Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System

Published: July 30, 2018 doi: 10.3791/57926
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Surgery (RMH), University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das live Cell Imaging von TGF-β/Smad3 Signalisierung Aktivität mit einem Adenovirus-Reporter-System. Dieses System verfolgt transkriptionelle Aktivität in Echtzeit und kann angewendet werden, um sowohl einzelne Zellen in Vitro und in lebenden TierenModelle.

Abstract

Transforming Growth Factor β (TGF-β) Signalisierung regelt viele wichtige Funktionen, die für die zelluläre Homöostase erforderlich und wird im allgemeinen gefunden in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs überexprimiert. TGF-β ist stark in Metastasen während späten Stadium Krebs Fortschreiten, impliziert eine Teilmenge der Zugvögel und invasive Tumorzellen zu aktivieren. Aktuelle Methoden zur Signalisierung Pathway Analyse konzentrieren sich auf Endpunkt-Modelle, die oft versuchen, Signalisierung Post-hoc- des biologischen Ereignisses zu messen und spiegeln nicht die progressive Natur der Krankheit. Hier zeigen wir eine neuartige Adenovirus Reporter System speziell für die TGF-β/Smad3 Signalweg, die transkriptionelle Aktivierung in lebenden Zellen erkennen kann. Mit Hilfe eines Ad-CAGA12-Td-Tom -Reporter, erreichen wir eine 100 %-Infektionsrate von MDA-MB-231 Zellen innerhalb von 24 h in Vitro. Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter ermöglicht für die Darstellung von live Einzelzellen in Echtzeit mit direkten Identifizierung von transcriptionally aktiven Zellen. Stimulation der infizierten Zellen mit TGF-β zeigt nur einen Teil der Zellen, die transcriptionally aktiv und spezifischen biologischen Funktionen beteiligt sind. Dieser Ansatz ermöglicht hohe Spezifität und Sensitivität auf eine einzelne Zellenebene das Verständnis biologischer Funktionen im Zusammenhang mit TGF-β Signalisierung in Vitrozu fördern. Smad3 transkriptionelle Aktivität auch kann berichtet in Vivo in Echtzeit durch die Anwendung eine Ad-CAGA12- Luc Reporter. Ad-CAGA12- Luc in der gleichen Weise wie herkömmliche stabil transfizierten Luciferase-Zell-Linien gemessen werden. Smad3 transkriptionelle Aktivität der implantierten Zellen in Vivo werden durch konventionelle IVIS Bildgebung analysiert und live während der Tumorprogression, einzigartige Einblicke in die Dynamik der TGF-β-Signalweg überwacht. Unser Protokoll beschreibt eine vorteilhafte Reporter-Delivery-System ermöglicht schnelle Hochdurchsatz-Bildgebung live Zelle Signalwege in Vitro und in Vivo. Diese Methode kann zu einer Reihe von bildbasierte Assays und Geschenke als sensibel und reproduzierbare Ansatz für grundlegende Biologie und therapeutische Entwicklung erweitert werden.

Introduction

Transforming Growth Factor β (TGF-β) ist eine wesentliche Zytokin verwickelt in der menschlichen Entwicklung, das signalisiert durch ein heterodimerisierenden Komplex bestehend aus Typ II und Typ-I-Rezeptoren1. Bindung an II Rezeptor Typ Ergebnisse bei der Rekrutierung und Phosphorylierung von Typ I-Rezeptor, der wiederum nachgelagerten Smad2/3 Proteine2,3phosphorylates. Diese aktiviert Smad2/3 Proteine binden an Smad4, bilden einen Komplex, der translocates in den Zellkern und reguliert gen Transkription4. Homöostatische Bedingungen TGF-β/Smad-Signalisierung ist streng reguliert; jedoch bei vielen Krankheiten der Signalweg ist dereguliert und häufig überexprimiert führende bis zum Fortschreiten der Erkrankung5,6,7. Jüngste Studien haben gezeigt, dass zelluläre Reaktion, TGF-β heterogen ist und Subpopulationen von TGF-β/Smad aktiven Zellen verantwortlich für die biologische Funktion in einem Zeit-abhängigen Weise8,9 sind. Gemeinsame zelluläre Analyse der TGF-β/Smad-Signal beinhaltet die Verwendung von festen Endpunkt-Assays, die bieten nur einer Momentaufnahme der Zellaktivität und oft quantitate die durchschnittliche TGF-β/Smad-Effekt10. Diese Methoden können jedoch nicht genau die molekulare Verhalten der TGF-β/Smad-Signal in den physiologischen Zustand während der Progression der Erkrankung darstellen. Image-basierte Analyse von lebenden Zellen erfassen die Dynamik zellulärer und biologische Prozesse mit einem räumlichen und zeitlichen Verständnis.

Unser Ziel war es, eine empfindliche Hochdurchsatz-Methode für das live Cell Imaging der TGF-β/Smad Signalisierung mit Adenovirus-basierte Reagenzien zu entwickeln. Hier infiziert wir die menschliche Brust-Krebs-Zell-Linie MDA-MB-231 mit ein Adenovirus auszudrücken Smad3 CAGA Motiv Bindung Sequenz und eine Luciferase (Luc) oder Td-Tomate (Td-Tom) Reporter-gen. Adenoviralen Reporter-Systeme bieten eine schnelle und billige Methode für Plasmid-Einführung, die eine 100 %-Infektionsrate in Krebs-Zell-Linien führen können. Adenoviralen Reporter Systeme wurden auch erfolgreich auf Zell-Linien angewendet, die schwer mit herkömmlichen Plasmid11transfizieren sind. In diesem Protokoll beschreiben wir ein reproduzierbar und nicht-invasive Verfahren zur live Cell Imaging von TGFβ/Smad-Signalweg zu erreichen in Vivo und in Vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von der University of Melbourne-Tier-Ethik-Kommission genehmigt.

Hinweis: Die Sequenz, Bau und Generation Protokoll für die adenovirale Vektoren pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP und pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom schon zuvor beschriebenen11,12, 13. Alle Vektoren sind im Handel erhältlich.

1. Virus-Titer-Bestimmung mit 50 % Gewebekultur infektiöse Dosis (TCID50)

  1. Bereiten Sie 1 x 106 HEK293A Zellen in 10 mL DMEM + 10 % FBS Medien.
  2. Samen Sie 100 µL Zellsuspension in jede Vertiefung eine 96-Well flach-Boden Zellplatte Kultur.
  3. Bereiten Sie 1 mL einer 1: 100 Verdünnung des Virus bestand im kompletten Medium. Geben Sie 11 µL verdünnter Virus in jeder Spalte 1.
  4. 10-divisibel Verdünnungsreihen direkt in den 96-well-Platte ausführen, indem 11 µL verdünnter Virus mit 100 µL Zellsuspension mischen, bis eine endgültige Verdünnung von 1 X1012 erreicht ist. Obwohl nicht-anhaftende Zellen zu diesem Zeitpunkt, die Anzahl der Zellen übertragen zwischen Brunnen bleibt konstant.
  5. Pipette 11 µL jeder Verdünnung in jeder Spalte, beginnend mit der höchsten Verdünnung von 104. Ersetzen Sie Pipettenspitzen mit jeder Verdünnung, Cross-Over aus Viruspartikel zu begrenzen.
  6. Spalte 12 11 µL virenfrei komplette Medien als Negativkontrolle hinzufügen.
  7. 7-10 Tage bei 37 ° C mit 10 % CO2inkubieren Sie Platte.
  8. Zählen Sie unter Verwendung eines Mikroskops, die Anzahl der Bohrungen in jeder Spalte zeigt Anzeichen von zytopathischen oder zytotoxischen Wirkungen. Betrachten Sie eine sehr Positive, wenn Anzeichen einer Infektion vorhanden ist.
  9. Den Anteil der positiven Vertiefungen für jede Verdünnung mit Reed und Münch (1938) statistische Methode14zu berechnen.
  10. Berechnung der proportionalen Abstand (PD) mit: (A-50)/(A-B), wo A ist der Prozentsatz Antwort oben oder gleich 50 % und B reagiert die Prozentsatz unter 50 %.
  11. TCID50 mit zu berechnen: 10X-PD, wo X ist die Verdünnung eine Antwort größer als 50 %.
  12. Virale Titer von den folgenden berechnen: 0,69 / (0,011 X TCID50) PFU/mL

(2) Adenovirus-MOI-Bestimmung

  1. Samen 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 500 μL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung einer 12 gut Platte (35 % Zelle Konfluenz, 6 Brunnen insgesamt).
  2. Berechnen Sie die Volumen der Ad-CMV-Td-Tom Lager benötigt für 0, 250, 500, 2500 und 5000 MOI folgende Formel verwenden: MOI = (Volumen [μl] x PFU/μL) / Anzahl der Zellen. Für Ad-CMV-Td-Tom mit einem Titer von 1 x 1010 (PFU/mL), das Volumen der Virus-Infektion sind erforderliche MOIs 0, 3,75, 7,5, 37,5 und 75 μl.
  3. Pipettieren virale Lager direkt in die Vertiefungen mit guten Durchmischung, um die Zellen die berechneten Mengen an Ad-CMV-Td-Tom in Abschnitt 2.2 zu infizieren.
  4. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.
  5. Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und sofort behoben Sie werden die Zellen mit 500 μl 10 % Formalin für 5 Minuten.
  6. Aspirieren Sie Formalin aus Brunnen und waschen Sie Brunnen mit 500 μl PBS einmal.
  7. Führen Sie der Zellkern mit 500 μL der Hoechst-Lösung für 5 min zu Flecken.
  8. Entfernen Sie die Hoechst-Lösung und waschen Sie die Brunnen mit 500 μl PBS 3 Mal.
  9. Bild das Td-Tomate-Protein und Zellkern signalisieren mit 200 X Vergrößerung auf dem Fluoreszenzmikroskop. Td-Tomate-Proteins an 554 begeistern nm und der Hoechst-Farbstoff auf 352 nm.
  10. Analysieren von Bildern mit ImageJ um die Arbeiten zu bestimmen, die, das Moi für 100 % Infektion von Td-Tomaten15erforderlich.

3. Dual-Adenovirus Transduktion in Live Einzelzellen

  1. Samen 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 500 μL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung einer 12 gut Platte (35 % Zelle Konfluenz, 2 Brunnen insgesamt).
  2. Zellen mit 75 μL der Ad-CMV-GLP infizieren (Titer = 5 x 109 PFU/mL) und 7,5 μl des Ad-CAGA12-Td-Tom (Titer = 5 x 1010 PFU/mL), eine 2.500 MOI 100 % Infektion Positivität erreichen zu erwirken.
  3. Zellen mit oder ohne 0,25 μl der TGF-β pro Bohrloch (10 mg/mL auf Lager, 5 ng/μl als die Endkonzentration) unmittelbar nach der Adenovirus-Infektion zu behandeln.
  4. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.
  5. Bild lebenden Zellen mit Phase Kontrast Fluoreszenzmikroskop. Excite GFP bei 470 nm und Td-Tomate-Proteins an 554 nm.
  6. Beheben Sie Zellen zu und Flecken Sie Zellkern beschriebenen Schritte 1.6 - 1.9.
  7. Bild das Td-Tomate-Protein und Hoechst färben mit einem Fluoreszenzmikroskop. Begeistern die Hoechst-Farbstoff auf 352 nm.
  8. Verwendung von ImageJ, berechnen Sie der Prozentsatz der GFP und Td-Tomate positiven15Zellen.

4. live einzelne Zelle Signalisierung Wundheilung im Test

  1. Samen 4 bis 5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 1 mL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung eines 6 gut Platte (50 % Zelle Konfluenz, 2 Brunnen insgesamt).
  2. Die Zellen mit 22,5 μL des Ad-CAGA12-Td-Tom infizieren (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.
  4. Kratzen Sie zwei gekreuzte Linien auf der Zellschicht von jedem Bohrloch mit einer PIPETTENSPITZE P200.
  5. Die alten Medien vom Brunnen entfernen und ersetzen mit 2 mL frische 5 % FBS Medien mit oder ohne 0,5 μL der TGF-β pro Bohrloch (10 mg/mL auf Lager, 5 ng/μl als Endkonzentration).
  6. Die Platte im Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 5 min und nehmen Sie Bilder von ausgewählten Wunde Bereiche mit 100 X Vergrößerung auf dem Phase-Kontrast-Mikroskop.
  7. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.
  8. Nehmen Sie Bilder von den Wundverschluss an den gleichen Stellen wie vor.
  9. Beheben Sie die Zellen zu, Färben Sie Zellkern beschriebenen Schritte 1.6 - 1.9 und visualisieren Sie Td-Tomate-Signal in das wundgebiet und nicht wundbereich mit 200 X Vergrößerung auf ein Fluoreszenzmikroskop zu.
  10. Den Anteil der Td-Tomate positive Zellen in die Wunde und nicht-wundbereich mit ImageJ Software15zu quantifizieren.

5. in-vitro- Luciferase Assay

  1. Bereiten Sie eine Zellsuspension von 3-5 x 104 MDA-MB-231-Zellen in 1 mL DMEM Medium mit 5 % FBS.
  2. Infizieren Zellsuspension mit 2,5 μL des Ad-CAGA12- Luc (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).
  3. Samen der infizierten Zellen in einem 96 Platte auch bei 3.000 Zellen/100 µL/Well.
  4. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.
  5. Alte Medien aus Brunnen zu entfernen und ersetzen Sie durch 100 µL frische 5 % FBS Medien mit oder ohne 0,1 μL der TGF-β pro Bohrloch (1 mg/mL auf Lager, 1 ng/μl als die Endkonzentration) und das Vorhandensein oder Fehlen von 0,17 μL der TGF-β-Inhibitor pro Bohrloch (7 mg/mL auf Lager 12 ng/μl als Endkonzentration) (ein neuartiges TGF-β Liganden Falle Protein, Chen Et Al., unveröffentlichte Arbeit).
  6. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.
  7. Die Luciferase Assay System Substrat tauen Sie auf und bereiten Sie 1 X Zelle Kultur Lyse-Reagenz in doppelt destilliertem Wasser (DDW zu).
  8. Entfernen Sie Medien aus den 96 Brunnen und lösen Sie Brunnen mit 50 μL der 1 X Zelle Kultur Lyse Puffer auf Eis mit einem Orbitalschüttler mit sanften Agitation für 30 min.
  9. 30 μl der lysate aus jedem Brunnen in eine undurchsichtige Luciferase-Teller und die Platte auf Raumtemperatur erwärmen.
  10. Erstellen Sie auf dem Luminometer Software ein neues Protokoll. Wählen Sie für 1 Injektor mit Messungen vor und nach der Injektion. Messungen vor der Injektion auf 1 festgelegt s für Verzögerung bei der Messung und Integrationszeit. Für nach der Injektion Messung stellen Sie Injektionsvolumen 40 µL mit einer Verzögerung bei der Messung von 1 s nach der Injektion und 5 s Integrationszeit. Bestätigen Sie Einstellungen wählen Sie "OK".
  11. Legen Sie den Injektor-Schlauch in DDW und klicken Sie Injektor 1 unter den Prime -Einstellungen der Injektor Tube vor Gebrauch zu reinigen. Als nächstes Entfernen der Injektor-Röhre aus der DDW und in Luft, gefolgt von zwei weiteren Primzahlen des Injektors 1, all-Lösung aus der Tube zu spülen. Legen Sie den Injektor-Schlauch in Firefly Substrat und wieder Prime zweimal, um das Substrat zu bereiten.
  12. Legen Sie die undurchsichtige Luciferase-Platte mit den Proben in der Luminometer und wählen Sie Optionen der Software. Markieren Sie die Brunnen von Interesse und klicken Sie auf anwenden. Drücken Sie, um Luciferase Signal zu messen beginnen .
  13. Sobald Messungen abgeschlossen sind, abnehmen und die Platte mit Wasser ausspülen. Alle restlichen Substrat in den Injektor Rohr indem man das Rohr in die Luft und Prime Injektor 1 zurück in Firefly Substrat Rohr zu erholen. Legen Sie den Injektor-Schlauch in DDW und führen Sie zwei weitere Primzahlen um den Injektor Tube alle restlichen Substrat zu reinigen.

6. Zelle Vorbereitung für Live Signalisierung Bildgebung In Vivo

  1. 48 Stunden vor der Tumor-Implantation, Samen 2-3 x 106 MDA-MB-231-Zellen in 175 cm2 Fläschchen (10 Flaschen insgesamt). Kulturzellen in 20 mL DMEM Medium mit 5 % FBS bei 37 ° C, 10 % CO2.
  2. 24 h später hinzufügen 300 μL des Ad-CAGA12- Luc (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) in jedem Kolben. Halten Sie Zellen in der Kultur für ein weiteres 24 h.
  3. Am Tag der Implantation entfernen Sie die alten Medien und waschen Sie die Adenovirus infiziert Zellen einmal mit 20 mL PBS, pH 7.4. 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA in die Flasche und schütteln Sie die Flasche leicht um Trypsin, die Kolben Fläche zu ermöglichen. Legen Sie die Flasche in in den Inkubator 37 ° C, 10 % CO2 3 min.
  4. Die Trypsin durch Zugabe von 8 mL DMEM FBS-haltigen Medien in Fläschchen zu stillen. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen in einer Glasflasche Reagenz.
  5. Zählen der Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer und 4,8 x 107 Zellen in zwei 50 ml Zentrifuge Röhren zu übertragen.
  6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g für 5 min bei RT entfernen Trypsin und Aufschwemmen Zellen in 720 mL frische FBS-DMEM Medien.
  7. Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein steriles 5 mL Röhrchen geben und 160 μl Matrigel (10 % insgesamt Matrigel Suspension).
  8. Bewahren Sie Zellen auf Eis bis Implantation.

(7) Orthotopen Implantation

  1. Wiegen Sie 12 SCID Mäuse und nach dem Zufallsprinzip zuordnen Sie Mäuse in Behandlung und Eindämmung der Gruppen (6 Mäuse/Gruppe zu).
  2. Führen Sie die Implantation in einem sterilen Bio-Schrank in einer sterilen Umgebung halten. Betäuben Sie die Maus mit 2,5-4,5 % Isofluran mit einer Sauerstoff-Durchfluss von 1 L/min statt der Maus auf ein Heizkissen und Tropfen Sie ein schmieren Augensalbe auf beiden Augen Hornhaut Schaden zu vermeiden. Befestigen Sie die Maus, um das Wärmekissen in Rückenlage, während Anästhesie beibehalten, indem man die Schnauze in einem Prüfkopf mit der Isofluran verbunden.
  3. Bestätigen Sie den Erfolg der Anästhesie durch den Mangel an Reaktion bis zu den Zehen Prise. Reduzieren Sie Isofluran auf eine Erhaltungsdosis von 1,5 bis 2,5 % mit 1 L/min Sauerstoff für die Erinnerung der Implantation.
  4. Reinigen Sie die Haut aus der vierten Brustwarze auf beiden Seiten der Mittellinie mit dem Wattestäbchen zu 80 % Ethanol getaucht.
  5. Finden Sie 4th Mamma Fettpolster durch Abtasten zu, und drücken Sie die Fettpolster, die das Gewebe weiter aussetzen.
  6. Mischen Sie die Zellsuspension gut durch pipettieren rauf und runter. Sanft 50 µL der Zelle Mischung in eine 27G Insulin Spritze Aspirieren und injizieren in die Mamma Fettpolster auf beiden Seiten der Maus.
  7. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Injektion durch Abtasten Schwellung der Fettpolster. Lassen Sie die Fettpolster sanft und platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig.
  8. Lassen Sie die Käfige auf das Wärmekissen für mindestens 30 min um die Mäuse zu gewinnen Bewusstsein und legen Sie dann die Käfige zurück in die Holding-Zimmer für 3 Tage zu ermöglichen.

8. IVIS Imaging

  1. Öffnen Sie die Living Image -Software.
  2. Initialisieren Sie das IVIS System Initialisieren IVIS System klicken Sie auf das Control Panel. Warten Sie, bis die Temperatur Zeichen auf grün schaltet.
  3. Wählen Sie die lumineszierenden Imaging-Modus auf dem Bedienfeld.
  4. Isofluran-Narkose auf die Kammer und IVIS System einschalten.
  5. Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5-4,5 % Isofluran mit 1 L/min Sauerstoff. Einmal betäubt, Set Isofluran mit 1,5-2,5 % für die Wartung. Injizieren Sie 150 mg/kg Körpergewicht von D-Luciferin in Mäusen durch intraperitoneale (i.p.) Injektion.
  6. Sofortüberweisung Mäuse in das IVIS-System, legen Sie sie auf die temperaturgeführte imaging Plattform und platzieren Sie ihre Nase in die bugnase.
  7. Klicken Sie auf die Sequenz Setup -Taste auf dem Bedienfeld, und wählen Sie Medium Binning.
  8. Richten Sie die bildgebenden Belichtungszeit wie folgt: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s und 120 s. Beginn ca. 3 min nach der Injektion von Luciferin imaging und weiterhin Bild, bis das Signal zu fallen beginnt (normalerweise dauert dies ca. 20 min).
  9. Die Mäuse aus IVIS unter Beibehaltung Isofluran-Narkose durch eine Nase Kegel und behandeln Sie die Mäuse mit 50 µL PBS oder 50 µL TGF-β Signalisierung Inhibitor (50 μg/Tumor) mittels Intra-Tumor-Injektion zu.
  10. Legen Sie die Mäuse wieder in den Käfig und lassen Sie sie auf das Wärmekissen für mindestens 30 Minuten. Dann legen Sie den Käfig zurück in den Raum halten.
  11. IVIS bildgebende Verfahren, wie beschrieben, am Tag nach der Behandlung zu wiederholen.

9. die Datenanalyse

  1. Offene Dateien in Living Image -Software gespeichert.
  2. Finden Sie die Bildinformationen mit Ansicht | Bildinformationen.
  3. Wählen Sie Fotos zu einem ähnlichen Zeitpunkt mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. Laden Sie Fotos als Gruppe.
  4. Deaktivieren Sie das einzelne Feld im Bild anzupassen , um die Intensität zu normalisieren.
  5. Wählen Sie Photon -Modus, um die Intensität zu analysieren. Quantifizieren Sie die Intensität des Signals durch die Region von Interesse (ROI) -Schaltfläche im ROI-Tools.
  6. Ziehen Sie den ROI-Kreis in der Region, die biolumineszente Signal enthält und klicken Sie auf Messen , um die Signalstärke zu erwerben.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Einzelne Zelle in Vitro imaging zu leben

Um die Aktivierung von TGF-β/Smad-Signalisierung in Einzelzellen mit Adenoviren basierte Reagenzien genau zu beurteilen, ist es wichtig, zunächst die optimale Multiplizität der Infektion (MOI) für jede Zelllinie zu bestimmen. Die optimale MOI wird bestimmt, wenn 100 % der Zellen für adenovirale Infektion ohne vorliegende zytopathischen oder zytotoxische Effekte positiv sind. Um dies festzustellen, verwendeten wir einen konstitutiv aktiven Ad-CMV-Td-Tom -Reporter, die als Marker für positive Infektion gehandelt. Der Anteil der Adenovirus infiziert Zellen wurde gewissermaßen MOI abhängig von 0 bis 5.000 MOI erhöht. Bei 2.500 MOI beobachteten wir 100 % Td-Tom Ausdruck im MDA-MB-231 Zellen (Abb. 1A, 1 b). Pixel Intensität/Zelle erhöht auch mit MOI, bietet verbesserte Empfindlichkeit und Erkennung von transkriptionelle Ausgabe (Abbildung 1). Daher wurde eine funktionierende MOI von 2.500 verwendet, um eine dual-Infektion führen, wo Zellen mit Ad-CMV-GLP (diente als Positivkontrolle für Zelle Infektion) und Ad-CAGA12-Td-Tom gleichzeitig infiziert waren. Einzelne Zellen präsentiert unterschiedlicher Td-Tom Ausdruck heterogenen Aktivierung der TGF-β/Smad3 Transkription zellenübergreifend in Live- und festen Zellen anzeigt. (Abb. 2A, 2 b). 100 % der MDA-MB-231 Zellen präsentiert mit GFP Expression, während nur etwa 26 % der Zellen nachweisbar TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität 24 h nach der TGF-β-Stimulation, im Vergleich zu 0 % Positivität ohne TGF-β-Behandlung (Abbildung 2) angezeigt. Das Adenovirus basierte Reagenz verwenden, um die TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität während der biologischen Prozesse zu untersuchen, wurden MDA-MB-231 Zellen mit Ad-CAGA12-Td-Tom bei 2500 MOI infiziert und eine Wundheilung Assay. Infizierte Zellen von MDA-MB-231 ausgestellt normal Migrationsverhalten und Zellen mit 5 ng/mL TGF-β zeigte verbesserte Wundverschluss im Vergleich zu nicht-TGF-β behandelten Zellen (Abbildung 3A) behandelt. Bemerkenswert ist, präsentiert etwa 62 % Zellen in das wundgebiet positive TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität, die deutlich höher ist als in wundgebiet (32 %) nach der TGF-β-Behandlung (Abb.3 b) beobachtet. Als solche validiert die Adenovirus-basierte Reagenzien ihre Anwendung für die Bildgebung der TGF-β-Signalweg in live Einzelzelle in Vitro.

TGF-β signalisieren Bildgebung in Vivo zu leben

Die Empfindlichkeit der Anzeige-CAGA12- Luc -Reporter war erste getestete in-vitro- als Reaktion auf die TGF-β-Stimulation und die Anwesenheit von TGF-β-Inhibitor. Wenn infizierte Zellen von MDA-MB-231 mit 1 ng/mL TGF-β stimuliert wurden, erhöhte Luciferase Reporter Aktivität 1,200-fold im Vergleich zu den basalen unbehandelten MDA-MB-231-Ebenen. Diese Antwort wurde bemerkenswert durch 12 µg/mL von TGF-β-Inhibitor (Abb. 4A) blockiert. Die Ad-CAGA12- Luc Reagenz wurde anschließend in einer Brust Tumor orthotopen Implantation Tiermodell getestet. Kontrolle und der TGF-β-Inhibitor behandelt Gruppen demonstrierte ähnliche Luciferase Reporter Tätigkeit vor der Behandlung. Jedoch für die Kontrollgruppe änderte das Luciferase-Signal nach der PBS Behandlung sich nicht in der Erwägung, dass Mäuse mit der TGF-β-Inhibitor zeigte rund 3-fold Signal-Reduktion (Abbildung 4 b, 4 C) behandelt. Diese Ergebnisse zeigen gemeinsam das Potenzial für live und in Echtzeit Überwachung der TGF-β Signalisierung Aktivität in Vivo ohne Tieropfer.

Figure 1
Abbildung 1: Bestimmung des Innenministeriums der Adenovirus-basierte Reagenz. MDA-MB-231-Zellen wurden mit Ad-CMV-Td-Tom bei verschiedenen MOI infiziert und in eine Platte 12 Brunnen ausgesät. 24 h nach der Infektion, Zellen wurden behoben und nukleare befleckt von Hoechst. (A) Bilder wurden Td-Tom positive Zellen (rot) und Kern (blau) zu visualisieren und durch ImageJ quantifiziert. (B) Prozentsatz der Td-Tom positive Zellen. (C) Td-Tom Pixel Intensität/Zelle normiert auf Hintergrund. Diese Zahlen sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Angezeigten Daten sind Mittel von Triplicates ± SD Scale bar = 50 µm (200 X). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Einzelne Zelle Imaging für dual Infektion. MDA-MB-231-Zellen wurden dual, infiziert mit Ad-CMV-GFP und Ad-CAGA12-Td-Tom am MOI (2.500) und in eine Platte 12 Brunnen ausgesät. 24 h nach der Infektion Zellen wurden behandelt, mit oder ohne 5 ng/mL TGF-β. (A) 24 Stunden nach der Behandlung, Zellen wurden live abgebildet um GFP positiv (grün) und Td-Tom positiven (roten) Zellen zu visualisieren. Zellen wurden dann fixiert und nukleare befleckt von Hoechst zur Quantifizierung. (B) Bilder wurden zur GFP-positiven (grün), Td-Tom positiv (rot) Zellen und Kern (blau) zu visualisieren. (C) die GFP oder Td-Tom positive Zellen wurden von ImageJ quantifiziert und der Anteil der positiven Zellen berechnet. Diese Zahlen sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Angezeigten Daten sind Mittel von Triplicates ± SD statistische Bedeutung, indem der Student t-Test ermittelt wurden (*** p ≤0.0001). Maßstabsleiste = 50 µm (200 X). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Live Cell TGF-β-Signalisierung fördert die Zellmigration. MDA-MB-231 Zellen waren infiziert mit Ad-CAGA12-Td-Tom am MOI (2.500) und auf einen Teller 6 Brunnen ausgesät. 24 h nach der Infektion, Zellen wurden mit einer PIPETTENSPITZE P200 erstelle ich eine Wunde gekratzt und Medien ersetzt, mit oder ohne 5 ng/mL TGF-β. Nach einer anderen 24 h Zellen wurden behoben und nukleare befleckt von Hoechst zur visuellen Darstellung. (A) Phase Kontrast der Wundverschluss, Skala bar = 100 µm (100 X). (B) Td-Tom positiven (roten) Zellen und Kern (blau). Maßstabsleiste = 50 µm (200 X) (C) Td-Tom positive Zellen wurden von ImageJ quantifiziert und der Anteil der positiven Zellen berechnet wurde. Diese Zahlen sind repräsentativ für mindestens 3 unabhängige Experimente. Angezeigten Daten sind Mittel von Triplicates ± SD statistische Bedeutung, indem der Student t-Test ermittelt wurden (*** p ≤0.0001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4. In Vivo Leben Signalisierung Bildgebung TGF-β. (A) MDA-MB-231 Zellen infiziert waren, mit Ad-CAGA12- Luc und dann ausgesät in 96 Wells Platte für 24 h. Danach wurden Zellen mit oder ohne 1 ng/mL TGF-β in das Vorhandensein oder Fehlen von 12 µg/mL TGF-β-Hemmer über Nacht behandelt. Die Luciferase-Aktivität wurde auf die gesamte Zelle lysate gemessen. Als der Falte der Induktion auf keine Behandlungskontrolle normalisiert wurden Luciferase Aktivitäten vorgestellt. Angezeigten Daten sind Triplicates ± SD (B) MDA-MB-231 Zellen infiziert waren, mit Ad-CAGA12- Luc 24 h vor der Implantation. Zellen wurden in Mamma Fettpolster an beiden Seiten des SCID-Mäuse implantiert. 72 h später IVIS imaging wurde vor und nach 24 h Behandlung (PBS für Kontrollgruppe) und 50 µg/Tumor TGF-β-Inhibitor für Behandlungsgruppe durchgeführt. (C) Photon Flux wurde von Living Image Software quantifiziert. Angezeigten Daten sind jeder Behandlungsgruppe (n = 12) ± SD statistische Bedeutung wurden ermittelt, indem der Student t-Test (** p ≤0.01 *** p ≤0.0001). p/s bezieht sich auf Photonen/s. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wir entwickelten eine Technik, um Echtzeit-Bildgebung der TGF-β/Smad3 Signalisierung im einzigen lebenden Zellen zu ermöglichen. Mit dieser neuartigen Methode haben wir zuvor eine Subpopulation von Zellen mit dynamischen TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität identifiziert, die mit verstärkten Invasion und Migration8verbunden war. Diese Methode verbessert auf traditionelle Assays für die TGF-β-Signalisierung, wie westliche Flecken der Smad3 Phosphorylierung und TGF-β gezielt Genexpression, durch die Erfassung der Heterogenität der TGF-β/Smad3 Signalisierung in der Tumor-Bevölkerung und Hervorhebung der Bedeutung der einzelnen Zelle Biologie. Darüber hinaus Alternative Methoden der Einzelzelle imaging wie nukleare Translokation zeitaufwendig und kostenintensiv sein kann erfolgt in Zellen Leben und können nicht immer auf Gen Transkription16,17übersetzen. Diese Methoden sind, zwar wichtig, die vorgelagerten Wege der Signaltransduktion zu untersuchen bietet das Adenovirus-Reporter-System eine einzigartige Perspektive auf TGF-β/Smad3 signalisieren in den einzelnen Zellen in Bezug auf biologische Funktion.

Deutlich, unsere Methode bietet eine sensible und reproduzierbare Methode für in Vivo Nachweis der TGF-β/Smad3 Signalweg in Echtzeit während der Tumorprogression und Behandlung. Ähnlich wie bei traditionellen stabile Luciferase in Vivo Imaging, Erkennung von TGF-β/Smad3 Signalisierung innerhalb der Maus ist abhängig von der Anzahl der Zellen und Niveau der Promotor-Aktivität18. Subkutanes Gewebe wenig Störungen für die Analyse bietet, wird größere Tiefe der Zellen die Nachweisempfindlichkeit Signal verringern. Es ist möglich, die Methode für den Einsatz in andere Organe, wie Lunge, Knochen und anderen Krebsarten zu erweitern; Signal-Optimierung oder ex-Vivo Bildgebung empfiehlt jedoch, die Empfindlichkeit für die Krebs-Modell von Interesse erforderlichen zu erreichen.

Ein weiterer Vorteil der Verwendung des Adenovirus-Reporter-Systems ist, dass ihre Anwendung zur Analyse der mehrere Signalwege in lebenden Zellen gleichzeitig erweitern dürfte. In Abbildung 2Ahaben wir bewiesen, dass MDA-MB-231-Zellen mit 2 separaten Adenovirus-Vektoren, CMV-GFP und CAGA-TOM ausgestrahlt werden könnte. Dieses Dual-Infektion-System kann weiter ausgebaut werden, um zwei verschiedene Signalwege über Fluoreszenz Reporter Proteine und Luciferase Reporter (mit Firefly und Guassia Luciferase Reporter Proteine) zu melden. Unser Labor hat erreicht gleichzeitige Signalisierung von BMP/Smad1 und TGF-β/Smad3 Signalwege in einer Reihe von live Krebszelllinien (Daten nicht gezeigt).

Adenovirus-Reporter-Systeme bieten einer einfachen und bequeme Methode für das live Cell Imaging von TGF-β/Smad-Signalweg sowohl in Vitro und in Vivo. Dieses System hat deutliche Vorteile gegenüber anderen Systemen häufig verwendete Reporter. Erstens sind Adenoviren Vektoren berichtet, haben unter der höchsten virale Transduktion Wirksamkeit, so dass sie ein optimales System für Zell-Linien, die schwer zu transduzieren19,20,21,22. Zusätzlich können mit aktuellen Fortschritt in virale Technologien, "gutless" Adenovirus Vektoren durch entfernen die meisten des Virusgenoms zulassend erhöhte exogene DNA-Kapazität23erzeugt werden. Im Vergleich zu nicht-viralen Trägersysteme repräsentieren Adenovirus Vektoren eine kostengünstige, schnelle und einfache Anwendung für Zelle Transduktion, die Ergebnisse in viel größere Lieferung Effizienz19,20,21 ,22.

Dieses Protokoll verwendet eine zweite Generation Adenovirus Expressionssystems, die Replikation-inkompetent ist in Säugerzellen, die nicht die E1a und E1b Proteine Ausdrücken, biologische Sicherheit Risiko24zu minimieren. Doch trotz diese erweiterte biologische Funktionen, Adenoviren kann Partikel noch transduzieren primären humanen Zellen mit hoher Wirksamkeit25,26. US-Biosafety Level 2 und Eindämmung von adenovirale Vektoren wird empfohlen, beim Umgang mit und Entsorgung von Adenovirus Gerät kontaminiert. Großflächige Verstärkung der Adenoviren in den HEK293A Zellen führt zu einer seltenen Generation von Replikation zuständigen "Wildtyp" Adenovirus27. PCR-Screening sollte durchgeführt werden, um Wildtyp Kontamination27zu identifizieren.

Replikation-inkompetent Adenovirus Vektoren sind vorübergehend in Ausdruck und nicht mit Host DNA-20,21zu integrieren. Es wird empfohlen, dass der Experimentator die Stabilität im Ausdruck ihrer Reporter Protein identifizieren, wenn das Adenovirus-Reporter-System verwenden, um die Gültigkeit des langfristigen Experimente bestätigen. Der Ausdruck der Adenovirus-Vektor innerhalb einer Zelle ist proportional zur Zeit Teilung der Zelle und virale MOI. Um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die virale Titer für jede virale Partie genau bestimmt ist. Zusätzlich zu hohe Mengen an das Adenovirus zytotoxischen oder zytopathischen Effekte führen können und es ist wichtig, dass eine optimale MOI für jede Zelle gefüttert empirisch bestimmt wird verwendet, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten. Darüber hinaus kann in Vivo Verwendung von Adenovirus Vektoren Immunreaktionen induzieren; wo sind Immune Antwort nicht die primäre Beobachtung des Experiments immungeschwächter Tiere20,21empfohlen. Zusätzliche Qualitätskontrolle ist erforderlich, wenn die adenoviralen Vektoren zum Ziel Immunantworten, mit, obwohl die Verwendung von das Adenovirus als Adjuvans zu Impfstoff Therapien28,29validiert wurde.

Das Adenovirus-Reporter-System verwendet werden, auf ein breites Spektrum von Primär- und kultivierten Zelllinien geteilt und nicht geteilt Natur20,22. Mit dem Adenovirus-Reporter-System haben wir 100 % Infektionsraten in einer Reihe von Krebszelllinien einschließlich Gehirn erreicht, Brustkrebs, Darmkrebs als auch primäre Maus embryologischen Fibroblasten (MEF) und Canine Kidney epithelialen (MDCK) Zellen. Darüber hinaus können adenovirale Vektoren weiter geändert werden, um die Affinität für Zelltyp spezifische Rezeptoren, bietet verbesserte Orgel-targeting und Wirksamkeit für die Transduktion30,31zu erhöhen.

Anwendungen dieser Methode können auf andere Signalwege und Zelle Gastgeber erweitert werden. Die wichtigsten Vorteile des adenoviralen Reporter Systems sind billig, hohe Transduktion Wirksamkeit, schnelle Versuchsaufbau und mangelnde Integration mit Host DNA-21,32. Diese Methode kann zu vielen aktuellen Tests und in-Vivo -Modelle, darunter bei der Bewertung der neuen zielgerichteten Therapeutika33angewendet werden. Wir hoffen, dass die Verwendung dieser Technik unser Verständnis des Verhältnisses zwischen Signalisierung Wege und biologische Prozesse führen zu neuen biologischen Entdeckungen und die Entwicklung neuer Therapien verbessern wird.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren Berichten keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council (NHMRC), H-JZ. TMBW ist ein Empfänger von Australien Postgraduate Award der australischen Regierung und der Ann Henderson Top-up Stipendium von australischen Rotary Gesundheit auf Partner mit Rotary Templestowe und Dine für eine Heilung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM ThermoFisher 1881024 Warm in 37 °C waterbath before use
Foetal Bovine Serum Scientifix Life FBS500-S Heat inactivated before use
Recombinant Human TGF-β1 PEPROTECH 100-21 Aliquot in DDW to make final concentration at 10 mg/mL
Hoechst-33258 Tocris Bioscience 5117 Dilute in to PBS to make final concentration at 1 μL/mL
Luciferase Reporter Assay Kit Promega 197897 Dilute 5x in PBS before use
Luminometer Promega 9100-002
Phase contrast fluorescence microscopy OLYMPUS IX50
Centrifuge eppendorf 5810 R
VivoGl Luciferin Promega P1041
IVIS Lumina III In Vivo Imaging System PerkinElmer CLS136334
0.5% Trypsin-EDTA (10x) ThermoFisher 15400-054 Diltue to 0.05% (1x) in PBS
Cell Culture Lysis 5x Reagent Promega E153A Dilute to 1x in DDW
10% Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
HEK 293A ThermoFisher R70507
MDA-MB-231 ATCC CRM-HTB-26
PRKDC-SCID Animal Resources Centre SCIDF6
Matrigel Corning 354234
Isoflurane Zoetis 26675-46-7
Ethanol Chem-supply EA043-10L-P
Refresh Night Time Allergan 1750D Lubricating Eye Ointment
Solution Composition
Phosphate-Buffered Saline (PBS) NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)
FBS-DMEM  5% heat inactivated FBS; 10 μg/mL penicillin; 100 μg/mL streptomycin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Massague, J., Like, B. Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines. The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).
  2. Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation. Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).
  3. Massague, J. TGFbeta signaling in context. Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).
  4. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).
  5. Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. Role of transforming growth factor beta in human disease. The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).
  6. Zhu, H. J., Burgess, A. W. Regulation of transforming growth factor-beta signaling. Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).
  7. Massagué, J. TGFβ in Cancer. Cell. 134, 215-230 (2008).
  8. Luwor, R. B., et al. Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity. Molecular cancer. 14, 50 (2015).
  9. Clarke, D. C., Liu, X. Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling. Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).
  10. Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).
  11. Luwor, R. B., et al. New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling. Growth factors. 29, 211-218 (2011).
  12. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).
  13. Luwor, R. B., et al. Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo. Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).
  14. Reed, L. J., Muench, H. A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints. American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).
  15. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9, 671-675 (2012).
  16. Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity. The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).
  17. Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines. Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).
  18. Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
  19. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).
  20. Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).
  21. Lee, C. S., et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).
  22. Wang, I. I., Huang, I. I. Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies. Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).
  23. Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).
  24. Wang, Q., Finer, M. H. Second-generation adenovirus vectors. Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).
  25. Durham, H. D., et al. Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue. Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).
  26. MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture. Blood. 96, 100-108 (2000).
  27. Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR. Biotechniques. 18, 444-447 (1995).
  28. Choi, Y., Chang, J. Viral vectors for vaccine applications. Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).
  29. de Cassan, S. C., et al. The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus. Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).
  30. Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism. Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).
  31. Wickham, T. J., et al. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins. Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).
  32. Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. Virus vectors for gene delivery to the nervous system. Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).
  33. Zhou, F., et al. Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling. Nature communications. 5, 3388 (2014).

Tags

Cancer Research Ausgabe 137 TGF-β live Cell Imaging Adenoviren Zelle signalisieren Brust Krebs Smad3 transkriptionelle Aktivierung
Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway <em>In Vitro</em> und <em>In Vivo</em> mit einem Adenovirus-Reporter-System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., … More

Chen, H., Ware, T. M. B., Iaria, J., Zhu, H. J. Live Cell Imaging of the TGF- β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (137), e57926, doi:10.3791/57926 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter