Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject In Vitro en In Vivo met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een protocol voor levende cellen beeldvorming van de signalering activiteit TGF-β/Smad3 met behulp van een adenovirus verslaggever systeem. Dit systeem transcriptionele activiteit in real time worden bijgehouden en kunnen worden toegepast op beide afzonderlijke cellen in vitro en in levende diermodellen.

Abstract

Transformeren groeifactor β (TGF-β) signalering reguleert vele belangrijke functies die nodig zijn voor cellulaire homeostase en wordt vaak gevonden in veel ziekten, waaronder kanker overexpressie. TGF-β is sterk betrokken bij de metastase tijdens late stadium kanker progressie, het activeren van een subset van migratiestromen en invasieve tumorcellen. Huidige methoden voor signalering traject analyse richten op eindpunt modellen, die vaak proberen te meten van signalering post-hoc van de biologische evenement en komen niet overeen met de progressieve aard van de ziekte. Hier tonen we een nieuwe adenovirus verslaggever systeem specifiek voor de TGF-β/Smad3 signalering traject dat transcriptionele activering in levende cellen kan detecteren. Gebruik makend van een verslaggever van Ad-CAGA12-Td-Tom , kunnen we een 100% besmettingsgraad van MDA-MB-231 cellen binnen 24u in vitro. Het gebruik van een fluorescerende verslaggever zorgt voor de beeldvorming van levende enkele cellen in real time met rechtstreekse identificatie van transcriptionally actieve cellen. Stimulatie van geïnfecteerde cellen met TGF-β wordt alleen een subset van cellen die transcriptionally actief en betrokken in de specifieke biologische functies zijn weergegeven. Deze aanpak zorgt voor hoge specificiteit en de gevoeligheid op het niveau van een eencellige om inzicht in de biologische functies gerelateerde TGF-β signalering in vitro. Smad3, transcriptionele activiteit kan ook worden gerapporteerd in vivo in real-time door de toepassing van een Ad-CAGA12- Luc verslaggever. Ad-CAGA12- Luc kan worden gemeten op dezelfde wijze als traditionele stabiel transfected luciferase cellijnen. Smad3 transcriptionele activiteit van cellen geïmplanteerd in vivo kan worden geanalyseerd door middel van conventionele IVIS imaging en gecontroleerd live tijdens de progressie van de tumor, unieke inzicht bijbrengen in de dynamiek van de signalering TGF-β-pathway. Ons protocol beschrijft een voordelige verslaggever leveringssysteem toestaan voor snelle high-throughput beeldvorming van levende cellen signaling pathways zowel in vitro als in vivo. Deze methode kan worden uitgebreid tot een scala aan beeld gebaseerde testen en presenteert als een gevoelige en reproduceerbare aanpak voor zowel de fundamentele biologie en de therapeutische ontwikkeling.

Introduction

Transformeren groeifactor β (TGF-β) is een essentiële cytokine betrokken in de menselijke ontwikkeling die signalen via een heterodimeric complex bestaande uit type II en type ik receptoren1. Binding met de type II receptor resultaten bij de werving en fosforylering van type ik receptor, dat op zijn beurt kinaseenzym stroomafwaarts Smad2/3 eiwitten2,3. Deze Smad2/3 eiwitten binden aan Smad4, vormen een complex dat translocates in de kern en regelt gene transcriptie4geactiveerd. Homeostatische voorwaarden TGF-β/Smad is signalering strak geregeld is; echter in vele ziekten, het signalering traject is gedereguleerd en vaak leiden tot progressie van de ziekte5,6,7overexpressie. Recente studies hebben aangetoond dat cellulaire reactie op TGF-β heterogeen is en subpopulaties van TGF-β/Smad actieve cellen verantwoordelijk voor biologische functie in een tijd-afhankelijke manier8,9 zijn. Gemeenschappelijke cellulaire analyse van TGF-β/Smad signalering impliceert het gebruik van vaste eindpunt tests die bieden slechts een momentopname van cellulaire activiteit en de gemiddelde TGF-β/Smad effect10vaak te kwantificeren. Deze methoden, maar kunnen niet nauwkeurig vertegenwoordigen de moleculaire gedrag van TGF-β/Smad signalering in de fysiologische staat tijdens de progressie van de ziekte. Beeld-gebaseerde analyse van levende cellen vangen de dynamiek van cellulaire en biologische processen met beide een ruimtelijke en temporele begrip.

Ons doel was het ontwikkelen van een gevoelige methode hoge gegevensdoorvoer voor levende cellen beeldvorming van TGF-β/Smad signalering gebruikmaken van adenovirus gebaseerde reagentia. Hier, besmet we de menselijke borst kanker cellijn MDA-MB-231 met een uiting van de Smad3 CAGA motief bindende volgorde en een luciferase (Luc) of Td-tomaat (Td-Tom) verslaggever gene adenovirus. Adenovirale verslaggever systemen bieden een snelle en goedkope methode voor het plasmide inleiding is die in een 100% besmettingstarief in kanker cellijnen resulteren kan. Adenovirale verslaggever systemen hebben ook met succes toegepast op cellijnen die moeilijk te transfect met conventionele plasmide11. In dit protocol beschrijven we een reproduceerbare en noninvasive proces om levende cellen beeldvorming van de signalering traject van TGFβ/Smad zowel in vivo en in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Universiteit van Melbourne dier ethisch comité.

Opmerking: De volgorde, de bouw en de generatie protocol voor de adenovirale vectoren pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP en pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom geweest eerder beschreven11,,12, 13. Alle vectoren zijn commercieel verkrijgbaar.

1. virus Titer bepaling met 50% weefselkweek infectieuze dosis (TCID50)

  1. Bereiden 1 x 106 HEK293A cellen in 10 mL DMEM + 10% FBS media.
  2. Beënt 100 µL celsuspensie in elk putje van de plaat van een 96-Wells flat-onderste cel cultuur.
  3. Bereiden 1 mL van een verdunning 1:100 virus voorraad in volledige medium. Voeg 11 µL van verdunde virus aan elk putje van kolom 1.
  4. Seriële 10-fold verdunningen rechtstreeks in de 96 goed plaat uitvoeren door het mengen van 11 µL van verdunde virus met 100 µL celsuspensie tot een uiteindelijke verdunning van 1 x1012 is bereikt. Hoewel cellen niet-aanhanger zijn in dit stadium, het aantal cellen overgedragen tussen putten constant blijft.
  5. Pipetteer 11 µL van elke verdunning in elke kolom die beginnen met de hoogste verdunning van 104. Pipetteer tips vervangen door elke verdunning te beperken van cross-over van virale deeltjes.
  6. Voeg 11 µL van virus-vrij volledige media naar kolom 12 als een negatieve controle.
  7. Incubeer plaat voor 7-10 dagen bij 37 ° C met 10% CO2.
  8. Met behulp van een Microscoop, score het aantal putten in elke kolom tekenen van cytopathogeen of cytotoxische effecten weer te geven. Overwegen een goed positief als enig teken van infectie aanwezig is.
  9. Berekenen van de Fractie van positieve putten voor elke verdunning met behulp van de riet- en Muench (1938) statistische methode14.
  10. Bereken met behulp van de proportionele afstand (PD): (A-50)/(A-B), waar is de reactie van het percentage groter dan of gelijk aan 50% van de A en B is de reactie van het percentage lager dan 50%.
  11. Bereken met behulp van TCID50 : 10X-PD, waarbij X staat voor de verdunning een groter is dan 50% antwoord te geven.
  12. Virale titer van het gebruik van het volgende berekenen: 0.69 / (0.011 x TCID50) PFU/mL

2. adenovirus MOI bepaling

  1. Zaad 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 cellen met 500 μL van DMEM voedingsbodems met 5% FBS in ieder putje van een 12 goed plaat (35% cel confluentie, 6 wells in totaal).
  2. De volumes van Ad-CMV-Td-Tom voorraad vereist voor 0, 250, 500, 2500 en 5000 MOI met volgende formule berekenen: MOI = (volume [μL] x PFU/μl) / aantal cellen. Voor Ad-CMV-Td-Tom met een titer van 1 x 1010 (PFU/mL), de hoeveelheid virusinfectie zijn vereist MOIs 0, 3,75, 7.5, 37,5 en 75 μL respectievelijk.
  3. De cellen met de berekende volumes van Ad-CMV-Td-Tom in punt 2.2 besmetten door direct pipetteren virale voorraad in de putjes met homogenisatie van het mengsel.
  4. Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.
  5. Verwijder het medium van de putten en onmiddellijk het herstellen van de cellen met de 500 μL van 10% formaline gedurende 5 minuten.
  6. Gecombineerd de formaline uit putten en putjes met 500 μL van PBS keer wassen.
  7. Vlek de celkern met 500 μL van Hoechst oplossing voor 5 min.
  8. Verwijder de oplossing Hoechst en was de putjes met 500 μL van PBS 3 keer.
  9. Beeld de Td-tomaat-eiwit en celkern signaal met behulp van 200 X vergroting op een fluorescentie Microscoop. Excite Td-tomaat eiwit op 554 nm en het Hoechst kleurstof op 352 nm.
  10. Analyseren van beelden met behulp van ImageJ om te bepalen van de MOI voor 100% van het Td-tomaat15 vereistwerken.

3. dual-adenovirus signaaltransductie in levende enkele cellen

  1. Zaad 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231 cellen met 500 μL van DMEM voedingsbodems met 5% FBS in ieder putje van een 12 goed plaat (35% cel confluentie, 2 putten in totaal).
  2. Cellen met 75 μL van Ad-CMV-GFP infecteren (titer = 5 x 109 PFU/mL) en 7,5 μL van Ad-CAGA12-Td-Tom (titer = 5 x 1010 PFU/mL) te verkrijgen van een 2.500 MOI, die 100% infectie positiviteit kan bereiken.
  3. Cellen met of zonder 0,25 μL van TGF-β per putje (10 mg/mL in voorraad, 5 ng/μL als de uiteindelijke concentratie) behandelen onmiddellijk na infectie van het adenovirus.
  4. Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.
  5. Afbeelding levende cellen met fluorescentie fasecontrastmicroscoop. GFP prikkelen op 470 nm en Td-tomaat eiwit op 554 nm.
  6. Los van de cellen en vlek celkern zoals beschreven in stappen 1.6 - 1.9.
  7. Beeld de Td-tomaat-eiwit en Hoechst vlek met behulp van een fluorescentie Microscoop. Excite de Hoechst kleurstof op 352 nm.
  8. Met behulp van ImageJ, berekenen dat de percentage van GFP en Td-tomaat positieve cellen15.

4. levende eencellige signalering wondheling in Assay

  1. Zaad 4-5 x 105 MDA-MB-231 cellen met 1 mL van DMEM voedingsbodems met 5% FBS in ieder putje van een 6 goed plaat (50% cel confluentie, 2 putten in totaal).
  2. De cellen met 22.5 μL van Ad-CAGA12-Td-Tom infecteren (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.
  4. Krabben twee snijdende lijnen op de cellaag van elk putje met behulp van een P200 pipette uiteinde.
  5. Verwijder de oude media uit putten en vervang met 2 mL vers 5% FBS media met of zonder 0,5 μL van TGF-β per putje (10 mg/mL in voorraad, 5 ng/μL als eindconcentratie).
  6. Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 voor 5 min en nemen van beelden van geselecteerde wond gebieden met behulp van 100 X vergroting op een fasecontrastmicroscoop.
  7. Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.
  8. Neem beelden van de wond sluiting op dezelfde gebieden als vóór.
  9. Hersteld de cellen vlek celkern, zoals beschreven in stappen 1.6 - 1.9 en visualiseren van de Td-tomaat signaal in de omgeving van de wond en de niet-wond gebied met behulp van 200 X vergroting op een fluorescentie Microscoop.
  10. Het percentage positieve cellen van de Td-tomaat in de wond en de niet-wond gebied met behulp van ImageJ software15te kwantificeren.

5. in Vitro Luciferase Assay

  1. Bereid een celsuspensie van 3-5 x 104 MDA-MB-231 cellen in 1 mL van DMEM media met 5% FBS.
  2. Infecteren celsuspensie met 2,5 μL van Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Zaad de geïnfecteerde cellen een 96 plaat goed op 3.000 cellen/100 µL per putje.
  4. Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.
  5. Verwijder oude media uit putten en vervang door 100 µL van vers 5% FBS media met of zonder 0.1 μL van TGF-β per putje (1 mg/mL op voorraad, 1 ng/μL als de uiteindelijke concentratie) en in de aanwezigheid of afwezigheid van 0,17 μL van TGF-β-remmer per putje (7 mg/mL op voorraad 12 ng/μL als eindconcentratie) (een roman TGF-β ligand trap proteïne, Chen et al., ongepubliceerd werk).
  6. Plaats de plaat in de incubator bij 37 ° C met 10% CO2 gedurende 24 uur.
  7. Het luciferase assay systeem substraat ontdooien en bereiden 1 x cel cultuur lysis reagens in dubbel gedestilleerd water (DDW).
  8. Media verwijderen van de 96-wells en lyse putjes met 50 μl van 1 x cel cultuur lysis buffer op ijs een roteerschudapparaat met zachte agitatie voor 30 min.
  9. 30 μL van lysate van elk putje overboeken naar een ondoorzichtige luciferase plaat en laat de plaat opwarmen tot kamertemperatuur.
  10. Maak op de luminometer-software, een nieuw protocol. Selecteer voor 1 injector met metingen vóór en na de injectie. Metingen vóór injectie vastgesteldop 1 s voor zowel de vertraging bij de meting en de Tijd van de integratie. Voor na injectie meting, zet het Geïnjecteerde Volume aan 40 µL met een vertraging bij de meting van 1 s na injectie en 5 s Integratie tijd. Bevestig de instellingen door te kiezen voor OK.
  11. Plaats de buis injector in DDW en klik op de knop van de Injector 1 onder de Prime instellingen de injector buis vóór gebruik schoon te maken. Vervolgens verwijdert de injector buis van de plaats in de lucht gevolgd door twee verdere priemgetallen voor injector 1 voor het spoelen van alle oplossing uit buis en DDW. Plaats de buis injector in Firefly substraat en opnieuw Prime tweemaal te bereiden van het substraat.
  12. Plaats de ondoorzichtige luciferase plaat met de monsters in de luminometer en selecteer Opties op de software. Markeer de putten van belang en klik op toepassen. Druk op Start om te meten luciferase signaal.
  13. Als metingen voltooid zijn, verwijderen en de plaat met water spoelen. Herstel eventuele resterende substraat naar de injector buis door het plaatsen van de buis in de lucht en Prime injector 1 terug in firefly substraat buis. Plaats de buis injector in DDW en het uitvoeren van twee verdere priemgetallen om de buis van de injector van eventuele resterende substraat schoon te maken.

6. cel voorbereiding Live signalering Imaging In Vivo

  1. 48 uur vóór de tumor implantatie, seed 2-3 x 106 MDA-MB-231 cellen in 175 cm2 flacons (10 kolven in totaal). Cultuur van cellen in 20 mL van DMEM media met 5% FBS bij 37 ° C, 10% CO2.
  2. 24 h later toevoegen 300 μL van Ad-CAGA12- Luc (titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) in elke kolf. Houd cellen cultuur voor een andere 24 h.
  3. Op de dag van implantatie, verwijderen van de oude media en wassen van het adenovirus besmette cellen eenmaal met 20 mL PBS, pH 7.4. Voeg toe 2 mL trypsine-EDTA 0,05% in de kolf en schud de kolf lichtjes zodat trypsine ter dekking van alle het oppervlak van de kolf. Plaats de kolf in de incubator 37 ° C, 10% CO2 voor 3 min.
  4. Doven de trypsine door toevoeging van 8 mL FBS-bevattende DMEM media in kolven. Breng alle cel schorsingen in een fles van de reagens.
  5. Tellen van het nummer van de cel met behulp van een hemocytometer en overbrengen van 4.8 x 107 cellen in twee 50 ml centrifuge buizen.
  6. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 min op RT verwijderen trypsine en resuspendeer de cellen in 720 mL verse FBS-DMEM media.
  7. Breng de schorsingen van de cel in een tube steriele 5 mL en voeg 160 l Matrigel (10% totale matrigel schorsing).
  8. Houden cellen op ijs totdat de implantatie.

7. Orthotopic implantatie

  1. Weeg 12 SCID muizen en willekeurig toewijzen van muizen in de behandelde en controlegroepen (6 muizen/group).
  2. Voer de inplanting in een steriele bio-kast te handhaven van een steriele omgeving. Anaesthetize de muis 2,5-4,5% Isofluraan met een debiet van de zuurstof van 1 L/min. plaats de muis op een warmte pad en afzien van een druppel smeren oog zalf op beide ogen om hoornvlies schade te voorkomen. Fix de muis naar de warmte pad in een liggende positie, terwijl behoud van anesthesie door het plaatsen van de snuit in een neus kegel met de Isofluraan verbonden.
  3. Bevestig het succes van anesthesie door het gebrek aan reactie tot teen snuifje. Isofluraan reduceren tot een onderhoudsdosis van 1,5 tot 2,5% met 1 L/min zuurstof voor de herinnering van implantatie.
  4. Reinig de huid van de vierde tepel aan beide zijden aan de middellijn met behulp van het wattenstaafje gedoopt in 80% ethanol.
  5. Vinden van de 4th borstklier vet pad door middel van palpatie en knijp het vet pad om verder het weefsel bloot te stellen.
  6. Meng de celsuspensie goed door pipetteren omhoog en omlaag. Zachtjes 50 µL van het mengsel van de cel gecombineerd in een 27G insuline spuit en injecteren in de borstklier vet pad aan weerszijden van de muis.
  7. Bevestig een succesvolle injectie door gevoel voor de zwelling van het vet pad. Laat het vet pad zachtjes en plaatst u de muisaanwijzer weer in de kooi.
  8. Laat de kooien op de warmte pad voor minstens 30 min om de muizen te winnen van bewustzijn en plaatst u vervolgens de kooien terug in het bedrijf ruimte voor 3 dagen.

8. IVIS Imaging

  1. De Living Image software niet openen.
  2. Initialiseer het systeem van de IVIS door te klikken op de knop Initialiseren IVIS systeem op het Configuratiescherm. Wacht tot de temperatuur teken groen.
  3. Selecteer de verlichtend Imaging modus op het bedieningspaneel.
  4. Inschakelen van Isofluraan anesthesie aan de kamer en de IVIS systeem.
  5. Anaesthetize de muizen met behulp van 2,5-4,5% Isofluraan met 1 L/min zuurstof. Eenmaal verdoofde, set Isofluraan op 1,5 tot 2,5% voor onderhoud. 150 mg/kg lichaamsgewicht van D-luciferine injecteren met muizen door intraperitoneaal (i.p.) injectie.
  6. Onmiddellijk overdracht muizen in het IVIS systeem, plaats ze op de temperatuurgevoelig imaging platform en plaatsen hun neus in de neus.
  7. Klik op de knop Reeks instellingen op het control panel en selecteer Medium weggooien.
  8. De imaging belichtingstijd als volgt instellen: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s 120 s. Start ongeveer 3 min na de injectie luciferine imaging en blijven beeld tot het signaal begint te dalen (normaal gesproken duurt dit ongeveer 20 min).
  9. De muizen uit de IVIS verwijderen met behoud van Isofluraan verdoving via een neus kegel en behandelen van de muizen met 50 µL PBS of 50 µL TGF-β signalering remmer (50 μg/tumor) via intra-tumor injectie.
  10. Zet de muizen terug in de kooi en laat ze op de warmte pad voor minstens 30 min. Plaats dan de kooi terug in de kamer van het bedrijf.
  11. IVIS imaging procedure zoals beschreven hierboven de dag na de behandeling herhalen.

9. de gegevensanalyse

  1. Open bestanden opgeslagen in Levende beeld software.
  2. Vinden van de beeldinformatie met weergave | Beeldinformatie.
  3. Selecteer foto's genomen op een gelijkaardig punt van de tijd met de dezelfde blootstellingstijd. Foto's laden als een groep.
  4. Uncheck de afzonderlijke doos in het Image aanpassen aan het normaliseren van de intensiteit.
  5. Foton -kiezen voor het analyseren van de intensiteit. Kwantificeren van de intensiteit van het signaal door de Regio van belang (ROI) knop in ROI Tools.
  6. Sleep de ROI cirkel naar de regio met de bioluminescente signaal en klikt u op de knop van de maatregel om te verwerven van de signaalsterkte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Levende eencellige beeldvorming in vitro

Om te nauwkeurig beoordelen de activering van TGF-β/Smad signalering in afzonderlijke cellen met behulp van adenovirus gebaseerd reagentia, is het belangrijk om eerst de optimale multipliciteit van infectie (MOI) voor elke regel van de cel. De optimale MOI wordt bepaald wanneer 100% van de cellen positief voor adenovirale infectie met geen huidige cytopathogeen of cytotoxische effecten zijn. Om te bepalen dit, we gebruikten een constitutively actieve Ad-CMV-Td-Tom verslaggever dat gehandeld als een marker van positieve infectie. Het percentage adenovirus geïnfecteerde cellen werd verhoogd in een MOI afhankelijke wijze van 0 tot 5.000 MOI. We hebben vastgesteld bij 2.500 MOI, 100% Td-Tom expressie in MDA-MB-231 cellen (figuur 1A, 1B). Pixel intensiteit/cel ook verhoogd met de MOI, verbeterde gevoeligheid en detectie van transcriptionele output (Figuur 1 c). Daarom werd een werkende MOI van 2.500 gebruikt voor het uitvoeren van een dubbele infectie waar cellen waren besmet met Ad-CMV-GFP (diende als positieve controle voor cel infectie) en Ad-CAGA12-Td-Tom gelijktijdig. Afzonderlijke cellen gepresenteerd verschillende niveaus van Td-Tom expressie die aangeeft van heterogene activering van TGF-β/Smad3 transcriptie over cellen in zowel live als vaste cellen. (Figuur 2A, 2B). 100% van MDA-MB-231-cellen gepresenteerd met GFP expressie, terwijl slechts ongeveer 26% van de cellen detecteerbare TGF-β/Smad3 transcriptionele activiteit 24u na TGF-β stimulatie weergegeven, in vergelijking met 0% positiviteit zonder TGF-β behandeling (figuur 2C). Als u het adenovirus gebaseerd reagens activiteiten te onderzoeken de TGF-β/Smad3 transcriptionele tijdens biologische processen waren, MDA-MB-231 cellen besmet met Ad-CAGA12-Td-Tom op 2500 MOI en onderworpen aan een wond genezing assay. Geïnfecteerde cellen van MDA-MB-231 tentoongesteld normale migratie gedrag en cellen behandeld met 5 ng/mL TGF-β toonde verbeterde wond sluiting in vergelijking met niet-TGF-β behandelde cellen (figuur 3A). Met name, ongeveer 62% cellen in het wond gebied presenteerde positieve TGF-β/Smad3 transcriptionele activiteit, die aanzienlijk hoger is dan de waargenomen in niet-wond gebied (32%) na TGF-β behandeling (figuur3B). Het adenovirus gebaseerde reagentia gevalideerd als zodanig, hun toepassing voor beeldvorming van de signalering TGF-β-traject in levende eencellige in vitro.

TGF-β signalering imaging in vivo wonen

De gevoeligheid van de Ad-CAGA12- Luc -verslaggever was eerste getest in vitro in reactie op TGF-β stimulatie en de aanwezigheid van een TGF-β-remmer. Wanneer geïnfecteerde MDA-MB-231 cellen werden gestimuleerd met 1 ng/mL TGF-β, luciferase verslaggever activiteit steeg 1,200-fold ten opzichte van basale onbehandelde MDA-MB-231 niveaus. Deze reactie was opmerkelijk geblokkeerd door 12 µg/mL TGF-β-remmer (figuur 4A). De Ad-CAGA12- Luc reagens werd vervolgens getest in een borst tumor orthotopic implantatie diermodel. Zowel controle als de TGF-β-remmer behandelde groepen aantoonbare soortgelijke luciferase verslaggever activiteit vóór de behandeling. Echter, voor de controlegroep, het signaal luciferase veranderde niet na PBS behandeling, overwegende dat muizen behandeld met de TGF-β-remmer rond 3-voudig signaal vermindering (figuur 4B, 4 C). Deze resultaten tonen gezamenlijk aan het potentieel voor live en real-time monitoring van TGF-β signalering activiteit in vivo zonder de behoefte aan dierlijke offer.

Figure 1
Figuur 1. Bepaling van de MOI adenovirus gebaseerde reagens. MDA-MB-231 cellen waren besmet met Ad-CMV-Td-Tom op verschillende MOI en zaadjes in een 12 wells-plaat. 24u na infectie, cellen werden vastgesteld en nucleaire gekleurd door Hoechst. (A) beelden werden genomen om te visualiseren Td-Tom positieve cellen (rood) en de kern (blauw) en gekwantificeerd door ImageJ. (B) Percentage van Td-Tom positieve cellen. (C) Td-Tom pixel intensiteit/cel genormaliseerd naar achtergrond. Deze cijfers zijn representatief voor ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Gegevens worden weergegeven zijn middelen van triplicates ± SD. schaal bar = 50 µm (200 X). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Eencellige imaging voor dubbele infectie. MDA-MB-231 cellen waren dual besmet met Ad-CMV-GFP en Ad-CAGA12-Td-Tom op MOI (2.500) en zaadjes in een 12 wells-plaat. 24 uur na infectie, cellen met of zonder 5 ng/mL TGF-β werden behandeld. (A) 24 h na de behandeling, cellen werden live beeld om te visualiseren GFP positief (groen) en Td-Tom positieve (rood) cellen. Cellen werden vervolgens vast en nucleaire gekleurd door Hoechst voor kwantificering. (B) beelden werden genomen om te visualiseren GFP positief (groen), Td-Tom positieve (rood) cellen en kern (blauw). (C) het GFP- of Td-Tom positieve cellen werden gekwantificeerd door ImageJ en het percentage positieve cellen werd berekend. Deze cijfers zijn representatief voor ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Gegevens worden weergegeven zijn middelen van triplicates ± SD. statistische significantie werd bepaald door de Student t-test (*** p ≤0.0001). Schaal bar = 50 µm (200 X). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3. Cel migratie levende cel TGF-β signalering bevordert. MDA-MB-231 cellen waren besmet met Ad-CAGA12-Td-Tom op MOI (2.500) en zaadjes op een bord 6 wells. 24u na infectie, cellen werden gekrast een wond maken met behulp van een P200 pipette uiteinde en media vervangen met of zonder 5 ng/mL TGF-β. Na een andere 24 h, cellen werden vastgesteld en nucleaire gekleurd door Hoechst voor visuele representatie. (A) fase contrast van wond sluiting, schaal bar = 100 µm (100 X). (B) Td-Tom positieve (rood) cellen en kern (blauw). Schaal bar = 50 µm (200 X) (C) Td-Tom positieve cellen werden gekwantificeerd door ImageJ en het percentage positieve cellen werd berekend. Deze cijfers zijn representatief voor ten minste 3 onafhankelijke experimenten. Gegevens worden weergegeven zijn middelen van triplicates ± SD. statistische significantie werd bepaald door de Student t-test (*** p ≤0.0001). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. In vivo wonen TGF-β signalering imaging. (A) MDA-MB-231 cellen besmet waren met Ad-CAGA12- Luc en vervolgens in 96-wells-plaat voor 24u agarvoedingsbodem. Daarna werden cellen behandeld met of zonder 1 ng/mL TGF-β in de aan- of afwezigheid van 12 µg/mL TGF-β-remmer 's nachts. De luciferase activiteit werd gemeten op basis van de gehele cel lysate. Luciferase activiteiten werden gepresenteerd als de vouw van inductie genormaliseerd naar geen controle behandeling. Gegevens worden weergegeven zijn middelen van triplicates ± SD. (B) MDA-MB-231 cellen met besmet waren Ad-CAGA12- Luc 24 h vóór implantatie. Cellen werden ingeplant borstklier vet pad aan weerszijden van de SCID muizen. 72 h later IVIS imaging werd uitgevoerd vóór en na 24 h behandeling (PBS voor controlegroep) en 50 µg/tumor TGF-β-remmer voor de behandelde groep. (C) Photon flux werd gekwantificeerd door levende beeld software. Gegevens worden weergegeven zijn middelen van elke behandeling groep (n = 12) ± SD. statistische significantie werd bepaald door de Student t-test (** p ≤0.01, *** p ≤0.0001). p/s verwijst naar fotonen/s. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hebben we een techniek om te voorzien in real-time beeldvorming van TGF-β/Smad3 signalering in één levende cellen. Met deze nieuwe methode hebben we eerder een subpopulatie van cellen geïdentificeerd met dynamische TGF-β/Smad3 transcriptionele activiteit die werd geassocieerd met verbeterde invasie en migratie8. Deze methode verbetert op traditionele testen voor TGF-β signalering, zoals westelijke vlekken van Smad3 fosforylatie en TGF-β gerichte genexpressie, door het vastleggen van de heterogeniteit van TGF-β/Smad3 signalering binnen de bevolking van de tumor en het benadrukken van de belang van één celbiologie. Bovendien, alternatieve methodes van eencellige imaging zoals nucleaire translocatie kunnen tijdrovend en duur als uitgevoerd levende cellen en kunnen niet altijd wordt omgezet naar gene transcriptie16,17. Deze methoden zijn belangrijk voor het onderzoeken van de upstream trajecten van signaaltransductie, biedt het adenovirus verslaggever systeem een uniek perspectief op TGF-β/Smad3 signalering in afzonderlijke cellen in verband met de biologische functie.

Aanzienlijk, onze methode biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor in vivo detectie van het leertraject TGF-β/Smad3 signalering in real-time tijdens de progressie van de tumor en behandeling. Vergelijkbaar met traditionele stabiele luciferase in vivo imaging, detectie van TGF-β/Smad3 signalering binnen de muis is afhankelijk van het aantal cellen en niveau van promotor activiteit18. Terwijl subcutane weefsel weinig inmenging p.a. biedt, vermindert grotere diepte van cellen de gevoeligheid van signaal detectie. Het is mogelijk om uit te breiden van de methode voor gebruik in andere organen, zoals Long en bot, en andere vormen van kanker; signaal optimalisatie of ex vivo imaging wordt echter aanbevolen om de gevoeligheid die nodig zijn voor de kanker-model van belang.

Een bijkomend voordeel van het gebruik van het adenovirus verslaggever systeem is dat de toepassing waarschijnlijk uit te breiden tot analyse van meerdere signaalroutes gelijktijdig in levende cellen. In figuur 2A, we laten zien dat de MDA-MB-231 cellen kon worden transduced met 2 aparte adenovirus vectoren, CMV-GFP en CAGA-TOM. Deze dual-infectie systeem kan verder worden uitgebreid verslag van twee verschillende signaalroutes via zowel fluorescentie verslaggever eiwitten en luciferase verslaggevers (met behulp van Firefly en Guassia luciferase verslaggever eiwitten). Onze lab heeft bereikt gelijktijdige signalering van BMP/Smad1 en TGF-β/Smad3 signaalroutes in een aantal levende kanker cellijnen (gegevens niet worden weergegeven).

Adenovirus verslaggever systemen bieden een gemakkelijke en handige methode voor levende cellen beeldvorming van de signalering traject van TGF-β/Smad beide in vitro en in vivo. Dit systeem heeft duidelijke voordelen boven andere veelgebruikte verslaggever systemen. Ten eerste, adenovirus vectoren worden gerapporteerd onder de hoogste virale transductie werkzaamheid, waardoor ze een optimale systeem voor cellijnen die moeilijk te transduce19,20,21,22. Bovendien met huidige vooruitgang in virale technologieën, kunnen 'laf' adenovirus vectoren worden gegenereerd door het verwijderen van de meeste van het virale genoom waardoor verhoogde exogene DNA capaciteit23. In vergelijking met niet-virale afgiftesystemen vertegenwoordigen adenovirus vectoren een kosteneffectieve, snelle en gemakkelijke applicatie voor cel transductie die tot veel grotere levering efficiëntie19,20,21 leidt ,22.

Dit protocol maakt gebruik van een tweede generatie adenovirus expressie systeem, dat replicatie-incompetent in zoogdiercellen die niet uitdrukking aan de E1a en E1b eiwitten geven doen, het minimaliseren van bioveiligheid risico24. Echter, ondanks deze verbeterde bioveiligheid functies, adenovirus deeltjes kunnen nog steeds transduce primaire menselijke cellen met hoge doeltreffendheid25,26. US Biosafety Level 2 en indamming van adenovirale vectoren wordt aanbevolen als behandeling en verwijdering van adenovirus besmet materiaal. Grootschalige versterking van adenovirus in HEK293A cellen kan resulteren in een zeldzame genereren van replicatie-bevoegde "wild-type" adenovirus27. PCR screening moet worden uitgevoerd om het identificeren van wild-type verontreiniging27.

Replicatie-incompetente adenovirus vectoren in expressie van voorbijgaande aard zijn en niet opnemen met host DNA20,21. Het wordt aanbevolen dat de experimentator identificeren de stabiliteit in de uitdrukking van hun verslaggever eiwit bij het gebruik van het adenovirus verslaggever systeem te bevestigen van de geldigheid van de experimenten op lange termijn. De tijd van de expressie van het adenovirus vector binnen een cel is evenredig aan de tijd van de afdeling van de cel en virale MOI. Om ervoor te zorgen reproduceerbare resultaten, is het essentieel dat de virale titer is nauwkeurig bepaald voor elke virale partij. Bovendien, buitensporig hoge volumes van het adenovirus kunnen leiden tot cytotoxische of cytopathogeen effect en het is belangrijk dat een optimale MOI is empirisch bepaald voor elke cel in een rij gebruikt om de beste resultaten. Verder, in vivo gebruik van vectoren van het adenovirus kan veroorzaken immuunrespons op; waar de immune reactie is niet de primaire observatie van het experiment, worden immuun-gecompromitteerd dieren aanbevolen20,21. Extra kwaliteitscontrole is vereist bij het gebruik van de adenovirale vectoren aan target immuunresponsen, hoewel het gebruik van het adenovirus is gevalideerd als adjuvans vaccin therapieën28,29.

Het adenovirus verslaggever systeem kan worden gebruikt op een brede waaier van primaire en gekweekte cellijnen van zowel verdelen en niet-delende natuur20,22. Met behulp van het adenovirus verslaggever systeem, wij hebben bereikt 100% infectie tarieven in een aantal kanker cellijnen, met inbegrip van hersenen, borstkanker, colorectale als goed primaire muis embryologische Fibroblast (MEF) en Canine Kidney epitheliale (MDCK) cellen. Bovendien kunnen adenovirale vectoren verder worden aangepast voor het verhogen van de affiniteit voor celtype specifieke receptoren, verbeterde orgel doelgerichtheid en doeltreffendheid te voorzien van signaaltransductie30,31.

Toepassingen van deze methode kunnen worden uitgebreid tot andere signaalroutes en cel hosts. De belangrijkste voordelen van het systeem adenovirale verslaggever omvatten de werkzaamheid van de goedkope, hoge signaaltransductie, snelle experimentele opzet en gebrek aan integratie met host DNA21,32. Deze methode kan worden toegepast op vele huidige testen en in vivo modellen, waaronder bij de beoordeling van nieuwe gerichte therapieën33. Wij hopen dat het gebruik van deze techniek zal ons begrip van de relatie tussen signalering trajecten en biologische processen die leiden tot nieuwe biologische ontdekkingen en de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) aan H-JZ. TMBW is een ontvanger van een Australia postdoctorale Award van de Australische overheid en de Ann Henderson oplaadbeurt beurs van Australische Rotary gezondheid in partner met Rotary van hoorn en Dine voor een kuur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).

Tags

Kankeronderzoek kwestie 137 TGF-β live cel beeldvorming adenovirus cel signalering borst kanker Smad3 transcriptionele activering
Live cel beeldvorming van de TGF-β/Smad3 signalering traject <em>In Vitro</em> en <em>In Vivo</em> met behulp van een Adenovirus verslaggever systeem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., … More

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter