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लार्वा मछली में व्यवहार प्रतिक्रिया प्रोफाइल की जांच के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल: न्यूरो उत्तेजक कैफीन के लिए आवेदन

Published: July 24, 2018 doi: 10.3791/57938
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Summary

यहां, हम लार्वा zebrafish और fathead छोटी मछली हरकत गतिविधियों और एक स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग photomotor प्रतिक्रियाओं (पीएमआर) की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । जब आम विषविज्ञान में शामिल परख, इन व्यवहार के विश्लेषण के लिए रासायनिक जैव गतिविधि की जांच करने के लिए एक नैदानिक उपकरण प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल कैफीन, एक मॉडल neurostimulant का उपयोग कर वर्णित है ।

Abstract

मछली मॉडल और व्यवहार तेजी से जैव चिकित्सा विज्ञान में इस्तेमाल कर रहे हैं; हालांकि, मछली लंबे समय से पारिस्थितिक, शारीरिक और विषाक्तता अध्ययन का विषय रहा है । स्वचालित डिजिटल ट्रैकिंग प्लेटफार्मों का प्रयोग, neuropharmacology में हाल के प्रयासों लार्वा मछली हरकत व्यवहार लाभ के लिए उपंयास छोटे अणुओं के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान कर रहे हैं । इन प्रयासों के लिए इसी प्रकार, पर्यावरण विज्ञान और तुलनात्मक औषधि और विषविज्ञान में अनुसंधान के लिए मछली के मॉडलों के विभिंन व्यवहार की जांच कर रहा है उपकरणों के tiered मूल्यांकन में नैदानिक उपकरण और के लिए सतह के पानी की वास्तविक समय निगरानी contaminant धमकियां । जबकि zebrafish जैव चिकित्सा विज्ञान में एक लोकप्रिय लार्वा मछली मॉडल है, fathead छोटी मछली लार्वा में एक आम ecotoxicology मछली मॉडल है । दुर्भाग्यवश, fathead छोटी मछली लार्वा व्यवहारिक अध्ययनों में काफी कम ध्यान मिला है. यहां, हम विकसित करने और एक व्यवहार प्रोफ़ाइल एक मॉडल neurostimulant के रूप में कैफीन का उपयोग प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । हालांकि fathead minnows के photomotor प्रतिक्रियाओं कभी-कभार कैफीन से प्रभावित थे, zebrafish photomotor और हरकत अंतिमबिंदु, जो पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक स्तरों पर प्रतिक्रिया के लिए चिह्नित रूप से अधिक संवेदनशील थे । भविष्य के अध्ययन के लिए उम्र और दिन के समय के साथ मछली के बीच तुलनात्मक व्यवहार संवेदनशीलता मतभेदों को समझने की जरूरत है, और निर्धारित करने के लिए कि क्या इसी तरह व्यवहार प्रभाव प्रकृति में घटित होता है और व्यक्ति पर प्रतिकूल परिणामों का संकेत हो या जैविक संगठन की जनसंख्या का स्तर ।

Introduction

हालांकि मछली मॉडल तेजी से जैव चिकित्सा अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, मछली नियमित रूप से पारिस्थितिकी और शरीर विज्ञान के अध्ययन के लिए कार्यरत है, सतह के पानी के संदूषण की जांच करने के लिए, और रसायनों की विषाक्तता थ्रेसहोल्ड को समझते हैं । इस तरह के प्रयासों महत्वपूर्ण है क्योंकि रासायनिक संक्रमण जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों ख़राब और स्रोत पानी की आपूर्ति1,2की गुणवत्ता ख़तरे में डालना कर सकते हैं । वाणिज्य में रसायनों के अधिकांश, तथापि, कमी भी बुनियादी विषविज्ञान जानकारी3।

पशु मॉडल पारंपरिक नियामक विषाक्तता परीक्षण में प्रयोग किया जाता परख संसाधन गहन और उच्च प्रवाह प्रदान नहीं कर सकते हैं, प्रारंभिक स्तरीय स्क्रीनिंग 21 वीं सदी में विषाक्तता परीक्षण के लिए आवश्यक4। बाद में, वहां एक बढ़ती प्रोत्साहन को अपनाने और इन विट्रो मॉडल है कि और अधिक तेजी से और कुशलता से जैविक गतिविधियों के लिए स्क्रीन यौगिकों3,5कर सकते है उपयोग है । हालांकि सेल आधारित मॉडल कई अवसर मौजूद हैं, वे अक्सर जैविक जटिलता की कमी है, और इस तरह कई महत्वपूर्ण पूरे जीव प्रक्रियाओं के लिए खाते में नहीं है, चयापचय सहित6।

zebrafish एक आम जैव चिकित्सा पशु मॉडल है कि जलीय विषविज्ञान और ecotoxicology7,8में एक वैकल्पिक मॉडल के रूप में लोकप्रियता प्राप्त कर रहा है । उनके छोटे आकार, तेजी से विकास, और उच्च fecundity को देखते हुए, मछली के मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तेजी से और कुशलता से समग्र जीव9पैमाने पर प्रतिक्रिया और विषाक्तता के लिए रसायनों स्क्रीन । स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की सहायता के साथ, लार्वा zebrafish व्यवहार विषाक्तता के लिए स्क्रीनिंग संदूषण में बढ़ाया नैदानिक उपयोगिता प्रदान करता है10,11. दवा विज्ञान में अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि हरकत अंतिमबिंदु कार्रवाई की रासायनिक तंत्र के जानकारीपूर्ण रहे हैं, phenotype व्यवहार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और फिर अंतरिम रूप से उपंयास अणुओं12के लिए सेलुलर लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं, 13. जबकि zebrafish जैव चिकित्सा विज्ञान में एक लोकप्रिय लार्वा मछली मॉडल है, fathead छोटी मछली एक आम, पारिस्थितिकी महत्वपूर्ण मछली मॉडल है कि ecotoxicology अध्ययन के लिए और भावी के दौरान प्रयोग किया जाता है (जैसे, नई रासायनिक मूल्यांकन) और पूर्वव्यापी (उदा., परिवेशी सतह जल या अपशिष्ट प्रवाह निर्वहन निगरानी) पर्यावरणीय आकलन । दुर्भाग्य से, लार्वा fathead minnows के व्यवहार प्रतिक्रियाओं zebrafish से स्पष्ट रूप से कम ध्यान मिला है । हमारे दो आम लार्वा मछली मॉडल, zebrafish और fathead छोटी मछली के साथ चल रहे अनुसंधान से पता चलता है कि लार्वा मछली तैराकी पैटर्न विविध रसायनों के लिए प्रत्याशित मोड या कार्रवाई के तंत्र के लिए अद्वितीय दिखाई देते हैं । इस प्रकार, व्यवहार अंतिमबिंदु तेजी से और संवेदनशील विषाक्तता के लिए रसायनों की जांच करने के लिए और औद्योगिक रासायनिक और अन्य पदार्थों के लिए उपसेलुलर लक्ष्यों की पहचान करने के लिए, विशेष रूप से प्रारंभिक स्तरीय आकलन के दौरान क्षमता प्रदान करते हैं ।

यहां, हम लार्वा मछली में व्यवहार प्रतिक्रिया प्रोफाइल की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट । हम इन कैफीन, एक मॉडल neurostimulant और एक आम जलीय contaminant है कि अपशिष्ट जल उपचार संयंत्रों से मुक्ति के माध्यम से जलीय प्रणालियों के लिए शुरू की है का उपयोग कर तरीकों का प्रदर्शन खाद्य पदार्थ, पेय पदार्थों के मानव उपभोग के बाद, और फार्मास्यूटिकल्स14कैफीन के साथ तैयार की । हम दोनों लार्वा zebrafish और fathead छोटी मछली, जिसमें अक्सर भ्रूण और photomotor के साथ दवा की पढ़ाई के दौरान एक पीएमआर प्रतिक्रिया (लार्वा) के रूप में जाना जाता है प्रकाश व्यवस्था में अचानक परिवर्तन करने के लिए सहित में कैफीन के लिए व्यवहार प्रतिक्रियाओं की जांच zebrafish13,15. हम आगे कई हरकत अंतिमबिंदु भर में कैफीन के प्रभाव की पहचान करने के लिए प्रत्येक मछली मॉडल के लिए रासायनिक प्रतिक्रिया प्रोफाइल विकसित करना । कैफीन उपचार का स्तर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया जोखिम वितरण के ऊपरी centiles कैफीन16के मापा पर्यावरणीय मूल्यों के आधार पर प्रतिनिधित्व करते हैं । हम भी लार्वा मछली LC५० मूल्यों के लिए बेंचमार्क उपचार शामिल हैं, और चिकित्सीय जोखिम मूल्य (THV), पानी में एक दवा एकाग्रता है कि एक मानव चिकित्सीय प्लाज्मा खुराक के अनुरूप मछली में प्लाज्मा स्तर में परिणाम प्रत्याशित है ।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में अध्ययन आम तौर पर मानकीकृत प्रयोगात्मक डिजाइन का पालन करें और अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (EPA no. २०००.०) fathead minnows के लिए और आर्थिक सहयोग के लिए संगठन से सांख्यिकीय विश्लेषण के दिशा निर्देशों की सिफारिश की और zebrafish के लिए विकास (ओईसीडी नं. २३६) । इन प्रायोगिक डिजाइनों (जैसे, बढ़ती प्रतिकृति) भविष्य के अध्ययन के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल के भीतर संशोधित किया जा सकता है । मछली संस्कृति की स्थिति पहले प्रकाशित17साहित्य का पालन करें । सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं और मछली संस्कृति प्रोटोकॉल Baylor विश्वविद्यालय में अनुमोदित संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल का पालन किया ।

1. रासायनिक उपचार के लिए मछली को उजागर

  1. गठन मुश्किल पानी में कैफीन को भंग करके कैफीन जोखिम समाधान तैयार करें । कम कैफीन उपचार के स्तर का उत्पादन करने के लिए कठिन पानी के साथ उच्च कैफीन उपचार कमजोर द्वारा उचित धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन ।
    नोट: 1 तालिका इस प्रयोग में उपयोग किए गए प्रत्येक उपचार स्तर को सारांशित करती है ।
Zebrafish Fathead छोटी मछली
उपचार नाममात्र कैफीन एकाग्रता (mg/ मापा कैफीन एकाग्रता (mg/ उपचार नाममात्र कैफीन एकाग्रता (mg/ मापा कैफीन एकाग्रता (mg/
नियंत्रण 0 < लोद नियंत्रण 0 < लोद
75 Centile * ०.००१ ०.००१ 75 Centile * ०.००१ ०.००१
95th Centile * ०.०३९ ०.०१३ 95th Centile * ०.०३९ ०.००९
99th Centile * ०.४१२ ०.३६१ 99th Centile * ०.४१२ ०.३१०
THV ४.०७ ३.८१ THV ४.०७ ४.१२
10% LC50 ४८.४६ ४६.६६ 10% LC50 १४.१ १४.७
४०% LC50 १९३.८२ १८६.६७ ४०% LC50 ५६.३८ ५३.९१

तालिका 1: zebrafish और fathead छोटी मछली प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक कैफीन उपचार. प्रत्येक उपचार के लिए कैफीन की नाममात्र और मापा मूल्यों दिया जाता है । * इस अध्ययन में प्रयुक्त कैफीन उपचार कैफीन16के मापा पर्यावरणीय मूल्यों के आधार पर जोखिम वितरण के ऊपरी centiles का प्रतिनिधित्व करते हैं । THV: चिकित्सकीय खतरा मान । लोद: पता लगाने की सीमा

  1. व्यक्तिगत जोखिम विजेता में तैयार समाधान डालो । fathead छोटी मछली एक्सपोजर चैंबर्स के लिए एक्सपोजर सॉल्यूशन के २०० मिलीलीटर के साथ zebrafish एक्सपोजर चैंबर्स और ५०० एमएल यूरिन के लिए एक्सपोजर सॉल्यूशन के 20 एमएल से भरे १०० मिलीलीटर ग्लास यूरिन का उपयोग करें ।
  2. एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करना, जगह 10 zebrafish भ्रूण 4 आयु वर्ग के चार में से प्रत्येक में 6 ज पद निषेचन (hpf) उपचार के प्रति एक प्रदर्शन की नकल चैंबर ।
  3. प्लेस 10 fathead छोटी मछली तीन में से प्रत्येक में सेने के उपचार के प्रति जोखिम कक्षों को दोहराने के 24 घंटे के भीतर लार्वा । fathead छोटी मछली लार्वा के बड़े आकार को समायोजित करने के लिए, स्थानांतरण से पहले पिपेट स्थानांतरण की नोक काट दें ।
  4. एक 16:8 एच प्रकाश में zebrafish प्रयोगों को बनाए रखने: डार्क photoperiod और 28 ± 1 ° c के एक निरंतर तापमान. fathead छोटी मछली अध्ययन के लिए एक ही photoperiod शासन का प्रयोग करें, लेकिन 25 ± 1 ° c के तापमान पर ।
  5. रासायनिक जोखिम के ९६ एच के बाद, ४८ के अलग कुओं में व्यक्तिगत मछली लोड (zebrafish के लिए) और 24 (fathead छोटी मछली के लिए) अच्छी तरह से प्लेटें ।
    1. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से समाधान की एक बराबर मात्रा में है, zebrafish लार्वा ४८ अच्छी तरह से एक १,००० µ एल मात्रा के लिए एक ५,००० µ l autopipette का उपयोग कर प्लेटों हस्तांतरण । zebrafish लार्वा और एक्सपोज़र सॉल्यूशन दोनों को एक साथ वापस लेने और स्थानांतरित करने के लिए autopipette का उपयोग करें ।
    2. उनके बड़े आकार के कारण, fathead छोटी मछली लार्वा के स्थानांतरण पिपेट के साथ एक हस्तांतरण का उपयोग कर बंद टिप कट । व्यक्तिगत कुओं के लिए fathead छोटी मछली लार्वा स्थानांतरित करने से पहले, एक अच्छी तरह से २,००० µ एल एक autopipette का उपयोग कर भरें । जब कुओं के लिए व्यक्तिगत fathead लार्वा स्थानांतरित, अच्छी तरह से समाधान में स्थानांतरण पिपेट की नोक जगह और मछली पिपेट टिप से अच्छी तरह से तैरने के लिए अनुमति देते हैं ।

2. वीडियो ट्रैकिंग मापदंडों के अंशांकन

  1. व्यवहार के उपायों से पहले, सेट अवलोकन और वीडियो ट्रैक सॉफ्टवेयर में अंशांकन मापदंडों (सामग्री की तालिका देखें).
    1. रिकॉर्डिंग चैंबर में एक अच्छी तरह से एक व्यक्ति में कम से कम 1 लार्वा मछली के साथ एक कुआं प्लेट रखें । थाली और संबंधित मछली के रूप में प्रतिनिधित्व करने के लिए अंशांकन मापदंडों सेट का उपयोग करें ।
    2. वीडियो ट्रैक सॉफ्टवेयर में क्लिक करें "फ़ाइल । प्रोटोकॉल उत्पंन ", जो एक" प्रोटोकॉल निर्माण जादूगर "संवाद बॉक्स खुल जाएगा । "स्थान गणना" क्षेत्र में, चहेतों की थाली के कुओं की संख्या दर्ज करें और फिर "ठीक" पर क्लिक करे ।
    3. स्क्रीन के शीर्ष पर, "दृश्य | पूर्ण स्क्रीन ", जो प्रणाली के लिए अच्छी तरह से थाली के एक उपरि कैमरा दृश्य प्रदर्शित करने का संकेत होगा ।
    4. "क्षेत्र ड्रा" आइकन पर क्लिक करें, जो तीन बहुरंगी आकृतियों के रूप में प्रकट होता है । अच्छी तरह से थाली देखने क्षेत्र के अधिकार के लिए, "क्षेत्रों" लेबल क्षेत्र में सर्कल आइकन का चयन करें ।
    5. शीर्ष में परिपत्र वीडियो ट्रैकिंग क्षेत्र चित्रित अच्छी तरह से प्लेट की अच्छी तरह से छोड़ दिया करने के लिए कर्सर का उपयोग करें । चुनें "शीर्ष सही निशान" और फिर ऊपर सही अच्छी तरह से देखने के क्षेत्र रूपरेखा । फिर, नीचे सही अच्छी तरह से नीचे की रूपरेखा के लिए "नीचे मार्क" का चयन करें ।
      नोट: परिपत्र रूपरेखा ड्राइंग के बाद, अपनी स्थिति की संभावना को समायोजित करने की आवश्यकता होगी ।  बाह्यरेखा की स्थिति समायोजित करने के लिए, "चुनें" क्लिक करें और तब बाह्यरेखांकित क्षेत्र को ले जाने के लिए कर्सर का उपयोग करे । इसके अलावा, रूपरेखा पर क्लिक करके दोहराया जा सकता है "कॉपी" और फिर "चिपकाएं" ।
    6. ऊपर छोड़ दिया, ऊपर सही है, और नीचे सही अच्छी तरह से क्षेत्रों पर नज़र रखने के बाद परिभाषित किया गया है, क्लिक करें "बनाएं" सॉफ्टवेयर के लिए संकेत करने के लिए स्वचालित रूप से शेष कुओं के संभावत क्षेत्रों चित्रित ।
    7. "अंशांकन" लेबल क्षेत्र में, "स्केल ड्रा" पर क्लिक करें । प्लेट में एक क्षैतिज रेखा खींचने के लिए कर्सर का उपयोग करें । एक बार रेखा तैयार की है, एक संवाद बॉक्स लेबल "अंशांकन माप" दिखाई देगा । अच्छी तरह से प्लेट की लंबाई दर्ज करें और "ठीक है" ।
    8. "क्षेत्र आरेखित करें" चिह्न पर क्लिक करके आरेखण प्रबंधक से बाहर निकलें ।
    9. "टाइल्स" आइकन पर क्लिक करें ।  कर्सर का उपयोग करके, प्रत्येक बॉक्स हरा है ताकि देखने स्क्रीन पर प्रकट होने वाले सभी बक्सों को हाइलाइट करें ।
      नोट: टाइल्स आइकन छह व्यक्तिगत छोटे चौकों के एक समूह के रूप में प्रकट होता है
    10. "दृश्य क्लिक करें | पूर्ण स्क्रीन "।  प्लेट देखने क्षेत्र के दाईं ओर, "डिटेक्शन थ्रेशोल्ड" लेबल वाले बॉक्स में "Bkg" पर क्लिक करें. पिक्सेल डिटेक्शन थ्रेशोल्ड सेट करने के लिए थ्रेशोल्ड समायोजन पट्टी का उपयोग करें. एक बार, उपयुक्त पिक्सेल डिटेक्शन थ्रेशोल्ड चयनित है, "समूह पर लागू करें" क्लिक करे ।
      नोट: यह प्रोटोकॉल खोज थ्रेशोल्ड 13 पर zebrafish अवलोकन के लिए काले मोड में और ११० पर fathead छोटी मछली अवलोकन के लिए पारदर्शी मोड में सेट करता है ।
    11. "आंदोलन थ्रेसहोल्ड" लेबल बॉक्स में, वांछित आंदोलन गति ट्रैकिंग मापदंडों दर्ज करें । एक बार गति मापदंडों सेट कर रहे हैं, पर क्लिक करें "समूह के लिए लागू".
      नोट: यह प्रोटोकॉल छोटे/बड़े आंदोलनों पर 20 mm/s और निष्क्रिय/छोटे आंदोलनों में 5 mm/ ये चयन कार्यक्रम तीन अलग गति स्तरों पर लार्वा मछली आंदोलन ट्रैक करने के लिए सॉफ्टवेयर: निष्क्रिय (ठंड) = < 5 mm/s, छोटे (मंडरा) = 5 – 20 मिमी/एस, और बड़े (फोड़) = > 20 मिमी/
    12. क्लिक करें "पैरामीटर । प्रोटोकॉल पैरामीटर "ड्रॉप-डाउन मेनू से । संवाद बॉक्स में, "समय" टैब का चयन करें. अवलोकन समय और एकीकरण समय दर्ज करें । पैरामीटर दर्ज कर रहे है के बाद क्लिक करें "ठीक है."
    13. प्रकाश/डार्क photoperiod बार और प्रत्येक photoperiod के लिए प्रकाश की तीव्रता सेट करने के लिए "पैरामीटर" ड्रॉप डाउन मेनू से "लाइट ड्राइविंग" का चयन करके प्रकाश ड्राइवर सेटिंग्स संवाद बॉक्स खोलें ।
      नोट: एकाधिक लाइट-डार्क photoperiods सेट करने के लिए प्रोटोकॉल वीडियो देखें.
    14. वीडियो ट्रैकिंग पैरामीटर्स सेट किए जाने के बाद, अवलोकन प्रोटोकॉल सहेजें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल एक ५० मिनट की अवधि है कि एक 10 मिनट acclimation 4 फेरबदल प्रकाश/अंधेरे २ १० मिनट प्रकाश समय और २ १० मिनट अंधेरे समय से मिलकर चरणों द्वारा पीछा चरण भी शामिल है पर मछली व्यवहार का निरीक्षण । एकीकरण समय ५० ंयूनतम व्यवहार परीक्षण के प्रत्येक मिनट के लिए व्यवहार को मापने के लिए सेट है ।

3. लार्वा मछली हरकत और Photomotor व्यवहार का अवलोकन

  1. अच्छी तरह से व्यवहार रिकॉर्डिंग चैंबर में प्रयोगात्मक मछली युक्त थाली प्लेस ।
  2. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में, चरण 3 में विकसित ट्रैकिंग प्रोटोकॉल खोलें.
  3. वीडियो ट्रैकिंग व्यूअर में, यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि सभी लार्वा कंप्यूटर स्क्रीन पर दिखाई दे रहे हैं, जो प्रत्येक कुआं में केवल एक व्यक्ति लार्वा मौजूद है, और यह कि व्यक्तिगत कुओं को अवलोकन क्षेत्रों में संरेखित किया गया है जो चरण 2.1.5 और 2.1.6 में परिभाषित किए गए हैं ।
  4. पर क्लिक करें "प्रयोग | निष्पादित करें "।
    नोट: सिस्टम उपयोगकर्ता एक नाम और स्थान अवलोकन डेटा को सहेजने के लिए प्रदान करने के लिए संकेत देगा ।
  5. एक बार नाम और अवलोकन डेटा के स्थान को बचाने के लिए निर्दिष्ट किया गया है, "कई लाइव छवियाँ" आइकन पर क्लिक करें सभी पूर्व परिभाषित देखने के क्षेत्रों को उजागर करने के लिए
    नोट: यह चिह्न कंप्यूटर स्क्रीन के शीर्ष पर स्थित है और चार छोटे चौकोरों में विभाजित बॉक्स के रूप में दिखाई देता है । इस आइकन पर क्लिक करने से सभी पूर्व परिभाषित देखने के क्षेत्रों पर प्रकाश डाला जाएगा ।
  6. रिकॉर्डिंग चैंबर के पैनल को बंद करें और "पृष्ठभूमि | कंप्यूटर मॉनीटर पर प्रारंभ करें ।

4. व्यवहार डेटा का विश्लेषण करना

  1. लार्वा मछली गतिविधि डेटा पुनः प्राप्त करने के लिए, स्प्रेडशीट, जो स्वचालित रूप से ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर द्वारा संकलित है और व्यवहार परीक्षण (चरण ३.४) की शुरुआत करने से पहले उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट फ़ोल्डर में खुला है ।
  2. क्रमशः unexposeded zebrafish और fathead छोटी मछली लार्वा की भोली हरकत गतिविधि के प्रतिनिधि माप के लिए आंकड़े 1a और 1b का संदर्भ लें । पीएमआर गणना, जो प्रभावी ढंग से प्रकाश संक्रमण के लिए अंधेरे या अंधेरे को प्रकाश के बीच आंदोलन के अंतर की भयावहता की जांच के लिए 1C और 1 डी आंकड़े देखें ।

Figure 1
चित्रा 1: उजागर zebrafish की आधारभूत गतिविधि का उदाहरण (A और B) और fathead छोटी मछली (C और D). मतलब (± SEM) zebrafish के लिए दूरी झंझावात (क) और fathead छोटी मछली (सी) प्रत्येक गतिविधि के एक मिनट के अंतराल का प्रतिनिधित्व डॉट्स द्वारा दिया जाता है । दो काले और दो photomotor प्रतिक्रियाओं के प्रकाश समय मापा जाता है । पिछले (क, सी, ई, और जी) और पहले (b, d, f, और h) प्रत्येक photoperiod के मिनट PMRs की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है । zebrafish के Photomotor प्रतिक्रियाओं (ख) और fathead छोटी मछली (डी) मतलब में परिवर्तन के रूप में मापा जाता है (± SEM) दूरी अंतिम मिनट के बीच कूच के एक प्रारंभिक photoperiod और निंनलिखित अवधि के पहले मिनट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Representative Results

कैफीन उपचार स्तर appreciably zebrafish और fathead minnows के साथ ९६ एच प्रयोगों के दौरान भिन्न नहीं था. उदाहरण के लिए, तालिका 1 प्रत्येक उपचार स्तर के विश्लेषणात्मक सत्यापित सांद्रता प्रस्तुत करता है । इस प्रोटोकॉल को सत्यापित पानी के नमूनों के लिए कैफीन उपचार के स्तर से आइसोटोप-कमजोर पड़ने तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ms/ paraxanthine के गठन, कैफीन की प्राथमिक metabolite भी quantified था । पूरक विश्लेषणात्मक जानकारी में इन विश्लेषणात्मक कार्यविधि का विवरण प्रदान किया गया है । उपचार के नाममात्र और विश्लेषणात्मक सत्यापन के बीच समानता की वजह से, नाममात्र के उपचार के स्तर इस पांडुलिपि के शेष भर में प्रस्तुत कर रहे हैं । कैफीन काफी बदल zebrafish और fathead छोटी मछली व्यवहार । हालांकि, zebrafish हरकत प्रतिक्रियाओं fathead minnows की तुलना में कैफीन के लिए लगातार अधिक संवेदनशील थे । zebrafish और fathead छोटी मछली लार्वा के लिए सबसे संवेदनशील व्यवहार अंतिमबिंदु ०.०३९ मिलीग्राम/L की एकाग्रता पर कैफीन से प्रभावित थे तालिका 2 संक्षेप में देखा प्रभाव सांद्रता (LOECs) और नहीं मनाया प्रभाव सांद्रता (NOECs) दोनों मछली मॉडल में प्रत्येक व्यवहार समापन बिंदु के लिए ।

Zebrafish Fathead छोटी मछली
समापन बिंदु LOEC (mg/ NOEC (mg/ समापन बिंदु LOEC (mg/ NOEC (mg/
कुल दूरी डार्क ०.४१२ ०.०३९ कुल दूरी डार्क − ५६.३८
कुल दूरी प्रकाश ४८.४६ ४.०७ कुल दूरी प्रकाश − ५६.३८
कुल गिनती डार्क ०.४१२ ०.०३९ कुल गिनती डार्क − ५६.३८
कुल गिनती प्रकाश ४८.४६ ४.०७ कुल गिनती प्रकाश − ५६.३८
फट दूरी अंधेरा − १९३.८२ फट दूरी अंधेरा − ५६.३८
दूरी प्रकाश फटा जा रहा है १९३.८२ ४८.४६ दूरी प्रकाश फटा जा रहा है − ५६.३८
पटाखे गिना रहा अंधेरा १९३.८२ ४८.४६ पटाखे गिना रहा अंधेरा − ५६.३८
फटना गिनती प्रकाश १९३.८२ ४८.४६ फटना गिनती प्रकाश − ५६.३८
फट अवधि डार्क १९३.८२ ४८.४६ फट अवधि डार्क − ५६.३८
अवधि प्रकाश फटा जा रहा है − १९३.८२ अवधि प्रकाश फटा जा रहा है − ५६.३८
दूरी अंधेरा मंडरा ०.४१२ ०.०३९ दूरी अंधेरा मंडरा − ५६.३८
दूरी प्रकाश मंडरा ४८.४६ ४.०७ दूरी प्रकाश मंडरा − ५६.३८
मंडराता है गिनती अंधेरा ०.४१२ ०.०३९ मंडराता है गिनती अंधेरा − ५६.३८
गिनती प्रकाश मंडरा ४८.४६ ४.०७ गिनती प्रकाश मंडरा − ५६.३८
उंचे अंधेरे मंडरा ०.४१२ ०.०३९ उंचे अंधेरे मंडरा − ५६.३८
उंचे प्रकाश मंडरा ४८.४६ ४.०७ उंचे प्रकाश मंडरा − ५६.३८
ठंड से दूरी डार्क ०.४१२ ०.०३९ ठंड से दूरी डार्क ०.०३९ ०.००१
ठंड दूरी प्रकाश ०.०३९ ०.००१ ठंड दूरी प्रकाश − ५६.३८
ठंड से गिनाएं अंधेरा ०.४१२ ०.०३९ ठंड से गिनाएं अंधेरा − ५६.३८
ठंड गिनती प्रकाश ४८.४६ ४.०७ ठंड गिनती प्रकाश − ५६.३८
जमने अवधी अँधेरा − १९३.८२ जमने अवधी अँधेरा ५६.३८ १४.१०
ठंड की अवधि हल्की ४८.४६ ४.०७ ठंड की अवधि हल्की − ५६.३८
गहरा 1 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ गहरा 1 पीएमआर ०.०३९ ०.००१
हल् का 1 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ हल् का 1 पीएमआर − ५६.३८
गहरा 2 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ गहरा 2 पीएमआर − ५६.३८
हल् का 2 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ हल् का 2 पीएमआर − ५६.३८
फट गहरा 1 पीएमआर − १९३.८२ फट गहरा 1 पीएमआर − ५६.३८
लाइट फट 1 पीएमआर − १९३.८२ लाइट फट 1 पीएमआर − ५६.३८
फट गहरा 2 पीएमआर १९३.८२ ४८.४६ फट गहरा 2 पीएमआर − ५६.३८
लाइट फट 2 पीएमआर − १९३.८२ लाइट फट 2 पीएमआर − ५६.३८
मंडरा अंधेरा 1 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ मंडरा अंधेरा 1 पीएमआर − ५६.३८
प्रकाश मंडरा 1 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ प्रकाश मंडरा 1 पीएमआर − ५६.३८
मंडरा अंधेरा 2 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ मंडरा अंधेरा 2 पीएमआर − ५६.३८
प्रकाश मंडरा 2 पीएमआर १९३.८२ ४८.४६ प्रकाश मंडरा 2 पीएमआर ५६.३८ १४.१०
फ्रीज डार्क 1 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ फ्रीज डार्क 1 पीएमआर − ५६.३८
ठंड में हल्का 1 पीएमआर १९३.८२ ४८.४६ ठंड में हल्का 1 पीएमआर − ५६.३८
फ्रीज डार्क 2 पीएमआर ४८.४६ ४.०७ फ्रीज डार्क 2 पीएमआर − ५६.३८
ठंड प्रकाश 2 पीएमआर १९३.८२ ४८.४६ ठंड प्रकाश 2 पीएमआर − ५६.३८

तालिका 2: Zebrafish और fathead छोटी मछली व्यवहार NOECs और कैफीन के लिए LOECs । कोई प्रभाव एकाग्रता (NOEC) और सबसे कम मनाया प्रभाव एकाग्रता (LOEC) (mg/L) प्रकाश/अंधेरे तैराकी गतिविधि अंतिमबिंदु और zebrafish और fathead minnows के लिए photomotor प्रतिक्रियाओं के लिए मूल्यों के प्रत्येक के लिए मूल्य कैफीन को उजागर । डैश संकेत है कि कोई प्रभाव सभी उपचार के स्तर में एक विशेष समापन बिंदु पर स्वीकार्य थे ।

चित्रा 2 कैफीन के लिए कुल हरकत गतिविधि और PMRs zebrafish और fathead छोटी मछली के बाद ९६ ज जोखिम प्रस्तुत करता है । Fathead छोटी मछली लार्वा PMRs कम उपचार के स्तर पर कैफीन द्वारा बदल रहे थे (०.०३८ mg/L) zebrafish से, लेकिन photomotor अंतिमबिंदु के एक स्पष्ट रूप से बड़ी संख्या zebrafish में प्रभावित थे । कैफीन का उच्चतम उपचार स्तर (१९३.८२ मिलीग्राम/L) zebrafish में बदल पीएमआर, जिसमें इन प्रतिक्रियाओं नियंत्रण से बिल्कुल विपरीत थे. इस उच्च उपचार के स्तर पर, हालांकि, PMRs अंधेरे में कमी आई और प्रकाश की स्थिति में वृद्धि हुई है ।

Figure 2
चित्रा 2: तैराकी गतिविधि और zebrafish के photomotor प्रतिक्रियाओं (ए और बी) और fathead छोटी मछली (सी और डी) के बाद ९६ ज कैफीन के लिए जोखिम । मतलब (± SEM) zebrafish के लिए दूरी झंझावात (क) और fathead छोटी मछली (सी) गतिविधि के 1-ंयूनतम अंतराल का प्रतिनिधित्व डॉट्स द्वारा दिया जाता है । zebrafish के Photomotor प्रतिक्रियाओं (ख) और fathead छोटी मछली (डी) मतलब में परिवर्तन के रूप में मापा जाता है (± SE) कुल दूरी एक प्रारंभिक photoperiod के अंतिम मिनट और निंनलिखित अवधि के पहले मिनट के बीच कूच । दो अंधेरे और दो प्रकाश अवधि photomotor प्रतिक्रियाओं मापा गया । कुल 24 (4 6 लार्वा की प्रतिकृतियां) zebrafish और 12 (3 4 लार्वा की प्रतिकृतियां) fathead minnows व्यवहार अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया गया । *p < 0.10; * * p < 0.05; p < 0.01. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लार्वा PMRs को मापने के अलावा, प्रकाश और अंधेरे हरकत गतिविधि दूरी चले गए, आंदोलनों की संख्या, और आंदोलनों की अवधि के लिए तीन गति थ्रेसहोल्ड भर में विश्लेषण किया गया था. यह डेटा कैफीन (चित्रा 3, पूरक चित्रा 1) के लिए व्यवहार प्रतिक्रिया प्रोफाइल विकसित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । दोनों मछली के मॉडल में, कैफीन बाधित गतिविधि पर सभी काफी प्रभावित हरकत अंतिमबिंदु । दोनों मछली मॉडल कैफीन के लिए जोखिम के बाद फट गति थ्रेसहोल्ड में वृद्धि की गतिविधि का प्रदर्शन किया, हालांकि काफी नहीं है । पीएमआर टिप्पणियों के परिणामों के समान, कैफीन zebrafish हरकत अंतिमबिंदु की एक बड़ी संख्या को प्रभावित । वास्तव में, कैफीन काफी THV नीचे पर्यावरण की दृष्टि से यथार्थवादी स्तर पर अंधेरे शर्तों के तहत कई हरकत प्रतिक्रियाओं बदल दिया है । हालांकि, fathead छोटी मछली हरकत गतिविधि किसी भी उपचार के स्तर से प्रकाश शर्तों के तहत काफी प्रभावित नहीं था ।

Figure 3
चित्रा 3: कैफीन के लिए ९६ एच जोखिम के बाद लार्वा zebrafish और fathead minnows की प्रतिक्रिया प्रोफाइल । मतलब zebrafish डार्क (ए) और प्रकाश (बी) तैराकी गतिविधि मतलब fathead छोटी मछली डार्क (सी) और प्रकाश (डी) गतिविधि के बाद ९६ एच कैफीन के लिए जोखिम की तुलना में । प्लॉट किए गए डेटा प्रत्येक मछली मॉडल के लिए २ १० मिनट डार्क photoperiods और २ १० मिनट लाइट photoperiods पर गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है । डेटा को नियंत्रित करने के लिए सामान्यीकृत है, जो प्रत्येक संख्या में 0 अक्ष पर प्रस्तुत किया जाता है । व्यवहार पैरामीटर्स में शामिल है दूरी झंझावात, आंदोलनों की संख्या (गिनती), और 3 गति के स्तर के पार प्रत्येक आंदोलन की अवधि, (> 20 मिमी/एस), मंडरा (5-20 mm/एस), और ठंड (< 5 mm/ गति सीमा, कुल दूरी झंझावात, और आंदोलनों की कुल संख्या में से प्रत्येक पर आंदोलन पैटर्न के अलावा प्रतिनिधित्व किया है । ↑ नियंत्रण की तुलना में गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रतिनिधित्व करता है और ↓ नियंत्रण की तुलना में गतिविधि में उल्लेखनीय कमी को इंगित करता है. कुल 24 (4 प्रत्येक 6 लार्वा की प्रतिकृति) zebrafish और 12 (3 4 लार्वा की प्रतिकृतियां) fathead छोटी मछली जहां प्रत्येक समूह के लिए व्यवहार टिप्पणियों में इस्तेमाल किया । *p < 0.10; * * p < 0.05; p < 0.01. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक चित्रा 1: zebrafish (A और B) और fathead छोटी मछली (C और D) की तीन गति सीमाओं के पार Photomotor प्रतिक्रियाएं । Zebrafish (ए, बी, और सी) और fathead छोटी मछली लार्वा (डी, ई, और एफ) photomotor प्रतिक्रियाओं भर तीन गति थ्रेसहोल्ड (ठंड: 20 mm/एस) के 96hr एक्सपोजर के बाद कैफीन । zebrafish और fathead छोटी मछली के Photomotor प्रतिक्रियाओं मतलब में परिवर्तन के रूप में मापा जाता है (± SE) कुल दूरी एक प्रारंभिक photoperiod के अंतिम मिनट और निंनलिखित अवधि के पहले मिनट के बीच कूच । दो अंधेरे और दो प्रकाश अवधि photomotor प्रतिक्रियाओं मापा गया । कुल 24 (4 में से प्रत्येक 6 लार्वा की प्रतिकृति) zebrafish और 12 (4 लार्वा की प्रतिकृति 3) fathead minnows व्यवहार अवलोकन के लिए उपयोग किया गया था । * p < 0.01 कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

जब व्यवहार विषविज्ञान अध्ययन के लिए रासायनिक उपचार के स्तर का चयन, कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए । वर्तमान अध्ययन में कैफीन उपचार स्तर अपशिष्ट प्रवाह16से अनुमानित पर्यावरणीय जोखिम परिदृश्यों के लिए ऊपरी centile मूल्यों के आधार पर चयन किया गया । जब संभव हो, हम नियमित रूप से जलीय विषविज्ञान अध्ययन के लिए उपचार के स्तर का चयन पर्यावरण प्रेक्षणों के संभाव्य जोखिम आकलन19,20,21। एक THV, जो दवाओं के लिए calculable है, को भी वर्तमान अध्ययन में उपचार स्तर के रूप में शामिल किया गया था । THV मान (Eq .1)22,23 की भविष्यवाणी की जल सांद्रता के रूप में परिभाषित कर रहे हैं23मछली में मानव चिकित्सीय खुराक (सीमैक्स) फार्मास्यूटिकल्स के लिए अग्रणी, प्रारंभिक प्लाज्मा मॉडलिंग24प्रयासों से प्रेरित कर रहे हैं, और कर रहे हैं रक्त के आधार पर गणना: जल रासायनिक विभाजन गुणांक (Eq .2)25.

THV = Cमैक्स /लॉग PBW (Eq .1)

लाग PBW = लाग [(10०.७३. log Kow · 0.16) + 0.84] (Eq .2)

यहां, हम भी zebrafish और fathead छोटी मछली LC50 मूल्यों के सापेक्ष घातक उपचार के स्तर का चयन करें । हम इस दृष्टिकोण व्यवहार प्रतिक्रियाओं के लिए एक उपयोगी बेंचमार्किंग प्रक्रिया पर विचार, विशेष रूप से जब कई रसायनों भर में एक मछली मॉडल के साथ विशिष्ट व्यवहार की थ्रेसहोल्ड की तुलना. यह आगे जीर्ण अनुपात के लिए तीव्र की गणना की सुविधा है, जो नैदानिक यंत्रवत अध्ययन और आकलन के लिए जलीय विषविज्ञान में उपयोगी हो सकता है । LC50 मूल्यों प्रारंभिक विषाक्तता से मानकीकृत कदम २.१ में दिए गए दिशा निर्देशों का पालन परख प्राप्त किए गए ।

इस प्रोटोकॉल में, हम आम प्रयोगात्मक डिजाइन और सांख्यिकीय मछली मॉडल के साथ विषविज्ञान अध्ययन के लिए अमेरिका EPA और ओईसीडी मानकीकृत तरीकों से सिफारिश की तकनीक को रोजगार । यद्यपि हम p मानों (उदा., < 0.01, < 0.05, < 0.10) की रिपोर्ट करते हैं, गतिविधि स्तरों में महत्वपूर्ण अंतर (α = ०.१०), प्रसरण (ANOVA) के विश्लेषण का उपयोग करके उपचार के बीच पहचाना जाता है यदि सामांयता और प्रसरण मान्यताओं का तुल्य मिले हैं । Dunnett है या Tukey के एचएसडी पोस्ट हॉक परीक्षण उपचार स्तर मतभेदों की पहचान करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । हम इस अल्फा का चयन करें (α = ०.१०) मूल्य प्रकार द्वितीय त्रुटियों को कम करने के लिए, विशेष रूप से जल्दी स्तरीय परख के लिए और जब जैविक रूप से महत्वपूर्ण प्रभाव आकार की समझ के लिए सीमित है अध्ययन व्यवहार अंतिमबिंदु और मॉडल जीव26, के बजाय कई तुलना के लिए जैव चिकित्सा विज्ञान में और अधिक आम प्रक्रियाओं को रोजगार (जैसे, आरएनए के लिए Bonferroni सुधार-Seq डेटा)27.  भविष्य के अध्ययन के लिए इन व्यवहार प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता को समझने की जरूरत है और संभवतः प्रयोगात्मक डिजाइन (जैसे, वृद्धि प्रतिकृति) तदनुसार संशोधित ।

कारकों की एक संख्या रासायनिक जोखिम के अलावा लार्वा मछली के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, दिन के समय, उंर, अच्छी तरह से आकार, तापमान, प्रकाश व्यवस्था की स्थिति, और जोखिम समाधान की मात्रा में एक अच्छी तरह से महत्वपूर्ण विचार11,30प्रतिनिधित्व करते हैं । इन कारणों के लिए, सावधानियों बाह्य कारकों है कि प्रयोग के दौरान लार्वा मछली के हरकत व्यवहार को प्रभावित कर सकता है के प्रभाव को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए । व्यवहार प्रेक्षणों संकीर्ण समय windows में किया जाना चाहिए (3 से 4 ज) और समय अवधि के पार जब दिन के प्रभाव के समय लार्वा हरकत व्यवहार11पर ंयूनतम प्रभाव है की उंमीद कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, लार्वा मछली एक सुसंगत तापमान पर बनाए रखा जाना चाहिए (zebrafish के लिए 28 ± 1 ° c और FHM के लिए 24 ± 1 ° c) और एक परिभाषित प्रकाश पर जोखिम अवधि भर में तापमान नियंत्रित करने वाली इसके अलावा, जहां व्यवहार दर्ज कर रहे है प्रयोगशाला के तापमान व्यवहार पर तापमान प्रभावों से बचने के लिए प्रयोगात्मक शर्तों approximating शर्तों को बनाए रखा जाना चाहिए । इसके अलावा, कुओं व्यवहार टिप्पणियों के दौरान इस्तेमाल किया प्रत्येक व्यक्ति मछली के लिए एक सुसंगत मात्रा में बनाए रखा जाना चाहिए ।

लार्वा और भ्रूण zebrafish PMRs पहले जैव चिकित्सा विज्ञान में इस्तेमाल किया गया है उपंयास यौगिकों12,13के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान । इस प्रोटोकॉल पर्यावरण संदूषणों की रासायनिक जैव गतिविधि की जांच करने के लिए ३८ अंतिमबिंदु का उपयोग करके zebrafish के साथ पिछले व्यवहार अनुसंधान पर फैलता है । हालांकि कैफीन कार्रवाई (मुआ) के एक समझ तंत्र के साथ एक आम जलीय contaminant है, वाणिज्य में कई यौगिकों महत्वपूर्ण यंत्रवत डेटा की कमी है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल के लिए MoAs की अंतर्दृष्टि लाभ के लिए नियोजित किया जा सकता है विषाक्त पदार्थों की कमी डेटा, वाणिज्यिक रसायन सहित३९। इसके अलावा, प्रोटोकॉल सबसे अधिक इस्तेमाल किया मछली मॉडलों में से दो के लिए तरीके प्रदान करता है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, जबकि zebrafish एक आम जैव चिकित्सा मछली मॉडल है कि ecotoxicology में तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है, fathead छोटी मछली सामांयतः पर्यावरण आकलन अनुप्रयोगों के लिए एक पारिस्थितिकी मॉडल के रूप में इस्तेमाल होता है, लेकिन प्राप्त है zebrafish की तुलना में स्वचालित प्रणालियों के साथ व्यवहारिक अध्ययनों में तुलनात्मक रूप से कम ध्यान दिया जाता है । हालांकि मछली व्यवहार विषविज्ञान अध्ययन के लिए कोई मानकीकृत विनियामक तरीकों रहता है, इस प्रोटोकॉल एक दृष्टिकोण के लिए भविष्य के प्रयासों का समर्थन प्रदान करता है ।

कैफीन स्तर है कि जलीय पर्यावरण16में पाया गया है पर मछली मॉडल में से प्रत्येक में व्यवहार प्रतिक्रियाओं को मिलाया । Rodriguez-गिल एट अल. २०१८ कैफीन16के मापा मूल्यों के आधार पर जलीय प्रणालियों में वैश्विक पर्यावरण जोखिम वितरण विकसित की है । विशेष रूप से, अनुमानित अपशिष्ट प्रवाह सांद्रता के ९५% zebrafish और fathead छोटी मछली के सबसे संवेदनशील व्यवहार अंतिमबिंदु के लिए LOECs नीचे वर्तमान अध्ययन (तालिका 2) में गिर जाएगी । हालांकि कैफीन के कई व्यवहार प्रभाव zebrafish में देखा गया (विशेष रूप से अंधेरे परिस्थितियों में) पर्यावरण की दृष्टि से प्रासंगिक स्तर पर, यह स्पष्ट नहीं है कि इन व्यवहार संशोधनों प्राकृतिक मछली आबादी या परिणाम में हो सकता है पारिस्थितिकी महत्वपूर्ण प्रतिकूल परिणाम । हालांकि संवेदनशील, नैदानिक जांच प्रयोजनों के लिए उपयोगी है, लार्वा मछली व्यवहार थ्रेसहोल्ड अंय जीवन के इतिहास के चरणों या प्राकृतिक आबादी में मछली के प्रतिनिधि नहीं हो सकता है । इसके अलावा अनुसंधान के लिए निर्धारित है कि क्या समान व्यवहार प्रतिक्रिया थ्रेसहोल्ड प्रकृति में घटित होता है और व्यक्ति या जैविक संगठन के जनसंख्या स्तर पर प्रतिकूल परिणामों का संकेत होगा वारंट है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अमेरिका के पर्यावरण संरक्षण एजेंसी से अतिरिक्त सहायता के साथ इस अध्ययन के लिए समर्थन अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (परियोजना #: चे-१३३९६३७) द्वारा प्रदान किया गया था । हम जनरल लैब समर्थन के लिए डॉ जॉन्ग Corrales, डॉ लॉरेन Kristofco, गेविन सारि, शमूएल Haddad, Bekah Burket और Bridgett हिल धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViewPoint Zebrabox ViewPoint ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine Sigma-Aldrich C0750-100G Study chemical
Incubator VWR 9110589 Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator Thermo Fisher Scientific 35824-636 Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakers VWR 89000-200 Zebrafish exposure chambers 
500 mL glass beakers  Pyrex EW-34502-03 Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipette Eppendorf Research 5000 Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes VWR 414-004-004 Used to transfer study organisms 
48-well plates Fisher Scientific 08-772-52 Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates VWR 10062-896 Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate Sigma-Aldrich C3771 For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506 For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate  Sigma-Aldrich S5761 For reconstituted hard water
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For reconstituted hard water
z-mod recirculating system Marine Biotech Systems Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software Sigma Plot  Version 13.0 Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software Graphpad Prism Prism 5 Used to produce figures 
Autosampler/quaternary pumping system Agilent Technologies Infinity 1260 model  Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source Agilent Technologies Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer  Agilent Technologies Model 6420 Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)  Agilent Technologies 685775-914T Caffiene chromatography 
MassHunter Optimizer Software  Agilent Technologies Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6

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References

  1. Malaj, E., et al. Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).
  2. Schäfer, R. B., Kühn, B., Malaj, E., König, A., Gergs, R. Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems. Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).
  3. Andersen, M. E., Krewski, D. Toxicity testing in the 21st century: bringing the vision to life. Toxicological Sciences. 107 (2), 324-330 (2008).
  4. Rovida, C., Hartung, T. Re-evaluation of animal numbers and costs for in vivo tests to accomplish REACH legislation requirements for chemicals-a report by the transatlantic think tank for toxicology (t (4)). Altex. 26 (3), 187-208 (2009).
  5. Council, N. R. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , National Academies Press. (2007).
  6. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  7. Scholz, S., Fischer, S., Gündel, U., Küster, E., Luckenbach, T., Voelker, D. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment-applications beyond acute toxicity testing. Environmental Science and Pollution Research. 15 (5), 394-404 (2008).
  8. Fraysse, B., Mons, R., Garric, J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 63 (2), 253-267 (2006).
  9. Noyes, P. D., Haggard, D. E., Gonnerman, G. D., Tanguay, R. L. Advanced morphological-behavioral test platform reveals neurodevelopmental defects in embryonic zebrafish exposed to comprehensive suite of halogenated and organophosphate flame retardants. Toxicological Sciences. 145 (1), 177-195 (2015).
  10. Colón-Cruz, L., et al. Alterations of larval photo-dependent swimming responses (PDR): New endpoints for rapid and diagnostic screening of aquatic contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety. 147, 670-680 (2018).
  11. Kristofco, L. A., et al. Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine. Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).
  12. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327 (5963), 348-351 (2010).
  13. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).
  14. Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -O., Halden, R. U. Contaminants of Emerging Concern in the Environment: Ecological and Human Health Considerations. , ACS Publications. 257-273 (2010).
  15. Woudenberg, A. B., et al. Zebrafish embryotoxicity test for developmental (neuro) toxicity: Demo case of an integrated screening approach system using anti-epileptic drugs. Reproductive Toxicology. 49, 101-116 (2014).
  16. Rodríguez-Gil, J., Cáceres, N., Dafouz, R., Valcárcel, Y. Caffeine and paraxanthine in aquatic systems: Global exposure distributions and probabilistic risk assessment. Science of the Total Environment. 612, 1058-1071 (2018).
  17. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kristofco, L. A., Brooks, B. W. Global scanning of antihistamines in the environment: Analysis of occurrence and hazards in aquatic systems. Science of the Total Environment. 592, 477-487 (2017).
  20. Saari, G. N., Scott, W. C., Brooks, B. W. Global assessment of calcium channel blockers in the environment: Review and analysis of occurrence, ecotoxicology and hazards in aquatic systems. Chemosphere. , (2017).
  21. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  22. Berninger, J. P., et al. Effects of the antihistamine diphenhydramine on selected aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (9), 2065-2072 (2011).
  23. Brooks, B. W. Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later. Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).
  24. Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).
  25. Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. W. Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology. 55 (1-2), 23-34 (2001).
  26. Scheiner, S. M., Gurevitch, J. Design and Analysis of Ecological Experiments. , Oxford University Press. (2001).
  27. Nakagawa, S. A farewell to Bonferroni: the problems of low statistical power and publication bias. Behavioral Ecology. 15 (6), 1044-1045 (2004).
  28. Bean, T. G., et al. Pharmaceuticals in water, fish and osprey nestlings in Delaware River and Bay. Environmental Pollution. 232, 533-545 (2018).
  29. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behavioural Brain Research. 228 (1), 99-106 (2012).
  30. Padilla, S., Hunter, D., Padnos, B., Frady, S., MacPhail, R. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: Influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 624-630 (2011).
  31. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  32. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  33. Hutson, L. D., Liang, J. O. Making an impact: zebrafish in education. Zebrafish. 6, 119 (2009).
  34. Hutson, L. D., Liang, J. O., Pickart, M. A., Pierret, C., Tomasciewicz, H. G. Making a difference: education at the 10th international conference on zebrafish development and genetics. Zebrafish. 9 (4), 151-154 (2012).
  35. Kane, A., Salierno, J., Brewer, S. Fish models in behavioral toxicology: automated techniques, updates and perspectives. Methods in Aquatic Toxicology. 2, 559-590 (2005).
  36. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods in Ecology and Evolution. 9 (3), 460-464 (2018).
  37. Hamm, J., Wilson, B., Hinton, D. Increasing uptake and bioactivation with development positively modulate diazinon toxicity in early life stage medaka (Oryzias latipes). Toxicological Sciences. 61 (2), 304-313 (2001).
  38. Kristofco, L. A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).
  39. Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses. Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).

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पर्यावरण विज्ञान १३७ अंक व्यवहार प्रतिक्रिया रूपरेखा व्यवहार विषविज्ञान Zebrafish Fathead छोटी मछली कैफीन न्यूरो उत्तेजक
लार्वा मछली में व्यवहार प्रतिक्रिया प्रोफाइल की जांच के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल: न्यूरो उत्तेजक कैफीन के लिए आवेदन
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Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine. J. Vis. Exp. (137), e57938, doi:10.3791/57938 (2018).

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