकाओं ।
  2. 24 ज बाद में, जोड़ें ३०० μL के विज्ञापन-CAGA12-ल्यूक (titer = 5 x 1010 PFU/एमएल, MOI = २,५००) प्रत्येक कुप्पी में । एक और 24 ज के लिए संस्कृति में कोशिकाओं रखो ।
  3. आरोपण के दिन, पुराने मीडिया को हटाने और एडीनोवायरस संक्रमित कोशिकाओं को धो एक बार पंजाब के 20 मिलीलीटर, पीएच ७.४ के साथ । ०.०५% trypsin-EDTA की कुप्पी में 2 मिलीलीटर जोड़ें और कुप्पी को थोड़ा हिला कर trypsin सभी कुप्पी सतह को कवर करने की अनुमति दें । ३७ डिग्री सेल्सियस, 10% सह2 3 मिनट के लिए में कुप्पी प्लेस ।
  4. FBS के 8 मिलीलीटर-कुप्पी में DMEM मीडिया युक्त जोड़ने के द्वारा trypsin बुझाना । सभी सेल सस्पेंशन को एक ग्लास रिएजेंट बोतल में ट्रांसफर कर दीजिये ।
  5. एक hemocytometer और हस्तांतरण का उपयोग करते हुए सेल संख्या गिनती ४.८ x 107 दो 50 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में कोशिकाओं ।
  6. 5 मिनट के लिए RT पर ४०० x g पर कोशिकाओं को हटाने के लिए trypsin और ताजा FBS के ७२० मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend-DMEM मीडिया ।
  7. एक बाँझ 5 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण और १६० μL Matrigel (10% कुल Matrigel निलंबन) जोड़ें ।
  8. प्रत्यारोपण तक बर्फ पर कोशिकाओं रखो ।

7. Orthotopic आरोपण

  1. वजन 12 SCID चूहों और बेतरतीब ढंग से नियंत्रण और उपचार समूहों (6 चूहों/समूह) में चूहों का आवंटन ।
  2. एक बाँझ जैव में आरोपण का प्रदर्शन कैबिनेट एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए. Anaesthetize माउस का उपयोग २.५-४.५% isoflurane के एक ऑक्सीजन प्रवाह की दर के साथ 1 L/एक गर्मी पैड पर माउस प्लेस और दोनों आंखों पर चिकनाई आंख मरहम की एक बूंद बांटना corneal क्षति से बचने के लिए । एक लापरवाह स्थिति में गर्मी पैड के लिए माउस को ठीक जबकि isoflurane से जुड़े एक नाक शंकु में थूथन रखकर संज्ञाहरण को बनाए रखने ।
  3. पैर की अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की सफलता की पुष्टि करें । १.५ की एक रखरखाव खुराक के लिए isoflurane कम-२.५% के साथ 1 L/न्यूनतम ऑक्सीजन आरोपण के अनुस्मारक के लिए.
  4. midline के लिए कपास झाड़ू का उपयोग करके दोनों पक्षों पर चौथे निप्पल से त्वचा को साफ ८०% इथेनॉल में डूबा हुआ ।
  5. टटोलने का कार्य के माध्यम से 4गु स्तन वसा पैड का पता लगाएं और आगे ऊतक बेनकाब करने के लिए वसा पैड निचोड़ ।
  6. सेल सस्पेंशन को अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting करके मिलाएं । धीरे महाप्राण ५० एक 27G इंसुलिन सिरिंज में सेल मिश्रण के µ एल और माउस के दोनों किनारों पर स्तन वसा पैड में सुई.
  7. वसा पैड की सूजन के लिए महसूस करके एक सफल इंजेक्शन की पुष्टि करें । धीरे वसा पैड रिलीज और माउस पिंजरे में वापस जगह है ।
  8. के लिए गर्मी पैड पर पिंजरों छोड़ कम से 30 मिनट के लिए चूहों चेतना हासिल करने के लिए अनुमति देने के लिए और फिर पिंजरों वापस पकड़ कमरे में 3 दिनों के लिए जगह है ।

8. IVIS इमेजिंग

  1. जीवित छवि सॉफ्टवेयर खोलें ।
  2. नियंत्रण कक्ष पर IVIS सिस्टम प्रारंभ करें बटन क्लिक करके IVIS सिस्टम प्रारंभ करें । रुको जब तक तापमान हस्ताक्षर हरी बदल जाता है ।
  3. नियंत्रण कक्ष पर Luminescent इमेजिंग मोड का चयन करें ।
  4. चैंबर और IVIS प्रणाली को isoflurane संज्ञाहरण पर बारी ।
  5. २.५-४.५% isoflurane के साथ 1 L/न्यूनतम ऑक्सीजन का उपयोग करके चूहों को Anaesthetize । एक बार anaesthetized, रखरखाव के लिए १.५-२.५% पर isoflurane सेट । intraperitoneal (आईएफसआई) इंजेक्शन द्वारा चूहों में डी-luciferin के १५० मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन का इंजेक्शन ।
  6. तुरंत IVIS प्रणाली में चूहों हस्तांतरण, उन्हें तापमान नियंत्रित इमेजिंग मंच पर जगह और नाक शंकु में अपनी नाक जगह है ।
  7. नियंत्रण कक्ष पर अनुक्रम सेटअप बटन पर क्लिक करें और मध्यम का चयन करें बिन्नी।
  8. इमेजिंग एक्सपोज़र समय निम्नानुसार सेट करें: 10 एस, 20 एस, 30 एस, ६० एस, और १२० एस. शुरू इमेजिंग लगभग 3 मिनट luciferin इंजेक्शन के बाद और छवि के लिए जारी जब तक संकेत ड्रॉप करने के लिए शुरू होता है (आम तौर पर यह 20 मिनट के आसपास ले जाएगा) ।
  9. एक नाक शंकु के माध्यम से isoflurane एनेस्थेटिक को बनाए रखते हुए IVIS से चूहों को दूर करने और इंट्रा ट्यूमर इंजेक्शन के माध्यम से ५० µ l पंजाबियों या ५० µ l TGF-β संकेतन अवरोध करनेवाला (५० μg/ट्यूमर) के साथ चूहों का इलाज.
  10. चूहों पिंजरे में वापस डाल दिया है और उन्हें गर्मी पैड पर कम से कम 30 मिनट के लिए छोड़ दें । इसके बाद पिंजरे को पकड़कर कमरे में वापस रखें ।
  11. दोहराएँ IVIS इमेजिंग प्रक्रिया के रूप में दिन के बाद ऊपर वर्णित उपचार.

9. डेटा विश्लेषण

  1. छवि सॉफ़्टवेयर के रहने में सहेजी गई फ़ाइलें खोलें ।
  2. दृश्य का उपयोग करके छवि जानकारी ढूंढें । छवि जानकारी।
  3. उसी एक्सपोज़र समय के साथ एक समान समय बिंदु पर ली गई फ़ोटो चुनें. एक समूह के रूप में फ़ोटो लोड ।
  4. अचयनित छवि में व्यक्तिगत बॉक्स तीव्रता को सामान्य करने के लिए समायोजित करें ।
  5. तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए फोटॉन मोड का चयन करें । roi टूलमें ब्याज (roi) बटन के क्षेत्र का चयन करके सिग्नल की तीव्रता को बढ़ाता है.
  6. ROI सर्कल को bioluminescent सिग्नल वाले क्षेत्र में खींचें और संकेत तीव्रता प्राप्त करने के लिए माप बटन पर क्लिक करें.

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Representative Results

लाइव एकल सेल इमेजिंग इन विट्रो में

TGF-β/Smad के सक्रियण का सही आकलन करने के लिए एडीनोवायरस आधारित रिएजेंट का उपयोग करते हुए एकल कक्षों में, यह पहले प्रत्येक कक्ष पंक्ति के लिए इष्टतम गुणा संक्रमण (MOI) का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । इष्टतम MOI निर्धारित होता है जब कोशिकाओं के १००% कोई वर्तमान cytopathic या साइटोटोक्सिक प्रभाव के साथ adenoviral संक्रमण के लिए सकारात्मक हैं । यह निर्धारित करने के लिए, हम एक constitutively सक्रिय विज्ञापन-सीएमवी-Td-टॉम रिपोर्टर है कि सकारात्मक संक्रमण के एक मार्कर के रूप में काम किया करते थे । एडीनोवायरस संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत एक MOI निर्भर तरीके से 0 से ५,००० MOI में वृद्धि हुई थी । २,५०० MOI पर, हम एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं में १००% टीडी-टॉम अभिव्यक्ति मनाया (आंकड़ा 1a, 1b) । पिक्सेल तीव्रता सेल भी MOI के साथ वृद्धि हुई, बढ़ाया संवेदनशीलता प्रदान करने और transcriptional उत्पादन (चित्रा 1C) का पता लगाने । इसलिए, २,५०० के एक कार्य MOI एक दोहरे संक्रमण जहां कोशिकाओं ad-सीएमवी-GFP (सेल संक्रमण के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य) और विज्ञापन CAGA12-टीडी-टॉम एक साथ के साथ संक्रमित थे प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सिंगल सेल टीडी-टॉम अभिव्यक्ति के विभिंन स्तर प्रस्तुत की heterogenous सक्रियकरण TGF-β/Smad3 प्रतिलेखन दोनों रहते है और निश्चित कोशिकाओं में कोशिकाओं में । (चित्रा 2a, बी) । एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के १००% GFP अभिव्यक्ति के साथ प्रस्तुत की जबकि केवल लगभग 26% कोशिकाओं का पता लगाने के लिए प्रदर्शित TGF-β/Smad3 transcriptional गतिविधि 24 ज TGF-β उत्तेजना के बाद, TGF के बिना 0% धनात्मकता के मुकाबले-β उपचार (चित्रा 2c). जैविक प्रक्रियाओं के दौरान TGF-β/Smad3 transcriptional गतिविधि की जांच करने के लिए एडीनोवायरस आधारित रिएजेंट का उपयोग करने के लिए, एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं २५०० CAGA पर Ad-MOI12-टीडी-टॉम से संक्रमित थे और एक घाव भरने परख के अधीन । संक्रमित एमडीएस-एमबी-२३१ कोशिकाओं का प्रदर्शन सामान्य माइग्रेशन व्यवहार और कोशिकाओं के साथ इलाज किया 5 एनजी/एमएल TGF-β गैर-TGF-β इलाज कोशिकाओं (चित्रा 3) की तुलना में बढ़ाया घाव बंद करने दिखाया. विशेष रूप से, के बारे में ६२% घाव क्षेत्र में कोशिकाओं सकारात्मक TGF-β/Smad3 transcriptional गतिविधि है, जो काफी अधिक है गैर में मनाया-घाव क्षेत्र (३२%) के बाद TGF-β उपचार (चित्रबी) । जैसे, एडीनोवायरस-आधारित रिएजेंट्स TGF-β सिग्नलिंग मार्ग में लाइव एकल कक्ष में इन विट्रो मेंइमेजिंग के लिए उनके अनुप्रयोग मान्य है ।

Live TGF-β सिग्नलिंग इमेजिंग vivo में

विज्ञापन की संवेदनशीलता -CAGA12-ल्यूक रिपोर्टर पहले TGF-β उत्तेजना और एक TGF-β अवरोध करनेवाला की उपस्थिति के जवाब में इन विट्रो में परीक्षण किया गया था । जब संक्रमित एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं 1 एनजी/एमएल TGF-β के साथ उत्तेजित थे, luciferase रिपोर्टर गतिविधि बेसल अनुपचारित एमडीए-एमबी-२३१ के स्तर की तुलना में १,२०० गुना बढ़ गई । यह प्रतिक्रिया उल्लेखनीय 12 µ g/TGF के मिलीलीटर-β अवरोध करनेवाला (चित्रा 4a) द्वारा अवरुद्ध किया गया था । विज्ञापन CAGA12-ल्यूक एजेंट बाद में एक स्तन ट्यूमर orthotopic आरोपण पशु मॉडल में परीक्षण किया गया था । दोनों नियंत्रण और TGF-β अवरोध करनेवाला समूहों के इलाज से पहले समान luciferase रिपोर्टर गतिविधि का प्रदर्शन किया । हालांकि, नियंत्रण समूह के लिए, luciferase संकेत पंजाब उपचार के बाद बदल नहीं किया, जबकि, चूहों TGF के साथ इलाज-β अवरोधक के आसपास दिखाया 3-गुना संकेत कमी (चित्रा 4B, 4c). सामूहिक रूप से, इन परिणामों के लाइव और वास्तविक समय की निगरानी के लिए क्षमता प्रदर्शित TGF-β में पशु बलि की आवश्यकता के बिना vivo संकेत गतिविधि.

Figure 1
चित्र 1. एडीनोवायरस-आधारित रिएजेंट के MOI का निर्धारण । एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं अलग MOI पर विज्ञापन सीएमवी-टीडी-टॉम से संक्रमित थे और एक 12 कुओं की थाली में वरीयता प्राप्त । 24 एच संक्रमण के बाद, कोशिकाओं को ठीक किया गया और परमाणु Hoechst से सना हुआ । (एक) छवियों टीडी-टॉम सकारात्मक कोशिकाओं (लाल) और नाभिक (नीला) और ImageJ द्वारा quantified कल्पना करने के लिए ले जाया गया । (ख) टीडी-टॉम सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत । (ग) टीडी-टॉम पिक्सेल तीव्रता सेल/ इन आंकड़ों में कम से 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । दिखाया डेटा triplicates ± एसडी के साधन हैं. स्केल बार = ५० µm (200X) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. दोहरे संक्रमण के लिए एकल सेल इमेजिंग । एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं दोहरी MOI (२,५००) पर विज्ञापन-सीएमवी-GFP और विज्ञापन CAGA12-टीडी-टॉम से संक्रमित थे और एक 12 कुओं की थाली में वरीयता प्राप्त । 24 एच संक्रमण के बाद, कोशिकाओं के साथ या बिना 5 एनजी/एमएल TGF-β इलाज किया गया । (क) 24 एच उपचार के बाद, कोशिकाओं को GFP सकारात्मक (हरे) और टीडी-टॉम सकारात्मक (लाल) कोशिकाओं कल्पना छवि रहते थे । कोशिकाओं को फिर तय किया गया और परमाणु ठहराव के लिए Hoechst द्वारा दाग । (ख) छवियों GFP सकारात्मक (हरा), टीडी-टॉम सकारात्मक (लाल) कोशिकाओं और नाभिक (नीला) कल्पना करने के लिए ले जाया गया । (ग) GFP या टीडी-टॉम पॉजिटिव कोशिकाओं को ImageJ द्वारा quantified गया और धनात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना की गई. इन आंकड़ों में कम से 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । दिखाया डेटा triplicates ± एसडी के साधन हैं । सांख्यिकीय महत्व छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था (* * * * p ≤ ०.०००१) । स्केल बार = ५० µm (200X) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. लाइव सेल TGF-β सिग्नलिंग सेल माइग्रेशन को बढ़ावा देता है । एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं विज्ञापन से संक्रमित थे -CAGA12-टीडी- MOI पर टॉम (२,५००) और एक 6 कुओं की थाली पर वरीयता प्राप्त । 24 एच संक्रमण के बाद, कोशिकाओं को एक घाव और मीडिया के साथ या बिना 5 एनजी/एमएल TGF-β बनाने के लिए एक P200 पिपेट टिप का उपयोग खरोंच थे । एक और 24 एच के बाद, कोशिकाओं और निश्चित दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए Hoechst द्वारा दाग परमाणु थे । (क) घाव बंद करने के चरण कंट्रास्ट, स्केल बार = १०० µm (100X) । (ख) टीडी-टॉम पॉजिटिव (लाल) कोशिकाओं और नाभिक (नीला) । स्केल बार = ५० µm (200X) (C) टीडी-टॉम सकारात्मक कोशिकाओं ImageJ द्वारा quantified थे और सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना की गई । इन आंकड़ों में कम से 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । दिखाया डेटा triplicates ± एसडी के साधन हैं । सांख्यिकीय महत्व छात्र टी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था (* * * * p ≤ ०.०००१) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. vivo live TGF-β संकेतन इमेजिंग में । (क) एमडीएस-एमबी-२३१ कोशिकाओं Ad-CAGA12-ल्यूक से संक्रमित थे और फिर 24 एच के लिए ९६ वेल्स प्लेट में वरीयता प्राप्त । इसके बाद, कोशिकाओं के साथ या के बिना इलाज किया गया 1 एनजी/एमएल TGF-β उपस्थिति या अनुपस्थिति में 12 µ g/एमएल TGF-β अवरोध करनेवाला रात भर । पूरे सेल lysate के आधार पर luciferase गतिविधि को मापा गया । Luciferase गतिविधियों को कोई उपचार नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत प्रेरण की तह के रूप में प्रस्तुत किया गया । दिखाया डेटा triplicates ± एसडी के साधन हैं । (ख) एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं के साथ संक्रमित थे Ad-CAGA12-ल्यूक 24 ज आरोपण से पहले । कोशिकाओं SCID चूहों के दोनों किनारों पर स्तन वसा पैड में प्रत्यारोपित किया गया । ७२ h बाद में, IVIS इमेजिंग से पहले और बाद में 24 ज उपचार (पंजाब के लिए नियंत्रण समूह और ५० µ g/ट्यूमर TGF-β अवरोधक के लिए उपचार समूह) किया गया था । (ग) फोटॉन फ्लक्स इमेज साफ्टवेयर रहने से quantified था । दिखाया डेटा प्रत्येक उपचार समूह (n = 12) ± एसडी के साधन हैं । सांख्यिकीय महत्व छात्र टी परीक्षण (* * p ≤ ०.०१, * * * * p ≤ ०.०००१ द्वारा निर्धारित किया गया था) । p/s को संदर्भित करता है फोटॉनों/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम एक तकनीक विकसित की है वास्तविक समय इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए TGF-β/Smad3 एक जीवित कोशिकाओं में संकेतन । इस उपंयास विधि का उपयोग कर, हम पहले से गतिशील TGF-β/Smad3 transcriptional गतिविधि है कि बढ़ाया आक्रमण और प्रवास8के साथ जुड़ा हुआ था के साथ कोशिकाओं की एक उप जनसंख्या की पहचान की है । इस विधि TGF के लिए पारंपरिक परख पर सुधार-β संकेत, ऐसे Smad3 फास्फारिलीकरण और TGF के पश्चिमी दाग के रूप में-β लक्षित जीन अभिव्यक्ति, विविधता के TGF पर कब्जा करके-β/Smad3 ट्यूमर जनसंख्या के भीतर संकेतन और हाइलाइटिंग एकल कोशिका जीवविज्ञान का महत्व. इसके अतिरिक्त, ऐसे परमाणु translocation के रूप में एक सेल इमेजिंग के वैकल्पिक तरीकों समय लगता है और महंगा हो सकता है अगर जीवित कोशिकाओं में प्रदर्शन किया और हमेशा के लिए नहीं अनुवाद कर सकते है जीन प्रतिलेखन16,17। इन तरीकों संकेत transduction के ऊपर रास्ते की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली जैविक समारोह के संबंध में व्यक्तिगत कोशिकाओं में संकेत TGF-β/Smad3 पर एक अनूठा परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है ।

गौरतलब है, हमारी विधि TGF-β/Smad3 संकेतन मार्ग में ट्यूमर की प्रगति और उपचार के दौरान वास्तविक समय में vivo का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील और reproducible विधि प्रदान करता है । वीवो इमेजिंग में पारंपरिक स्थिर luciferase के समान, TGF का पता लगाना-β/Smad3 माउस के भीतर संकेत कोशिकाओं की संख्या और प्रमोटर गतिविधि के स्तर पर निर्भर है18. जबकि चमड़े के नीचे ऊतक विश्लेषण के लिए थोड़ा हस्तक्षेप प्रदान करता है, कोशिकाओं की गहराई में वृद्धि संकेत का पता लगाने की संवेदनशीलता को कम करेगा । यह अन्य अंगों में उपयोग के लिए विधि का विस्तार करने के लिए संभव है, जैसे फेफड़ों और हड्डी, और अन्य कैंसर; हालांकि, संकेत अनुकूलन या पूर्व vivo इमेजिंग रुचि के कैंसर मॉडल के लिए आवश्यक संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है ।

एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग करने का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि अपने आवेदन लाइव कोशिकाओं में एक साथ कई संकेत रास्ते के विश्लेषण के लिए विस्तार की संभावना है. चित्रा 2aमें, हम प्रदर्शन किया है कि एमडीए-एमबी-२३१ कोशिकाओं 2 अलग एडीनोवायरस वैक्टर, सीएमवी-GFP और CAGA-टॉम के साथ transduced जा सकता है । इस दोहरे संक्रमण प्रणाली को आगे दोनों प्रतिदीप्ति रिपोर्टर प्रोटीन और luciferase पत्रकारों (जुगनू और Guassia luciferase रिपोर्टर प्रोटीन का उपयोग करके) के माध्यम से दो अलग संकेतन रास्ते की रिपोर्ट का विस्तार किया जा सकता है । हमारी प्रयोगशाला में एक साथ बीएमपी/Smad1 और TGF-β/Smad3 सिग्नलिंग रास्ते लाइव कैंसर सेल लाइनों की एक संख्या में प्राप्त किया है (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

एडीनोवायरस रिपोर्टर सिस्टम TGF के लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक आसान और सुविधाजनक विधि प्रदान-β/Smad संकेतन मार्ग दोनों में इन विट्रो और vivo में. इस प्रणाली के अंय सामांयतः इस्तेमाल रिपोर्टर प्रणालियों पर विशिष्ट लाभ है । सबसे पहले, एडीनोवायरस वैक्टर सबसे अधिक वायरल transduction प्रभावकारिता के बीच की रिपोर्ट कर रहे हैं, उंहें सेल लाइनों कि transduce19,20,21,22के लिए मुश्किल है के लिए एक इष्टतम प्रणाली बना । इसके अलावा वायरल प्रौद्योगिकियों में वर्तमान प्रगति के साथ, ' gutless ' एडीनोवायरस वैक्टर वायरल वृद्धि exogenous डीएनए क्षमता23के लिए अनुमति जीनोम के अधिकांश को हटाने के द्वारा उत्पंन किया जा सकता है । गैर-वायरल डिलिवरी सिस्टम की तुलना में, एडीनोवायरस वैक्टर सेल transduction के लिए एक लागत प्रभावी, त्वरित और आसान अनुप्रयोग का प्रतिनिधित्व करते हैं जो परिणाम में अब तक अधिक से अधिक प्रसव दक्षता19,20,21 ,22.

यह प्रोटोकॉल एक दूसरी पीढ़ी के एडीनोवायरस एक्सप्रेशन सिस्टम का उपयोग करता है, जो स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिकृति-अक्षम होता है जो E1a और E1b प्रोटीन को व्यक्त नहीं करते हैं, जो कि अधिक से अधिक सुरक्षा जोखिम24को कम करते हैं । हालांकि, इन संवर्धित सुरक्षा सुविधाओं के बावजूद, एडीनोवायरस कणों अभी भी उच्च प्रभावकारिता25,26के साथ प्राथमिक मानव कोशिकाओं transduce कर सकते हैं । अमेरिका के सुरक्षा स्तर 2 और adenoviral वैक्टर की रोकथाम जब हैंडलिंग और एडीनोवायरस दूषित उपकरणों के निपटान की सिफारिश की है । HEK293A कोशिकाओं में एडीनोवायरस के बड़े पैमाने पर प्रवर्धन प्रतिकृति के एक दुर्लभ पीढ़ी में परिणाम कर सकते हैं-सक्षम "वाइल्ड-प्रकार" एडीनोवायरस27. पीसीआर स्क्रीनिंग वाइल्ड टाइप प्रदूषित27की पहचान के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

प्रतिकृति-अक्षम एडीनोवायरस वैक्टर अभिव्यक्ति में क्षणिक है और मेजबान डीएनए20,21के साथ एकीकृत नहीं है । यह सिफारिश की है कि प्रयोगकर्ता अपने रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति में स्थिरता की पहचान जब एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग करने के लिए दीर्घकालिक प्रयोगों की वैधता की पुष्टि । एक सेल के भीतर एडीनोवायरस वेक्टर की अभिव्यक्ति समय सेल और वायरल MOI के विभाजन समय के लिए आनुपातिक है । reproducible परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि वायरल titer सही प्रत्येक वायरल बैच के लिए निर्धारित है । इसके अतिरिक्त, एडीनोवायरस की जरूरत से ज्यादा उच्च मात्रा साइटोटोक्सिक या cytopathic प्रभाव में परिणाम कर सकते है और यह महत्वपूर्ण है कि एक इष्टतम MOI प्रत्येक के लिए सबसे अच्छा परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रयुक्त सेल के लिए निर्धारित empirically है । इसके अलावा, vivo में एडीनोवायरस वैक्टर का उपयोग प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित कर सकते हैं; जहां प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रयोग की प्राथमिक अवलोकन नहीं है, प्रतिरक्षा समझौता जानवरों20,21की सिफारिश कर रहे हैं । अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण जब adenoviral वैक्टर का उपयोग प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को लक्षित करने की आवश्यकता है, हालांकि एडीनोवायरस के उपयोग वैक्सीन28,29उपचार के लिए एक सहायक के रूप में मांय किया गया है ।

एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली दोनों विभाजन और गैर-विभाजित प्रकृति20,22के प्राथमिक और सुसंस्कृत सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला पर इस्तेमाल किया जा सकता है । एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली का प्रयोग, हम कैंसर कोशिका लाइनों मस्तिष्क सहित, स्तन, कोलोरेक्टल के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक माउस Embryological Fibroblast (MEF) और कुत्ते गुर्दे उपकला (MDCK) कोशिकाओं की एक संख्या में १००% संक्रमण दर हासिल की है । इसके अतिरिक्त, adenoviral वैक्टर आगे सेल प्रकार विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए समानता बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है, transduction30,31के लिए बेहतर अंग लक्ष्यीकरण और प्रभावकारिता प्रदान.

इस विधि के अनुप्रयोगों अन्य संकेतन रास्ते और सेल होस्ट करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है । adenoviral रिपोर्टर प्रणाली के प्रमुख लाभ सस्ते, उच्च transduction प्रभावकारिता, त्वरित प्रयोगात्मक सेटअप और मेजबान डीएनए21,३२के साथ एकीकरण की कमी शामिल हैं । इस विधि कई मौजूदा परख करने के लिए और vivo मॉडल में लागू किया जा सकता है, नए लक्षित चिकित्सकीय३३के मूल्यांकन में शामिल हैं । हमें उंमीद है कि इस तकनीक के उपयोग के संकेत रास्ते और जैविक नई जैविक खोजों के लिए अग्रणी प्रक्रियाओं और नए उपचारों के विकास के बीच संबंधों की हमारी समझ में वृद्धि होगी ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं रिपोर्ट ।

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य एवं आयुर्विज्ञान अनुसंधान परिषद् (NHMRC) से एच-JZ तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. TMBW ऑस्ट्रेलियाई सरकार और एन हेंडरसन टॉप से एक ऑस्ट्रेलिया स्नातकोत्तर पुरस्कार के एक प्राप्तकर्ता है साथी में ऑस्ट्रेलियाई रोटरी स्वास्थ्य से Templestowe के रोटरी के साथ छात्रवृत्ति और एक इलाज के लिए भोजन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३७ TGF-β लाइव सेल इमेजिंग एडीनोवायरस सेल संकेत स्तन कैंसर Smad3 transcriptional सक्रियण
लाइव सेल इमेजिंग के TGF-β/Smad3 संकेतन मार्ग <em>में इन विट्रो</em> और <em>Vivo में</em> एक एडीनोवायरस रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग
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Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

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