Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Forsøgsplan for behandlingen af adfærdsmæssige reaktion profiler i larve fisk: ansøgning til Neuro-stimulerende koffein

Published: July 24, 2018 doi: 10.3791/57938
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at undersøge larve zebrafisk og bredhovedet elritse bevægeapparatet aktiviteter og photomotor svar (PMR) ved hjælp af en automatiseret sporingssoftware. Når de indgår i fælles toksikologi bioassays, giver analyser af disse adfærd et diagnostisk redskab for at undersøge kemiske bioactivity. Denne protokol er beskrevet ved hjælp af koffein, en model neurostimulant.

Abstract

Fisk modeller og adfærd bruges i stigende grad på de biomedicinske videnskaber; fisk har dog længe været genstand for økologiske, fysiologiske og toksikologiske undersøgelser. Ved hjælp af automatiseret sporing af digitale platforme, nylige indsats i neuropharmacology løftestangsvirkningen larve fisk bevægeapparatet adfærd for at identificere potentielle terapeutiske mål for nye små molekyler. Svarende til disse bestræbelser, forskning i miljøvidenskab og sammenlignende farmakologi og toksikologi undersøger forskellige opførsler af fisk modeller som diagnostiske redskaber i differentieret vurdering af forurenende stoffer og real-time overvågning af overfladevand for forurenende trusler. Zebrafisk er en populær larve fisk model i de biomedicinske videnskaber, er tykhovedede elritse en fælles larve fisk model i økotoksikologi. Desværre har bredhovedet elritse larver fået langt mindre opmærksomhed i adfærdsmæssige undersøgelser. Her vi udvikle og demonstrere en adfærdsmæssige profil protokol bruger koffein som en model neurostimulant. Selvom photomotor svar af tykhovedede Elritser var lejlighedsvis påvirket af koffein, zebrafisk var markant mere følsomme over for photomotor og bevægeapparatet slutpunkter, som reagerede på miljømæssigt relevante niveauer. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at forstå sammenlignende adfærdsmæssige følsomhed forskelle blandt fisk med alder og tidspunkt på dagen, og til at afgøre, om lignende adfærdsmæssige virkninger ville forekomme i naturen og blive vejledende for negative resultater på enkelt eller befolkning niveauer i biologiske organisation.

Introduction

Selvom fisk modeller bruges i stigende grad for biomedicinsk undersøgelser, har fisk været rutinemæssigt ansat i økologi og fysiologi undersøgelser, at undersøge forurening af overfladevand og forstå toksikologiske tærskelværdier for kemikalier. Disse bestræbelser er vigtigt, fordi kemiske forurening kan forringe akvatiske økosystemer og bringe kvaliteten af kilde vandforsyninger1,2. De fleste af kemikalierne inden for handel, men mangel på selv grundlæggende toksikologi information3.

Dyremodel assays traditionelt anvendes i lovgivningsmæssige toksicitetstest er ressourcekrævende og kan ikke levere den høje overførselshastighed, tidlig tier screening behov for toksicitet test i 214. Efterfølgende er der en voksende tilskyndelse til at vedtage og anvende in vitro- modeller, der kan mere hurtigt og effektivt skærmen forbindelser for biologiske aktiviteter3,5. Selv om celle-baserede modeller præsentere mange muligheder, de mangler ofte biologisk kompleksitet, og dermed højde ikke for mange vigtige hele organismen processer, herunder metabolisme6.

For zebrafisk er en fælles biomedicinsk dyremodel, der stigende popularitet som en alternativ model i akvatiske toksikologi og økotoksikologi7,8. I betragtning af deres lille størrelse, hurtig udvikling og høj frugtbarhed, kan fisk modeller anvendes til hurtigt og effektivt skærmen kemikalier til bioactivity og toksicitet på hele organismen skala9. Ved hjælp af automatiserede tracking software giver larve zebrafisk adfærd forbedrede diagnostiske nytte i screening forurenende stoffer for toksicitet10,11. Undersøgelser i de farmaceutiske videnskaber har vist at bevægeapparatet slutpunkter er informative af kemiske virkningsmekanismer, kan bruges til fænotype adfærd, og derefter kan forsøgsvis identificere subcellulært mål for nye molekyler12, 13. Zebrafisk er en populær larve fisk model i de biomedicinske videnskaber, tykhovedede elritse er en fælles, økologisk vigtige fisk model, der er brugt for økotoksikologi undersøgelser og under potentielle (f.eks. nye kemiske evalueringer) og retrospektiv (fx omgivende overfladevand eller spildevand spildevand decharge overvågning) miljøvurderinger. Desværre har adfærdsmæssige reaktioner af larve tykhovedede Elritser fået markant mindre opmærksomhed end zebrafisk. Vores igangværende forskning med to fælles larve fisk modeller, zebrafisk og bredhovedet Elritse, tyder på, at larver fisk svømmer mønstre vises unikke forventede tilstande eller virkningsmekanismer for forskellige kemikalier. Adfærdsmæssige slutpunkter giver således, potentiale til at hurtigt og fornuftigt undersøge kemikalier til toksicitet og identificere subcellulært mål for industrielle kemiske og andre kontaminanter, især i begyndelsen tier vurderinger.

Her rapporterer vi en protokol for behandlingen af adfærdsmæssige reaktion profiler i larve fisk. Vi demonstrere disse metoder, koffein, en model neurostimulant og en fælles akvatiske forurenende stof, der er introduceret til akvatiske systemer gennem udledning af spildevand behandlinger planter efter menneskers indtagelse af fødevarer, drikkevarer, og Pharmaceuticals formuleret med koffein14. Vi undersøger adfærdsmæssige reaktioner på koffein i begge larve zebrafisk og bredhovedet Elritse, herunder at en pludselig ændring i lysforhold, der ofte omtales som en photomotor reaktion (PMR) under farmaceutiske studier med embryonale og larve zebrafisk13,15. Vi yderligere at identificere virkningerne af koffein på tværs af flere bevægeapparatet slutpunkter til at udvikle kemiske reaktion profiler for hver fisk model. Koffein behandling niveauer anvendes i denne undersøgelse repræsenterer den øvre centiles af eksponering distributioner baseret på målte miljømæssige værdier af koffein16. Vi har desuden behandlinger benchmarkes larve fisk LC50 værdier og terapeutiske hazard værdi (THV), en farmaceutisk koncentration i vand, som forventes for at resultere i plasmaniveauer i fisk i overensstemmelse med en plasma fra mennesker terapeutiske dosis.

Protocol

Undersøgelser i denne protokol generelt følge standardiserede eksperimentelle design og anbefalede retningslinjer for statistisk analyse fra den US Environmental Protection Agency (EPA no. 2000.0) for tykhovedede Elritser og organisationen for økonomisk samarbejde og Udvikling (OECD nr. 236) for zebrafisk. Disse eksperimentelle design (f.eks.øget replikation) kan ændres inden for den nuværende protokol for fremtidige undersøgelser. Fisk kultur betingelser følge tidligere offentliggjort litteratur17. Alle eksperimentelle procedurer og fisk kultur protokoller fulgt institutionelle Animal Care og brug Udvalget protokoller godkendes på Baylor University.

1. at udsætte fisk til kemisk behandling

  1. Forberede koffein eksponering løsninger ved at opløse koffein i rekonstitueret hårdt vand. Udføre passende serielle fortyndinger af fortynding højere koffein behandlinger med hårdt vand til at producere lavere koffein behandling niveauer.
    Bemærk: Tabel 1 en oversigt over hver af de behandling niveauer anvendes i dette eksperiment.
Zebrafisk Bredhovedet elritse
Behandling Nominelle koffein koncentration (mg/L) Målte koffein koncentration (mg/L) Behandling Nominelle koffein koncentration (mg/L) Målte koffein koncentration (mg/L)
Kontrol 0 < LOD Kontrol 0 < LOD
75 Centile * 0,001 0,001 75 Centile * 0,001 0,001
95 Centile * 0.039 0,013 95 Centile * 0.039 0,009
99 Centile * 0,412 0.361 99 Centile * 0,412 0.310
THV 4.07 3,81 THV 4.07 4.12
10% LC50 48.46 46.66 10% LC50 14.1 14,7
40% LC50 193.82 186.67 40% LC50 56.38 53.91

Tabel 1: eksperimenterende koffein behandlinger for zebrafisk og bredhovedet elritse eksperimenter. Nominelle og målte værdier af koffein for hver behandling er givet. * De koffein behandlinger anvendes i denne undersøgelse repræsenterer den øvre centiles af eksponering distributioner baseret på målte miljømæssige værdier af koffein16. THV: Fare for terapeutisk værdi. LOD: Grænse for afsløring

  1. Hæld den fremstillet opløsning i individuelle eksponering champers. Brug 100 mL glas bægre fyldt med 20 mL af eksponering løsning for zebrafisk eksponering kamre og 500 mL bægerglas med 200 mL eksponering-løsning bredhovedet elritse eksponering kamre.
  2. Ved hjælp af en overførsel pipette, placere 10 zebrafisk embryoner alderen 4-6 h post befrugtning (hpf) i hver af fire Repliker eksponering kamre pr. behandling.
  3. Sted 10 bredhovedet elritse larver alderen inden for 24 timer af rugeæg i hver af tre Repliker eksponering kamre pr. behandling. For at imødekomme den større størrelse af bredhovedet elritse larver, skåret spidsen af overførsel pipette off før overførsel.
  4. Vedligeholde zebrafisk eksperimenter på et 16:8 h lys: mørk lys og en konstant temperatur på 28 ± 1 ° C. Brug den samme lysperiode regime for bredhovedet elritse studier, men ved en temperatur på 25 ± 1 ° C.
  5. 96 h af kemisk eksponering plader belastning enkeltfisk i separate brønde 48 (for zebrafisk) og 24 (for bredhovedet elritse) godt.
    1. For at sikre, at hver godt indeholder et lige saa stort volumen af løsning, overføre zebrafisk larver til 48 godt plader ved hjælp af en 5.000 µL autopipette af en 1.000 µL pr. brønd. Brug autopipette til at trække og overføre både zebrafisk larver og eksponering løsning samtidig.
    2. På grund af deres større størrelse, overføre bredhovedet elritse larver ved hjælp af en overførsel pipette med spidsen afskåret. Før overførsel bredhovedet elritse larver til individuelle brønde, fylde hver godt til 2.000 µL ved hjælp af en autopipette. Når du overfører individuelle bredhovedet larver brønde, Placer spidsen af overførsel pipette i opløsningen godt og lad fisk svømme fra pipette tip i brønden.

2. kalibrering af Video-tracking parametre

  1. Før adfærdsmæssige foranstaltninger, observation og kalibrering parametre er angivet i videospor software (se tabel af materialer).
    1. Placere et godt plade i optagelse kammer med mindst 1 larve fisk i en individuel godt. Bruge plade og tilknyttede fisk som repræsentationer til sæt kalibreringsparametre.
    2. I videospor software, skal du klikke på "fil | Generere protokol", som vil åbne en"protokol guiden til oprettelse"dialogboks. I feltet "placeringen Count" Indtast antallet af individer wells af godt plade og klik derefter på "OK".
    3. På toppen af skærmen, skal du klikke på "Vis | Fuld skærm", som vil bede systemet til at vise en overhead kameravisning af godt plade.
    4. Klik på ikonet "Tegne områder", der vises som tre flerfarvede figurer. Til højre for godt pladen visningsområde, skal du vælge ikonet cirkel i feltet mærket "Områder".
    5. Brug cursoren til at afgrænse den cirkulære video tracking område i øverste venstre godt af godt pladen. Vælg "Øverst til højre Mark" og derefter skitsere fremviserområdet i toppen lige godt. Vælg derefter "Bunden Mark" at skitsere bunden lige godt.
      Bemærk: Efter tegning cirkulære dispositionen, sin holdning vil sandsynligvis nødt til at blive justeret.  Hvis du vil justere placeringen af dispositionen, klik på "Vælg" og derefter bruge markøren til at flytte området skitseret. Også, kan blive replikeret konturer ved at klikke på "Kopier" og derefter "Sæt ind".
    6. Efter øverst til venstre, øverst til højre, og bunden lige godt tracking områder er blevet defineret, skal du klikke på "Bygge" hurtig software til automatisk at afgrænse visning områder af de resterende brønde.
    7. I området mærket "Kalibrering", skal du klikke på "Tegne skala". Brug markøren til at tegne en vandret linje på tværs af pladen. Når linjen er hentet, vises en dialogboks mærket "Kalibrering måling". Angiv godt plade og klik på "OK".
    8. Afslut den tegning manager ved at klikke på ikonet "Tegne områder".
    9. Klik på ikonet "Fliser".  Ved hjælp af markøren, fremhæve alle de bokse, der vises på tv-skærmen, så hver boks er grønne.
      Bemærk: Ikonet fliser vises som en gruppe af seks individuelle små firkanter
    10. "Klik på View | Fuld skærm".  Klik på "Bkg" i feltet "Påvisningsgrænse" til højre for pladen visningsområde. Bruge tærskel justering baren til at angive pixel påvisningsgrænsen. Når, den passende pixel påvisningsgrænse er valgt, klik på "Anvend til gruppen".
      Bemærk: Denne protokol fastsætter påvisningsgrænsen på 13 i sort tilstand for zebrafisk observationer og 110 i transparent tilstand for bredhovedet elritse observationer.
    11. Angiv den ønskede bevægelse hastighed tracking parametre i boksen mærket "Tærskel". Når hastighed parametre er angivet, skal du klikke på "Anvend til gruppen".
      Bemærk: Denne protokol fastsætter små/store bevægelser på 20 mm/s og inaktive/små bevægelser på 5 mm/s. Disse valg program software til at spore larve fisk bevægelse på tre forskellige hastighed niveauer: inaktiv (frysning) = < 5 mm/s, lille (cruising) = 5 – 20 mm/s, og store (bursting) = > 20 mm/s.
    12. Klik på "parametre | Protokol parametre"fra drop-down menuen. I dialogboksen, Vælg fanen "Tid" Enter observationsperiodens og integration tid. Klik på "Ok", når parametrene er angivet.
    13. For at indstille drop lys/mørke lysperiode gange og lysintensiteten for hver lysperiode åben lys driverindstillingerne dialog boks ved at vælge "Lys kørsel" fra "Parametre" down menuen.
      Bemærk: Se protokollen video for fastsættelse af flere lys-mørke photoperiods.
    14. Efter video sporingsparametre har indstillet, gemme observation-protokollen.
      Bemærk: Denne protokol bemærker fisk adfærd i en 50 min periode, der omfatter en 10 min akklimatisering fase efterfulgt af 4 at ændre lys/mørke faser består af 10 min lys slutperiode og to 10 min mørke perioder. Integration tid er indstillet til at måle adfærd for hvert minut af adfærdsmæssige prøveversionen af 50 min.

3. observation af larve fisk bevægeapparatet og Photomotor adfærd

  1. Placer godt pladen som indeholder eksperimentel fisk i adfærdsmæssige optagelse kammer.
  2. I videoen tracking software, åbne tracking protokol udviklet i trin 3.
  3. I video tracking Vieweren, kontrollere for at sikre, at alle larver er synlige på skærmen, at kun en enkelt larve er til stede i hver brønd, og at individuelle brønde er justeret inden observation, der blev defineret i trin 2.1.5 og 2.1.6.
  4. Klik på "eksperiment | Udføre".
    Bemærk: Systemet vil bede brugeren om at angive et navn og en placering til at gemme dataene i observation.
  5. Når navnet og lagring af observation data er angivet, skal du klikke på ikonet "Flere Live billeder" at fremhæve alle de foruddefinerede visning områder
    Bemærk: Dette ikon er placeret øverst på skærmen og vises som et felt, der er opdelt i fire mindre kvadrater. At klikke på dette ikon vil fremhæve alle de foruddefinerede visning områder.
  6. Luk panelet optagelse kammer og klik på "baggrund | Start"på computerskærmen.

4. analysere adfærdsmæssige Data

  1. Hvis du vil hente larve fisk aktivitetsdata, åbne regneark, der automatisk er udarbejdet af tracking software og i mappen angivet af brugeren før indlede adfærdsmæssige forsøg (trin 3,4).
  2. Henvise til figurer 1A og 1B for repræsentative målinger af naive bevægeapparatet aktivitet af eksponerede zebrafisk og bredhovedet elritse larver, henholdsvis. Se tallene 1 c og 1 D for PMR beregninger, som effektivt undersøger omfanget af bevægelse forskellen mellem lys til mørke eller mørk til lys overgange.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på baseline aktivitet af eksponerede zebrafisk (A og B) og bredhovedet elritse (C og D). Middelværdi (± SEM) afstand svømmede for zebrafisk (A) og bredhovedet elritse (C) er givet ved prikker hver repræsenterer et minuts intervaller af aktivitet. To mørke og lys slutperiode photomotor svar er målt. Sidst (a, c, e og g) og første (b, d, f og h) minut af hver lysperiode bruges til at beregne PMRs. Photomotor svar af zebrafisk (B) og bredhovedet elritse (D) er målt som ændringen i afstand, betyde (±SEM) mellem sidste øjeblik en indledende lysperiode og det første minut af den efterfølgende periode. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

Koffein behandling niveauer varierer ikke mærkbart under 96 h eksperimenter med zebrafisk og tykhovedede Elritser. For eksempel, præsenterer tabel 1 analytisk verificerede koncentrationer af hver behandling plan. Denne protokol verificeret vandprøver for koffein behandling niveauer af isotop-fortynding væskekromatografi tandem massespektrometri (LC-MS/MS) generelt efter tidligere rapporteret metoder28. Dannelsen af paraxanthine, den primære metabolit af koffein, blev også kvantificeret. En beskrivelse af disse analysemetoder, der er fastsat i den supplerende analytiske oplysninger. På grund af ligheder mellem nominel og analytisk kontrol af behandlinger præsenteres nominelle behandling niveauer i resten af dette manuskript. Koffein i betydelig grad ændret zebrafisk og bredhovedet elritse adfærd. Zebrafisk bevægelsesmæssigt reaktioner var imidlertid konsekvent mere følsomme over for koffein end tykhovedede Elritser. De mest følsomme adfærdsmæssige slutpunkter for zebrafisk og bredhovedet elritse larver var påvirket af koffein i en koncentration på 0,039 mg/L. tabel 2 opsummeres laveste observerede effekt koncentrationer (LOECs) og ingen observeret effekt koncentrationer (NOEC'er) for hver adfærdsmæssige slutpunkt i begge fisk modeller.

Zebrafisk Bredhovedet elritse
Slutpunkt LOEC (mg/L) NOEC (mg/L) Slutpunkt LOEC (mg/L) NOEC (mg/L)
Samlet Distance mørke 0,412 0.039 Samlet Distance mørke − 56.38
Samlet Distance lys 48.46 4.07 Samlet Distance lys − 56.38
Total tæller mørke 0,412 0.039 Total tæller mørke − 56.38
Total tæller lys 48.46 4.07 Total tæller lys − 56.38
Sprængfyldt afstand mørke − 193.82 Sprængfyldt afstand mørke − 56.38
Sprængfyldt afstand lys 193.82 48.46 Sprængfyldt afstand lys − 56.38
Sprængfyldt tæller mørke 193.82 48.46 Sprængfyldt tæller mørke − 56.38
Sprængfyldt tæller lys 193.82 48.46 Sprængfyldt tæller lys − 56.38
Sprængfyldt varighed mørke 193.82 48.46 Sprængfyldt varighed mørke − 56.38
Sprængfyldt varighed lys − 193.82 Sprængfyldt varighed lys − 56.38
Cruising afstand mørke 0,412 0.039 Cruising afstand mørke − 56.38
Cruising afstand lys 48.46 4.07 Cruising afstand lys − 56.38
Cruising tæller mørke 0,412 0.039 Cruising tæller mørke − 56.38
Cruising tæller lys 48.46 4.07 Cruising tæller lys − 56.38
Cruising varighed mørke 0,412 0.039 Cruising varighed mørke − 56.38
Cruising varighed lys 48.46 4.07 Cruising varighed lys − 56.38
Frysning afstand mørke 0,412 0.039 Frysning afstand mørke 0.039 0,001
Frysning afstand lys 0.039 0,001 Frysning afstand lys − 56.38
Frysning tæller mørke 0,412 0.039 Frysning tæller mørke − 56.38
Frysning tæller lys 48.46 4.07 Frysning tæller lys − 56.38
Frysning varighed mørke − 193.82 Frysning varighed mørke 56.38 14.10
Frysning varighed lys 48.46 4.07 Frysning varighed lys − 56.38
Mørke 1 PMR 48.46 4.07 Mørke 1 PMR 0.039 0,001
Lys 1 PMR 48.46 4.07 Lys 1 PMR − 56.38
Mørk 2 PMR 48.46 4.07 Mørk 2 PMR − 56.38
Lys 2 PMR 48.46 4.07 Lys 2 PMR − 56.38
Sprængfyldt mørke 1 PMR − 193.82 Sprængfyldt mørke 1 PMR − 56.38
Sprængfyldt lys 1 PMR − 193.82 Sprængfyldt lys 1 PMR − 56.38
Sprængfyldt mørk 2 PMR 193.82 48.46 Sprængfyldt mørk 2 PMR − 56.38
Sprængfyldt lys 2 PMR − 193.82 Sprængfyldt lys 2 PMR − 56.38
Cruising mørke 1 PMR 48.46 4.07 Cruising mørke 1 PMR − 56.38
Cruising lys 1 PMR 48.46 4.07 Cruising lys 1 PMR − 56.38
Cruising mørk 2 PMR 48.46 4.07 Cruising mørk 2 PMR − 56.38
Cruising lys 2 PMR 193.82 48.46 Cruising lys 2 PMR 56.38 14.10
Frysende mørke 1 PMR 48.46 4.07 Frysende mørke 1 PMR − 56.38
Frysning lys 1 PMR 193.82 48.46 Frysning lys 1 PMR − 56.38
Frysning mørk 2 PMR 48.46 4.07 Frysning mørk 2 PMR − 56.38
Frysning lys 2 PMR 193.82 48.46 Frysning lys 2 PMR − 56.38

Tabel 2: zebrafisk og bredhovedet elritse adfærdsmæssige NOEC'er og LOECs for koffein. Ingen observeret virkning koncentration (NOEC) og laveste observerede effekt koncentration (LOEC) (mg/L) værdier for hver af lys/mørke svømning aktivitet slutpunkter og photomotor svar for zebrafisk og tykhovedede Elritser udsat for koffein. Streger angiver, at ingen effekter blev observeret på et bestemt slutpunkt på tværs af alle behandling niveauer.

Figur 2 præsenterer samlede bevægeapparatet aktivitet og PMRs af zebrafisk og bredhovedet elritse efter 96 timer eksponering for koffein. Bredhovedet elritse larver PMRs blev ændret af koffein på lavere behandling niveauer (0,038 mg/L) end zebrafisk, men en markant større antal photomotor slutpunkter blev berørt i zebrafisk. Den højeste koffein (193.82 mg/L)-behandling ændres PMR i zebrafisk, hvorpå disse svar blev præcis modsatte fra kontrolelementer. På denne forhøjede behandling plan, men PMRs faldt i mørke og steg i lysforhold.

Figure 2
Figur 2: Svømning aktivitet og photomotor svar af zebrafisk (A og B) og bredhovedet elritse (C og D) efter 96 timer eksponering for koffein. Middelværdi (± SEM) afstand svømmede for zebrafisk (A) og bredhovedet elritse (C) er givet ved prikker hver repræsenterer 1-min. intervaller af aktivitet. Photomotor svar af zebrafisk (B) og bredhovedet elritse (D) måles som ændringer i gennemsnit (± SE) samlede afstand mellem last minutes af en indledende lysperiode og det første minut af den efterfølgende periode. To mørke og to lyse periode photomotor svar blev målt. Ialt 24 (4 replikater hver af 6 larver) zebrafisk og 12 (3 replikater hver af 4 larver) tykhovedede Elritser blev brugt til adfærdsmæssige observation. p < 0,10; p < 0,05; p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Ud over måling larve PMRs, blev lyse og mørke bevægeapparatet aktivitet analyseret på tværs af tre hastighed tærskler for afstand flyttet, antallet af bevægelser og varighed af bevægelser. Denne data bliver brugt til at udvikle adfærdsmæssige reaktion profiler for koffein (figur 3, supplerende figur 1). I begge dele af fisk modeller berørt koffein hæmmede aktivitet på alle væsentligt bevægeapparatet slutpunkter. Begge fisk modeller påvist øget aktivitet på de bristende hastighed tærskler efter udsættelse for koffein, dog ikke betydeligt. Ligner resultaterne af PMR observationer, koffein foretages et større antal zebrafisk bevægeapparatet slutpunkter. I virkeligheden, ændret koffein væsentligt flere bevægelsesmæssigt reaktioner under mørke forhold på miljømæssigt realistiske niveauer under THV. Dog var bredhovedet elritse bevægeapparatet aktivitet ikke væsentligt berørt under lysforhold ved enhver behandling plan.

Figure 3
Figur 3: svar profiler af larve zebrafisk og tykhovedede Elritser efter 96 timer eksponering for koffein. Betyde zebrafisk mørke (A) og light (B) svømning aktivitet i forhold til at betyde bredhovedet elritse mørke (C) og light (D) aktivitet efter 96 timer eksponering for koffein. Afbildet data repræsenterer aktivitet over to 10 min mørke photoperiods og to 10 min lettere photoperiods for hver fisk model. Dataene er normaliseret til kontrol, som er repræsenteret på en 0 akse i hver figur. Adfærdsmæssige parametre omfatter afstand svømmede antallet af bevægelser (tæller), og varigheden af hver bevægelse på tværs af 3 hastighed niveauer, sprængfyldt (> 20 mm/s), cruising (5-20 mm/s), og frysning (< 5 mm/s). Ud over bevægelsesmønstre ved hver af tærsklerne, hastighed, samlet distance svømmede og samlede antal flytninger er repræsenteret. ↑ udgør en væsentlig stigning i aktivitet i forhold til kontrol og ↓ indikerer en betydelig nedgang i aktiviteten i forhold til kontrol. Ialt 24 (4 replikater hver af 6 larver) zebrafisk og 12 (3 replikater hver af 4 larver) bredhovedet elritse hvor det bruges i adfærdsmæssige observationer for hver gruppe. p < 0,10; p < 0,05; p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Photomotor svar af zebrafisk (A og B) og bredhovedet elritse (C og D) på tværs af tre hastighed tærskler. Zebrafisk (A, B og C) og bredhovedet elritse larver (D, E og F) photomotor svar på tværs af tre hastighed tærskler (frysning: 20 mm/s) efter 96hr eksponering for koffein. Photomotor svar af zebrafisk og bredhovedet elritse måles som ændringer i gennemsnit (±SE) samlede afstand mellem last minutes af en indledende lysperiode og det første minut af den efterfølgende periode. To mørke og to lyse periode photomotor svar blev målt. Ialt 24 (4 replikater hver af 6 larver) zebrafisk og 12 (3 replikater af 4 larver) tykhovedede Elritser blev brugt til adfærdsmæssige observation. * p < 0,01 venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Når du vælger kemisk behandling niveauer for adfærdsmæssige toksikologiske undersøgelser, skal flere faktorer overvejes. Koffein behandling niveauer i den foreliggende undersøgelse blev udvalgt på grundlag af øvre centile værdier for forventede miljømæssige eksponeringsscenarier fra spildevand spildevand16. Når det er muligt, vælger vi rutinemæssigt behandling niveauer for akvatiske toksikologiske undersøgelser ved hjælp af probabilistiske eksponering vurderinger af miljømæssige bemærkninger19,20,21. En THV, som er beregnelig for lægemidler, blev også medtaget som et behandling niveau i den foreliggende undersøgelse. THV værdier (Eq. 1)22,23 defineres som forudsagt vand koncentrationer fører til menneskelige terapeutiske doser (Cmax) af lægemidler i fisk23, er inspireret fra første plasma modellering indsats24, og er beregnet på grundlag af blod: vand kemisk partitionering koefficienter (Eq. 2)25.

THV = Cmax / log PBW (Eq. 1)

Log PBW = log [(100,73. log Kow · 0,16) + 0,84] (Eq. 2)

Her vælger vi også subletale behandling niveauer i forhold til zebrafisk og bredhovedet elritse LC50 værdier. Vi betragter denne tilgang en nyttig benchmarkingprocedure for adfærdsmæssige reaktioner, især når man sammenligner tærskler for specifikke adfærd med en fisk model på tværs af flere kemikalier. Det letter yderligere beregninger af akut til kronisk nøgletal, som kan være diagnostisk nyttige i akvatiske toksikologi Mekanistiske undersøgelser og vurderinger. LC50 værdier blev indhentet fra indledende toksicitet bioassays efter de givne i trin 2.1 standardiserede retningslinjer.

I denne protokol, vi anvender fælles eksperimentelle design og statistiske teknikker anbefales af US EPA og OECD standardiserede metoder for toksikologi undersøgelser med fisk modeller. Selvom vi rapportere p -værdier (fx., < 0,01, < 0,05, < 0,10), betydelige forskelle (α = 0,10) i aktivitet niveauer er identificeret blandt behandlinger ved hjælp af variansanalyse (ANOVA) Hvis normalitet og ligestilling af variansen antagelser er opfyldt. Dunnetts eller Tukey's HSD post hoc test udføres for at identificere behandling forskelle. Vi vælger denne alpha (α = 0,10) værdi at reducere type II fejl, især for tidligt tier assays og hvornår en forståelse af biologisk vigtig effekt størrelse er begrænset til forsømt adfærdsmæssige slutpunkter og model organismer26, i stedet for beskæftiger procedurer mere almindelige i biomedicinsk videnskab for flere sammenligninger (fx., Bonferroni korrektion for RNA-Seq data)27.  Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at forstå variabiliteten af disse adfærdsmæssige reaktioner og potentielt ændre eksperimentelle design (fx, øget replikation) i overensstemmelse hermed.

En række faktorer kan påvirke adfærd af larve fisk ud over kemiske eksponering. For eksempel, tid på dagen, alder, godt størrelse, temperatur, lysforhold, og mængden af eksponering løsning i hver godt repræsenterer vigtige overvejelser11,30. Af disse grunde bør der tages forholdsregler til at minimere virkningen af eksterne faktorer, der kan påvirke bevægeapparatet opførsel af de larve fisk under eksperimenter. Adfærdsmæssige observationer skal udføres i smalle tidsvinduer (3 til 4 h) og på tværs af tidsperioder Hvornår tid af dagen virkninger forventes at have minimal indflydelse på larve bevægeapparatet adfærd11. Derudover bør larve fisk opretholdes, ved en ensartet temperatur (28 ± 1 ° C for zebrafisk) og 24 ± 1 ° C for FHM og på en defineret lys/mørke cyklus i temperatur-kontrollerede væksthuse i hele perioden eksponering. Derudover kan opretholdes temperaturen i laboratoriet hvor adfærd registreres betingelser tilnærme forsøgsbetingelser at undgå temperatur påvirkninger på adfærd. Yderligere, kan opretholdes brønde anvendes under adfærdsmæssige observationer på en sammenhængende volumen for hver enkelt fisk.

Larver og embryonale zebrafisk PMRs har tidligere er blevet anvendt i de biomedicinske videnskaber til at identificere potentielle terapeutiske mål om roman forbindelser12,13. Denne protokol udvider på tidligere adfærdsforskning med zebrafisk ved at udnytte 38 slutpunkter for at undersøge kemiske bioactivity af miljøforurenende. Selv om koffein er en fælles akvatiske forurenende stof med en forståelig virkningsmekanisme (MoA), mangler mange forbindelser i commerce vigtige mekanistiske data. Derfor, denne protokol kan anvendes til at få indsigt i MoAs for forbindelser mangler toksicitetsdata, herunder kommercielle kemikalier39. Derudover indeholder protokollen metoder for to af de mest almindeligt anvendte fisk modeller. Som nævnt tidligere, mens zebrafisk er en fælles biomedicinsk fisk model, der bliver stadig mere populære i økotoksikologi, tykhovedede elritse er almindeligt anvendt som en økologisk model for miljøvurdering programmer men har modtaget forholdsvis mindre opmærksomhed i adfærdsmæssige undersøgelser med automatiserede systemer i forhold til zebrafisk. Selv om der ingen standardiseret lovgivningsmæssige metoder til fisk adfærdsmæssige toksikologiske undersøgelser, giver denne protokol en tilgang til at understøtte fremtidige bestræbelser.

Koffein fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner i hver af fisk modellerne på niveauer, der er blevet påvist i vandmiljøet16. Rodriguez-Gil et al. 2018 udviklet globale miljøeksponering distributioner i akvatiske systemer baseret på målte værdier af koffein16. Specifikt, ville 95% af forventet spildevand spildevand koncentrationer falde under LOECs for de mest følsomme adfærdsmæssige slutpunkter for zebrafisk og bredhovedet elritse i den nuværende undersøgelse (tabel 2). Selvom flere adfærdsmæssige virkninger af koffein blev observeret i zebrafisk (især i mørke omgivelser) på miljømæssigt relevante niveauer, er det uklart, om disse adfærdsmæssige ændringer kan forekomme i naturligt fiskebestande eller resultere i økologisk vigtige negative resultater. Selvom nyttigt for følsomme, diagnostisk screening formål, være larve fisk adfærdsmæssige tærskler ikke repræsentant for andre livshistorie faser eller fisk i naturlige populationer. Yderligere forskning er berettiget til at afgøre, om lignende adfærdsmæssige reaktion tærskler ville forekomme i naturen og være vejledende for negative resultater på de enkelte eller befolkning niveauer i biologiske organisation.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Support af denne undersøgelse blev leveret af den amerikanske National Science Foundation (projekt #: CHE-1339637) med yderligere støtte fra det amerikanske Environmental Protection Agency. Vi takke Dr. Jone Corrales, Dr. Lauren Kristofco, Gavin Saari, Samuel Haddad, Bekah Burket og Bridgett Hill for generelle lab støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViewPoint Zebrabox ViewPoint ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine Sigma-Aldrich C0750-100G Study chemical
Incubator VWR 9110589 Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator Thermo Fisher Scientific 35824-636 Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakers VWR 89000-200 Zebrafish exposure chambers 
500 mL glass beakers  Pyrex EW-34502-03 Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipette Eppendorf Research 5000 Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes VWR 414-004-004 Used to transfer study organisms 
48-well plates Fisher Scientific 08-772-52 Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates VWR 10062-896 Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate Sigma-Aldrich C3771 For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506 For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate  Sigma-Aldrich S5761 For reconstituted hard water
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For reconstituted hard water
z-mod recirculating system Marine Biotech Systems Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software Sigma Plot  Version 13.0 Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software Graphpad Prism Prism 5 Used to produce figures 
Autosampler/quaternary pumping system Agilent Technologies Infinity 1260 model  Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source Agilent Technologies Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer  Agilent Technologies Model 6420 Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)  Agilent Technologies 685775-914T Caffiene chromatography 
MassHunter Optimizer Software  Agilent Technologies Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaj, E., et al. Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).
  2. Schäfer, R. B., Kühn, B., Malaj, E., König, A., Gergs, R. Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems. Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).
  3. Andersen, M. E., Krewski, D. Toxicity testing in the 21st century: bringing the vision to life. Toxicological Sciences. 107 (2), 324-330 (2008).
  4. Rovida, C., Hartung, T. Re-evaluation of animal numbers and costs for in vivo tests to accomplish REACH legislation requirements for chemicals-a report by the transatlantic think tank for toxicology (t (4)). Altex. 26 (3), 187-208 (2009).
  5. Council, N. R. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , National Academies Press. (2007).
  6. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  7. Scholz, S., Fischer, S., Gündel, U., Küster, E., Luckenbach, T., Voelker, D. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment-applications beyond acute toxicity testing. Environmental Science and Pollution Research. 15 (5), 394-404 (2008).
  8. Fraysse, B., Mons, R., Garric, J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 63 (2), 253-267 (2006).
  9. Noyes, P. D., Haggard, D. E., Gonnerman, G. D., Tanguay, R. L. Advanced morphological-behavioral test platform reveals neurodevelopmental defects in embryonic zebrafish exposed to comprehensive suite of halogenated and organophosphate flame retardants. Toxicological Sciences. 145 (1), 177-195 (2015).
  10. Colón-Cruz, L., et al. Alterations of larval photo-dependent swimming responses (PDR): New endpoints for rapid and diagnostic screening of aquatic contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety. 147, 670-680 (2018).
  11. Kristofco, L. A., et al. Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine. Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).
  12. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327 (5963), 348-351 (2010).
  13. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).
  14. Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -O., Halden, R. U. Contaminants of Emerging Concern in the Environment: Ecological and Human Health Considerations. , ACS Publications. 257-273 (2010).
  15. Woudenberg, A. B., et al. Zebrafish embryotoxicity test for developmental (neuro) toxicity: Demo case of an integrated screening approach system using anti-epileptic drugs. Reproductive Toxicology. 49, 101-116 (2014).
  16. Rodríguez-Gil, J., Cáceres, N., Dafouz, R., Valcárcel, Y. Caffeine and paraxanthine in aquatic systems: Global exposure distributions and probabilistic risk assessment. Science of the Total Environment. 612, 1058-1071 (2018).
  17. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kristofco, L. A., Brooks, B. W. Global scanning of antihistamines in the environment: Analysis of occurrence and hazards in aquatic systems. Science of the Total Environment. 592, 477-487 (2017).
  20. Saari, G. N., Scott, W. C., Brooks, B. W. Global assessment of calcium channel blockers in the environment: Review and analysis of occurrence, ecotoxicology and hazards in aquatic systems. Chemosphere. , (2017).
  21. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  22. Berninger, J. P., et al. Effects of the antihistamine diphenhydramine on selected aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (9), 2065-2072 (2011).
  23. Brooks, B. W. Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later. Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).
  24. Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).
  25. Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. W. Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology. 55 (1-2), 23-34 (2001).
  26. Scheiner, S. M., Gurevitch, J. Design and Analysis of Ecological Experiments. , Oxford University Press. (2001).
  27. Nakagawa, S. A farewell to Bonferroni: the problems of low statistical power and publication bias. Behavioral Ecology. 15 (6), 1044-1045 (2004).
  28. Bean, T. G., et al. Pharmaceuticals in water, fish and osprey nestlings in Delaware River and Bay. Environmental Pollution. 232, 533-545 (2018).
  29. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behavioural Brain Research. 228 (1), 99-106 (2012).
  30. Padilla, S., Hunter, D., Padnos, B., Frady, S., MacPhail, R. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: Influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 624-630 (2011).
  31. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  32. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  33. Hutson, L. D., Liang, J. O. Making an impact: zebrafish in education. Zebrafish. 6, 119 (2009).
  34. Hutson, L. D., Liang, J. O., Pickart, M. A., Pierret, C., Tomasciewicz, H. G. Making a difference: education at the 10th international conference on zebrafish development and genetics. Zebrafish. 9 (4), 151-154 (2012).
  35. Kane, A., Salierno, J., Brewer, S. Fish models in behavioral toxicology: automated techniques, updates and perspectives. Methods in Aquatic Toxicology. 2, 559-590 (2005).
  36. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods in Ecology and Evolution. 9 (3), 460-464 (2018).
  37. Hamm, J., Wilson, B., Hinton, D. Increasing uptake and bioactivation with development positively modulate diazinon toxicity in early life stage medaka (Oryzias latipes). Toxicological Sciences. 61 (2), 304-313 (2001).
  38. Kristofco, L. A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).
  39. Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses. Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).

Tags

Miljøvidenskab udstede 137 adfærdsmæssige reaktion profilering adfærdsmæssige toksikologi zebrafisk tykhovedede Elritse koffein Neuro stimulerende
Forsøgsplan for behandlingen af adfærdsmæssige reaktion profiler i larve fisk: ansøgning til Neuro-stimulerende koffein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks,… More

Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine. J. Vis. Exp. (137), e57938, doi:10.3791/57938 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter