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애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

Published: July 24, 2018 doi: 10.3791/57938
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Summary

여기, 선물이 애벌레 zebrafish fathead 미노 운동 활동 및 photomotor 응답 (PMR) 자동된 추적 소프트웨어를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 공통 통합 독성 생물 검정, 이러한 행동의 분석 화학 bioactivity를 검사 하는 진단 도구를 제공 합니다. 이 프로토콜은 카페인, 모델 neurostimulant를 사용 하 여 설명 합니다.

Abstract

물고기 모델과 행동 점점 생명 과학;에 사용 그러나, 오랫동안 물고기 생태, 생리 및 독성에 관한 연구의 대상이 되고있다. 디지털 추적 플랫폼을 자동화를 사용 하 여, neuropharmacology에 최근 노력 소설 작은 분자에 대 한 잠재적인 치료 표적 식별 애벌레 물고기 운동 동작을 활용 하. 이러한 노력에 비슷한 환경 과학 및 비교 약리학 연구 및 독성 오염 물질의 계층된 평가에 대 한 표면 바닷물의 실시간 모니터링 진단 도구로 물고기 모델의 다양 한 동작을 검사는 오염 물질의 위협 Zebrafish는 생물 의학에서 인기 있는 애벌레 물고기 모델 이다, 반면 fathead 미노 ecotoxicology에서 일반적인 애벌레 물고기 모델입니다. 불행히도, fathead 미노 애벌레 행동 연구에 상당히 적은 관심을 받았습니다. 여기, 우리 개발 모델 neurostimulant로 카페인을 사용 하 여 행동 프로 파일 프로토콜을 설명 하 고. Fathead 황 어의 photomotor 응답 했다 카페인에 의해 때때로 영향을, 비록 zebrafish photomotor 및 환경 관련 수준 응답 운동 끝점에 대 한 현저 하 게 더 과민 했다. 미래의 연구가 필요 나이 및 시간와 물고기 간의 비교 행동 감도 차이 이해 하 고 비슷한 행동 효과 자연에서 발생 하는 것 개인에 불리 한 결과의 표시 될 있는지 확인 또는 생물 학적 조직의 인구 수준입니다.

Introduction

비록 물고기 모델을 생물 의학 연구를 위해 점점 사용 된다, 물고기는 정기적으로 고용 생태 및 생리 연구, 표면 바다의 오염을 확인 하 고 화학 물질의 독성에 관한 임계값 이해를. 화학 오염 수 중 생태계에 악영향을 줄 수 있기 때문에 소스 물 공급1,2의 품질을 위태롭게 그러한 노력이 중요 하다. 그러나 상거래, 부족에에서 화학 물질의 대부분도 기본적인 독물학 정보3.

전통적으로 규제 독성 시험에 사용 하는 동물 모델 분석 실험 자원 집중 및 높은 처리량을 제공할 수 없습니다 독성 21 세기4에 테스트에 필요한 초기 계층 심사. 그 후, 채택 하 고 활용할 수 있는 보다 신속 하 고 효율적으로 화면 생물 학적 활동3,5용 생체 외에서 모델 성장 원동력이입니다. 셀 기반 모델 제시 많은 기회, 하지만 그들은 종종 생물학적 복잡성, 부족 하 고 따라서 대사6을 포함 하 여 많은 중요 한 전체 유기 체 프로세스에 대 한 계정을 하지 않습니다.

Zebrafish는 수생 독성 및 ecotoxicology7,8대체 모델로 인기를 얻고 있다 일반적인 생물 동물 모델입니다. 그들의 작은 크기, 빠른 개발 및 높은 통치 감안할 때, 물고기 모델 신속 하 고 효율적으로 화면 bioactivity 및 전체 유기 체 규모9에 독성 화학 물질을 사용할 수 있습니다. 자동된 추적 소프트웨어의 도움으로 애벌레 zebrafish 행동 독성10,11에 대 한 오염 물질 차단에 향상 된 진단 유틸리티를 제공 합니다. 운동 끝점 행동의 화학적 메커니즘의 정보 표현 형 동작을 사용할 수 있습니다 및 다음 미정 비 발한 분자12, subcellular 목표를 식별할 수는 약 학에 학문은 설명 했다 13. Zebrafish는 생물 의학에서 인기 있는 애벌레 물고기 모델 이다, 반면 fathead 미노는 ecotoxicology 연구 및 예비 하는 동안 사용 되는 일반적인, 생태학적으로 중요 한 물고기 모델 (예를 들어, 새로운 화학 평가) 및 (예를 들어, 주위 표면 물 또는 폐수 유출 방전 모니터링) 회고전의 환경 평가 불행히도, 애벌레 fathead 황 어의 행동 답변 zebrafish 보다 현저 하 게 더 적은 주목을 받았다. 우리의 지속적인 연구 모델과 2 개의 일반적인 애벌레 물고기, zebrafish 및 fathead 미노 애벌레 물고기 패턴 표시 예상된 모드 또는 다양 한 화학 물질에 대 한 행동의 메커니즘에 나왔다. 따라서, 행동 끝점 신속 하 고 민감하게 독성에 대 한 화학 물질을 확인 하 고 초기 계층 평가 중 특히 산업 화학 및 기타 오염 물질에 대 한 subcellular 목표를 식별 하는 잠재력을 제공 합니다.

여기, 우리 보고 애벌레 물고기에 행동 반응 프로필을 조사 하기 위한 프로토콜. 카페인, 모델 neurostimulant과 다음 인간의 소비 식품의 폐수 처리 식물에서 방전을 통해 수 중 시스템을 도입 하는 일반적인 수 중 오염 물질을 사용 하 여 이러한 방법을 보여 줍니다 음료, 그리고 제약 카페인14와 공식화입니다. 두 애벌레 zebrafish 및 fathead 미노, 조명 조건, 수시로 불린다 photomotor 응답 (PMR)으로 배아와 애벌레 제약 연구 기간 동안에 급격 한 변화를 포함 하 여 카페인 행동 응답 검토 zebrafish13,15. 우리 각 물고기 모델에 대 한 화학 응답 프로 파일을 개발 하는 여러 운동 끝점을 통해 카페인의 효과 식별 합니다. 이 연구에 사용 하는 치료 수준 카페인 카페인16의 측정된 환경 값에 따라 노출 배포판의 위 centiles를 나타냅니다. 우리는 또한 애벌레 물고기 LC50 값, 그리고 치료 위험 값 (THV), 물고기 인간 치료 플라즈마 복용량과 일치에 플라스마 수준에서 결과를 예상 하는 물에 약 제 농도를 벤치마킹 하는 치료를 포함 합니다.

Protocol

이 프로토콜에서 연구 일반적으로 표준화 된 실험 설계를 수행 하 고 미국 환경 보호 기구 (EPA no. 2000.0) fathead 황 어에 대 한 경제 협력을 위한 조직에서 권장 되는 통계 분석 지침 및 제 브라에 대 한 개발 (OECD no. 236)입니다. 이러한 실험 디자인 (예를 들어, 복제 증가) 미래 연구에 대 한 현재 프로토콜 내에서 수정할 수 있습니다. 생선 문화 조건에 따라 이전 문학17게시. 모든 실험 절차와 물고기 문화 프로토콜 따라 베일 러 대학에서 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜.

1. 노출 물고기 화학 치료를

  1. 카페인 재구성된 하드 물에 용 해 하 여 카페인 노출 솔루션을 준비 합니다. 높은 카페인 치료 낮은 카페인 치료 수준의 생산 하드 물으로 희석 하 여 적절 한 직렬 희석을 수행 합니다.
    주: 표 1 각이 실험에 사용 하는 치료 수준 요약 합니다.
제 브라 Fathead 미노
치료 공칭 카페인 농도 (mg/L) 측정 된 카페인 농도 (mg/L) 치료 공칭 카페인 농도 (mg/L) 측정 된 카페인 농도 (mg/L)
제어 0 < LOD 제어 0 < LOD
75 Centile * 0.001 0.001 75 Centile * 0.001 0.001
95 Centile * 신제품 개발: 0.039 0.013 95 Centile * 신제품 개발: 0.039 0.009
99th Centile * 0.412 0.361 99th Centile * 0.412 0.310
THV 4.07 3.81 THV 4.07 4.12
10% LC50 48.46 46.66 10% LC50 14.1 14.7
40% LC50 193.82 186.67 40% LC50 56.38 53.91

표 1: 제 브라와 fathead 미노 실험에 대 한 실험적인 카페인 치료. 각 치료에 대 한 카페인의 공칭 및 측정 값을 받는다. *이 연구에 사용 된 카페인 치료 카페인16의 측정된 환경 값에 따라 노출 배포판의 위 centiles를 나타냅니다. THV: 치료 위험 값입니다. 탐지의 LOD: 제한

  1. 개별 노출 샴페인에 준비 솔루션을 붓는 다. Fathead 미노 노출 챔버에 대 한 노출 솔루션의 200 mL와 함께 가득한 제 브라 노출 챔버에 대 한 노출 솔루션의 20 mL 100 mL 유리 비 커와 500 mL 비 커를 사용 합니다.
  2. 전송 피 펫을 사용 하 여, 각 치료 마다 4 개의 복제 노출 챔버 10 zebrafish 태아 세 4-6 h 게시물 수정 (hpf)를 배치 합니다.
  3. 장소 10 fathead 미노 애벌레 치료 당 3 복제 노출 챔버의 각 화의 24 시간 이내 세. Fathead 미노 애벌레의 더 큰 크기에 맞게 잘라 전송 피 펫의 끝 이전에 전송.
  4. 16:8 h 빛: 다크 photoperiod 28 ±의 일정 한 온도에서 zebrafish 실험 유지 1 ° c. 사용 하 여 동일한 photoperiod 정권 fathead 미노 연구에 대 한 하지만 25 ±의 온도 1 ° c.
  5. 화학 노출의 96 h, 후 부하 개별 물고기 (zebrafish)를 위한 48의 24 (fathead 미노)에 대 한 별도 우물에 잘 접시.
    1. 각 잘 솔루션의 동일한 볼륨을 포함 하는 보장 하기 위해, zebrafish 애벌레 48 잘 플레이트 잘 당 1000 µ L 볼륨에 대 한 5000 µ L autopipette를 사용 하 여 전송. 철수와 전송 zebrafish 애벌레 및 노출 하는 autopipette를 사용 하 여 솔루션을 동시에.
    2. 그들의 큰 크기로 인해, fathead 미노 애벌레 차단 팁 전송 피 펫을 사용 하 여 전송 합니다. 각 개별 웰 스 fathead 미노 애벌레를 전송 하기 전에 채우기는 autopipette를 사용 하 여 2000 µ L을 잘. 웰 스에 개별 fathead 애벌레를 전송할 때 전송 피 펫 팁 잘 솔루션에 놓고 잘으로 피 펫 팁에서 수영 하는 물고기를 허용 합니다.

2입니다. 교정 비디오 추적 매개 변수

  1. 행동 조치 전에 비디오 트랙 소프트웨어에 관찰 및 교정 매개 변수 설정 (재료의 표 참조).
    1. 1 애벌레 물고기 개별 잘에서 녹음 실에서 잘 접시를 놓습니다. 보정 매개 변수를 설정 표현으로 판과 관련 된 물고기를 사용 합니다.
    2. 비디오 트랙 소프트웨어에서 클릭 "파일 | 생성 프로토콜", 어떤"프로토콜 작성 마법사"대화 상자가 열립니다. "위치 수" 필드에 잘 접시의 개인 우물의 수를 입력 하 고 "확인"을 클릭 합니다.
    3. 화면 상단에서 클릭 "보기 | 전체 화면 "을 잘 플레이트의 오버 헤드 카메라 뷰를 표시 하려면 시스템을 묻는 메시지가 표시 됩니다.
    4. 3 여러 모양으로 나타나는 "그리기 영역" 아이콘을 클릭. 보기 영역 잘 접시의 오른쪽에 "지역"를 표시 하는 필드에 원 아이콘을 선택 합니다.
    5. 커서를 사용 하 여 추적 영역 잘 플레이트의 왼쪽 상단에 원형 비디오의 윤곽을 그리 다. "오른쪽 위 마크" 선택한 다음 상단 오른쪽 잘의 보기 영역을 설명 합니다. 그런 다음, "하단 마크" 하단 오른쪽 잘 윤곽을 선택 합니다.
      참고: 원형 윤곽을 그리기, 후의 위치 가능성이 하셔야 조정 해야 합니다.  윤곽선의 위치를 조정 하려면 "선택"을 클릭 하 고 개요 영역을 이동 하려면 커서를 사용 합니다. 또한, 윤곽선 "복사본" 및 다음 "붙여넣기"를 클릭 하 여 복제 될 수 있습니다.
    6. 후 왼쪽 상단, 오른쪽, 상단, 하단 오른쪽 잘 추적 영역으로 정의 된 "빌드" 소프트웨어 자동으로 나머지 우물의 보기 영역을 나타내는 표시를 클릭 합니다.
    7. "교정" 표시 된 영역에서 "인출 규모"를 클릭 합니다. 커서를 사용 하 여 접시에 걸쳐 가로 선을 그립니다. 라인을 그려 "교정 측정" 이라고 표시 된 대화 상자가 표시 됩니다. 잘 플레이트 길이 입력 하 고 "확인"을 클릭 합니다.
    8. "그리기 영역" 아이콘을 클릭 하 여 그리기 관리자를 종료 합니다.
    9. "타일" 아이콘을 클릭 합니다.  커서를 사용 하 여 각 상자는 녹색 보기 화면에 표시 되는 모든 상자를 강조 표시 합니다.
      참고: 6 개별 작은 사각형의 그룹으로 타일 아이콘 표시
    10. "보기 | 전체 화면 "입니다.  보기 영역 접시의 오른쪽에 "검출 임계값" 상자에서 "Bkg"을 클릭 합니다. 임계값 조절 막대를 사용 하 여 픽셀 검출 임계값을 설정 하려면. 적절 한 픽셀 검출 임계값을 선택 하는 한 번, "그룹에 적용"을 클릭 하십시오.
      참고:이 프로토콜 설정 합니다 감지 임계값 zebrafish 관찰에 대 한 블랙 모드에서 13, 110에 fathead 미노 관찰에 대 한 투명 모드에서.
    11. "이동 임계값" 표시 상자에서 원하는 운동 속도 추적 매개 변수를 입력 합니다. 속도 매개 변수가 설정 되 면 "그룹에 적용"을 클릭 합니다.
      참고:이 프로토콜 5 mm/s에서 20 m m/s 및 비활성/작은 움직임에서 작은/큰 움직임을 설정합니다. 이 선택 세 가지 다른 속도 수준에서 애벌레 물고기 움직임을 추적 하는 소프트웨어 프로그램: 비활성 (동결) = < 5 mm/s, 소형 (크루즈) = 5-20 m m/s, 그리고 큰 (파열) = > 20 m m/s.
    12. 클릭 "매개 변수 | 프로토콜을 매개 변수 "드롭 다운 메뉴에서 합니다. 대화 상자에서 Enter 관측 시간 및 통합 시간 "시간" 탭을 선택 합니다. 매개 변수를 입력 한 후 "확인"을 클릭 합니다.
    13. 설정 하려면 명암 photoperiod 시간과 광도 빛 드라이버 설정 대화 상자 "매개 변수"에서 "라이트 운전"을 선택 하 여 각 photoperiod 오픈에 대 한 드롭 다운 메뉴.
      주: 여러 빛-어둠 photoperiods를 설정 하기 위한 프로토콜 비디오를 참조 하십시오.
    14. 비디오 추적 매개 변수를 설정 관찰 프로토콜을 저장 합니다.
      참고:이 프로토콜 4 명암 단계 구성 된 두 개의 10 분 빛 및 2 개의 10 분 어두운 기간을 변경 하 여 다음 10 분 새 환경 순응 단계를 포함 하는 50 분 동안 물고기 동작을 관찰 합니다. 통합 시간 50 분 행동 재판의 각 분에 대 한 동작을 측정 하기 위해 설정 됩니다.

3. 애벌레 물고기 운전의 관찰 및 Photomotor 동작

  1. 행동 녹음 실에서 실험 물고기를 포함 하는 잘 접시를 놓습니다.
  2. 추적 소프트웨어 비디오에서 3 단계에서 개발 추적 프로토콜을 엽니다.
  3. 비디오 추적 뷰어에서 모든 애벌레는 컴퓨터 화면에서 볼 수 있는지 확인 하려면, 그 하나의 개별 유 충은 각 음에 존재 하 고 개별 우물 2.1.5 및 2.1.6 단계에서 정의 된 관측 영역 내에서 정렬 됩니다 확인 합니다.
  4. 클릭 "실험 | "실행 합니다.
    참고: 시스템 이름 및 관측 데이터를 저장할 위치를 입력 하 라는 메시지가 나타납니다.
  5. 일단 이름 및 저장 위치 관측의 데이터 지정, 모든 미리 정의 된 보기 영역을 강조 하기 위해 "여러 라이브 이미지" 아이콘을 클릭
    참고:이 아이콘 컴퓨터 화면의 상단에 위치 하 고 4 개의 작은 사각형으로 분할 상자 나타납니다. 이 아이콘을 클릭 하면 모든 미리 정의 된 보기 영역을 강조 표시 됩니다.
  6. 녹음 실의 패널을 닫고 클릭 "배경 | 시작 "컴퓨터 모니터에.

4. 행동 데이터 분석

  1. 애벌레 물고기 활동 데이터를 검색 하려면 추적 소프트웨어에 의해 자동으로 컴파일 및 행동 실험 (3.4 단계)을 시작 하기 전에 사용자가 지정한 폴더에 스프레드시트를 엽니다.
  2. 각각 그림 1A 및 1B 순진한 unexposed zebrafish fathead 미노 애벌레, 운동 활동의 대표적인 측정을 참조 하십시오. 효과적으로 빛이 어둡거나 빛 어두운 전환 움직임 차이의 크기를 검사 하는 PMR 계산 그림 1C 및 1d 를 참조 하십시오.

Figure 1
그림 1: 노출 되지 않은 제 브라 (A 및 B) 및 fathead 미노 (C , D)의 초기 활동의 예입니다. 제 브라 (A)에 대 한 평균 (± SEM) 거리 수영 및 fathead 미노 (C) 활동의 각 대표 1 분 간격으로 점 들에 의해 주어진 다. 두 어둡고 photomotor 응답의 2 개의 빛 기간 측정 됩니다. 마지막 (a, c, e, 및 g) 및 (b, d, f, 그리고 h) 첫 번째 분 photoperiod 각의 zebrafish (B)의 PMRs Photomotor 응답을 계산 하는 데 사용 됩니다 및 fathead 미노 (D)는 마지막 순간 사이 여행을 하는 의미 (±SEM) 거리에 변화 측정 초기 photoperiod와 다음 기간의 첫 번째 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Representative Results

카페인 치료 수준을 분명 zebrafish 및 fathead 황 어와 96 h 실험 동안 다 하지 않았다. 예를 들어 표 1 각 치료 수준의 농도를 분석 검증된을 선물 한다. 이 프로토콜 동위 원소 희석 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 이전에 보고 된 방법28를 일반적으로 다음에 의해 카페인 치료 수준에 대 한 물 샘플을 확인 합니다. Paraxanthine, 카페인의 1 차 대사 산물의 형성 또한 정량 했다. 이러한 분석 절차의 설명에 보충 분석 정보 제공 됩니다. 치료의 공칭 및 분석 검증 사이 상사 성 때문에 공칭 치료 수준이이 논문의 나머지 부분에 걸쳐 표시 됩니다. 카페인은 크게 zebrafish 및 fathead 미노 동작 변경. 그러나, zebrafish 운동 응답은 더 fathead 황 어 보다 카페인에 민감한 일관 되 게 되었다. 제 브라와 fathead 미노 애벌레에 대 한 가장 중요 한 행동 끝점 카페인 0.039 밀리 그램의 농도에 의해 영향을 받은/최저 관찰된 영향 농도 (LOECs) 및 아무 관찰 된 효과 농도 (NOECs) 나 표 2 요약 대 한 두 가지 물고기 모델에서 각 행동 끝점입니다.

제 브라 Fathead 미노
끝점 LOEC (mg/L) NOEC (mg/L) 끝점 LOEC (mg/L) NOEC (mg/L)
총 거리 어둠 0.412 신제품 개발: 0.039 총 거리 어둠 − 56.38
총 거리 빛 48.46 4.07 총 거리 빛 − 56.38
총 수 다크 0.412 신제품 개발: 0.039 총 수 다크 − 56.38
총 수 빛 48.46 4.07 총 수 빛 − 56.38
거리 어둠 붕괴 − 193.82 거리 어둠 붕괴 − 56.38
거리 빛 파열 193.82 48.46 거리 빛 파열 − 56.38
어두운 건의 파열 193.82 48.46 어두운 건의 파열 − 56.38
붕괴 수 빛 193.82 48.46 붕괴 수 빛 − 56.38
기간 어둠 붕괴 193.82 48.46 기간 어둠 붕괴 − 56.38
금지 기간 빛 − 193.82 금지 기간 빛 − 56.38
순항 거리 어둠 0.412 신제품 개발: 0.039 순항 거리 어둠 − 56.38
순항 거리 빛 48.46 4.07 순항 거리 빛 − 56.38
어두운 계산 순항 0.412 신제품 개발: 0.039 어두운 계산 순항 − 56.38
순항 건의 빛 48.46 4.07 순항 건의 빛 − 56.38
크루 징 기간 어둠 0.412 신제품 개발: 0.039 크루 징 기간 어둠 − 56.38
크루 징 기간 빛 48.46 4.07 크루 징 기간 빛 − 56.38
어두운 거리를 고정 0.412 신제품 개발: 0.039 어두운 거리를 고정 신제품 개발: 0.039 0.001
고정 거리 빛 신제품 개발: 0.039 0.001 고정 거리 빛 − 56.38
어 어두운 계산 0.412 신제품 개발: 0.039 어 어두운 계산 − 56.38
냉동 수 빛 48.46 4.07 냉동 수 빛 − 56.38
어두운 기간을 동결 − 193.82 어두운 기간을 동결 56.38 14.10
기간 가벼운 동결 48.46 4.07 기간 가벼운 동결 − 56.38
어두운 1 PMR 48.46 4.07 어두운 1 PMR 신제품 개발: 0.039 0.001
1 PMR 빛 48.46 4.07 1 PMR 빛 − 56.38
다크 2 PMR 48.46 4.07 다크 2 PMR − 56.38
2 PMR 빛 48.46 4.07 2 PMR 빛 − 56.38
어두운 1 PMR 파열 − 193.82 어두운 1 PMR 파열 − 56.38
빛 1 파열 PMR − 193.82 빛 1 파열 PMR − 56.38
어두운 2 PMR 파열 193.82 48.46 어두운 2 PMR 파열 − 56.38
빛 2를 파열 PMR − 193.82 빛 2를 파열 PMR − 56.38
어두운 1 PMR 순항 48.46 4.07 어두운 1 PMR 순항 − 56.38
크루즈 1 PMR 빛 48.46 4.07 크루즈 1 PMR 빛 − 56.38
어두운 2 PMR 순항 48.46 4.07 어두운 2 PMR 순항 − 56.38
순항 빛 2 PMR 193.82 48.46 순항 빛 2 PMR 56.38 14.10
어 어두운 1 PMR 48.46 4.07 어 어두운 1 PMR − 56.38
빛 1 냉동 PMR 193.82 48.46 빛 1 냉동 PMR − 56.38
어두운 2 PMR 동결 48.46 4.07 어두운 2 PMR 동결 − 56.38
빛 2 동결 PMR 193.82 48.46 빛 2 동결 PMR − 56.38

표 2: 제 브라와 fathead 미노 행동 NOECs와 카페인에 대 한 LOECs. 아니 관찰 영향 농도 (NOEC), 빛/어둠의 각각에 대 한 최저 관찰 영향 농도 (LOEC) (mg/L) 값 수영 활동 끝점 및 photomotor 제 브라와 fathead 황 어 카페인에 노출에 대 한 응답. 대시 표시 효과 없이 모든 치료 단계에 걸쳐 특정 끝점에서 관찰 되었다.

그림 2 는 총 운동 활동 zebrafish 및 fathead 미노 96 h 카페인에 노출 다음의 PMRs를 선물 한다. Fathead 미노 애벌레 PMRs zebrafish, 보다 낮은 치료 수준 (0.038 mg/L)에서 카페인 photomotor 끝점의 현저 하 게 많은 수에 의해 변경 된 zebrafish에 영향을 받았다. 카페인 (193.82 mg/L)의 높은 치료 수준이이 반응을 정확 하 게 반대 했다 zebrafish에 PMR 변경 컨트롤에서. 그러나이 높은 치료 수준,, PMRs 어둠 속에서 감소 하 고 조명 조건에서 증가.

Figure 2
그림 2: 수영 활동과 제 브라 (A 및 B) 및 96 h 카페인에 노출 후 fathead 미노 (C , D)의 photomotor 응답. 제 브라 (A)에 대 한 평균 (± SEM) 거리 수영 및 fathead 미노 (C) 활동의 각 대표 1 분 간격으로 점 들에 의해 주어진 다. 제 브라 (B)와 (D) fathead 미노의 Photomotor 응답 평균 (± SE) 총 거리는 초기 photoperiod의 last minutes와 다음 기간의 첫 번째 분 사이 여행에 변화로 측정 됩니다. 두 어둡고 두 빛 기간 photomotor 응답 측정 되었다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (3 각의 복제 4 애벌레) fathead 황 어 행동 관찰을 위해 사용 되었다. p < 0.10; p < 0.05; p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

애벌레 PMRs를 측정 하는 것 외에도 빛과 어둠 운동 활동 3 이동 거리에 대 한 속도 임계값, 움직임의 수 및 움직임의 기간에 걸쳐 분석 했다. 이 데이터는 행동 응답 카페인 ( Supplemental 그림 1,그림 3)에 대 한 프로 파일을 개발 하는 데 사용 됩니다. 카페인 저해 활동에는 물고기 모델에, 운동 끝점을 크게 영향을 받습니다. 비록 크게 하지 두 생선, 카페인에 노출 다음 붕괴 속도 임계값에 시연된 활동 증가 모델. PMR 관측의 결과 마찬가지로 카페인 영향 zebrafish 운동 끝점의 더 많은 수 있습니다. 사실, 카페인은 크게는 THV 환경 현실적인 수준에서 어두운 조건 하에서 여러 가지 운동 응답을 변경. 그러나, fathead 미노 운동 활동은 크게 영향을 받지 어떤 치료 수준으로 조명 조건 하에서.

Figure 3
그림 3: 96 h 카페인에 노출 후 애벌레 zebrafish 및 fathead 황 어의 응답 프로필. Zebrafish 어두운 (A) 빛 (B) 수영 96 h 카페인에 노출 된 후 어두운 fathead 미노 (C)와 빛 (D) 활동을 의미 하는 비교 하는 활동을 의미 합니다. 2 10 분 어두운 photoperiods와 각 물고기 모델에 대 한 2 개의 10 분 빛 photoperiods 데이터 나타내는 활동을 꾸몄다. 각 그림에서 0 축에 표시 되는 제어 데이터 정규화 됩니다. 행동 매개 변수 포함 거리, 움직임 (개수)의 수 및 각 이동의 기간에 붕괴 3 속도 레벨에 걸쳐 헤 엄 (> 20 m m/s), 순항 (5-20 m m/s), 냉동 고 (< 5 mm/s). 각 속도 임계값의 운동 패턴, 뿐만 아니라 총 거리 수영 하 고 움직임의 총 수 표시 됩니다. ↑ 제어에 비해 활동에 상당한 증가 나타내고 ↓ 제어에 비해 활동에 상당한 감소를 나타냅니다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (3 각의 복제 4 애벌레) fathead 미노 행동 관측에 사용 하는 각 그룹에 대 한. p < 0.10; p < 0.05; p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 제 브라 (A 및 B) 및 3 속도 임계값에 걸쳐 fathead 미노 (C , D)의 Photomotor 응답 합니다. 제 브라 (A, B 및 C) 및 fathead 미노 애벌레 (D, E 및 F) photomotor 응답 3 속도 임계값에 걸쳐 (동결: 20 mm/s) 카페인에 96 시간 노출 후. 제 브라와 fathead 미노의 Photomotor 응답 초기 photoperiod의 last minutes와 다음 기간의 첫 번째 분 사이 여행을 하는 의미 (±SE) 총 거리 변경으로 측정 됩니다. 두 어둡고 두 빛 기간 photomotor 응답 측정 되었다. 24의 총 (4 각의 복제 6 애벌레) zebrafish, 12 (4 애벌레의 3 복제) fathead 황 어 행동 관찰을 위해 사용 되었다. * p < 0.01 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

행동 독성 학 연구에 대 한 화학 치료 수준을 선택할 때 여러 가지 요인은 고려해 야 합니다. 현재 연구에서 카페인 치료 수준에서 폐수 유출16예측된 환경 노출 시나리오에 대 한 상위 centile 값에 따라 선정 됐다. 가능 하면 우리가 일상적으로 수생 독성 연구 환경 관측19,,2021의 개 연 론 노출 평가 사용 하 여 처리 레벨을 선택 합니다. 의약품에 대 한 계산 가능한 THV 또한 현재 연구에서 치료 수준으로 포함 되었다. THV 값 (식 1)22,23 예측된 물 농도 물고기23조 제약의 인간의 치료 복용량 (Cmax)로 이어지는로 정의 됩니다, 초기 플라즈마 노력24, 모델링에서 영감 있고 혈액: 물 화학 분할 계수 (식 2)25에 따라 계산 합니다.

THV C최대 = / PBW (식 1) 로그

로그 PBW 로그 = [(100.73. Kow 로그 · 0.16) + 0.84] (식 2)

여기, 우리는 또한 zebrafish 및 fathead 미노 LC50 값을 기준으로 sublethal 치료 수준을 선택합니다. 우리이 이렇게 행동 반응에 대 한 유용한 벤치마킹 절차 특히 때 고려해 여러 화학 물질에 걸쳐 물고기 모델 특정 동작의 임계값을 비교 합니다. 그것은 더 급성 진단 기계 연구와 평가 대 한 수생 독성에 유용 될 수 있는 만성 비율의 계산을 지원 합니다. LC50 값 단계 2.1에에서 주어진 표준된 지침에 따라 예비 독성 생물 검정에서 얻은 했다.

이 프로토콜에서 일반적인 실험적인 디자인을 채용 하 고 통계적 기법 물고기 모델 독물학 연구를 위한 표준화 된 방법 미국 EPA와 OECD에서 권장. 비록 우리가 보고 p 값 (예., < 0.01, < 0.05, < 0.10), 큰 차이가 (α = 0.10) 활동 수준의 경우 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 치료 중 식별 됩니다 정상 및 분산 정의의 등가 충족 됩니다. Dunnett의 또는 Tukey의 HSD 포스트 hoc 테스트 치료 수준 차이 식별 하기 위해 수행 됩니다. 우리 선택이 알파 (α = 0.10) 값을 유형 II 오류, 특히 초기 계층 분석 및 대신 understudied 행동 끝점 및 모델 생물26, 생물학으로 중요 한 효과 크기의 이해는 제한 하는 경우 여러 비교를 위해 생물 의학에서 일반적인 절차를 사용 (예., Bonferroni 보정 RNA-Seq 데이터에 대 한)27.  미래의 연구는 이러한 행동 반응의 다양성을 이해 하 고 그에 따라 실험 디자인 (예를 들어, 증가 복제) 수정 필요 합니다.

요인의 수 화학 노출 이외에 애벌레 물고기의 행동을 좌우할 수 있다. 예를 들어, 나이, 잘 크기, 온도, 조명 조건, 및 각 잘 나타내는 중요 한 고려 사항11,30노출 솔루션의 시간. 이러한 이유로 주의 실험 중 애벌레 물고기의 운동 동작에 영향을 미칠 수 있는 외부 요인의 영향을 최소화 하기 위해 취해야 한다. 행동 관찰 좁은 시간 창 (3 ~ 4 h)와 하루 효과의 시간 애벌레 운동 동작11에 최소한의 영향을 미칠 것으로 예상 하는 때 기간에 걸쳐 수행 되어야 한다. 또한, 애벌레 물고기 유지 되어야 한다 (28 ± 1 ° C zebrafish)와 24 ± 1 ° C FHM에 대 한 일관 된 온도에 그리고 노출 기간 동안 인큐베이터 온도 제어에 정의 된 명암 주기. 또한, 행동 기록 됩니다 실험실의 온도 조건에 동작 온도 영향을 피하기 위해 실험 조건에 가깝게 유지 되어야 한다. 또한, 행동 관찰 하는 동안 사용 하는 웰 스 각 개별 물고기에 대 한 일관성 있는 볼륨에서 유지 되어야 합니다.

애벌레와 배아 zebrafish PMRs 이전에서 사용 된 생물 의학 과학 소설 화합물12,13대 한 잠재적인 치료 목표를 식별 하 이 프로토콜 zebrafish 이전 행동 연구 조사 환경 오염 물질의 화학 bioactivity 38 끝점을 사용 하 여 확장 합니다. 카페인은 행동 (MoA)의 이해 메커니즘으로 일반적인 수 중 오염 물질, 상거래에 많은 화합물 중요 한 기계적 데이터가 부족 합니다. 따라서,이 프로토콜은 MoAs의 독성 데이터를 상용 화학 물질39를 포함 하 여 부족 한 화합물에 대 한 통찰력을 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜 두 가장 일반적으로 사용 되 어 모델에 대 한 메서드를 제공합니다. 설명 했 듯이 이전에 제 브라는 일반적인 생물 생선 모델을 ecotoxicology에서 점점 인기 끌고있다, 미노는 일반적으로 환경 평가 응용 프로그램에 대 한 생태 모델으로 사용 되지만 받은 fathead 자동화 된 시스템은 제 브라에 비해 행동 연구에 비교적 덜 관심. 물고기 행동 독성 학 연구에 대 한 표준화 아무 규제 방법 남아,이 프로토콜 향후 지원에 대 한 접근을 제공 합니다.

카페인 수생 환경16에서 발견 된 수준에서 물고기 모델의 각에 행동 반응 elicited. 로드 리 게 스-길 외. 2018 글로벌 환경 노출 배포판 카페인16의 측정된 값에 따라 수생 시스템 개발. 특히, 예측된 폐수 방류 수 농도의 95%는 현재 연구 (표 2)에서 제 브라와 fathead 미노의 가장 중요 한 행동 끝점에 대 한는 LOECs 아래 나누어질 것 이다. 카페인의 여러 가지 행동 효과 환경 관련 수준 (특히 어두운 조건)에서 zebrafish에 관찰 되었다, 그러나 그것은 불분명 여부 이러한 행동 수정 또는 천연 물고기 인구에 발생할 수 있습니다 결과 생태학적으로 중요 한 불리 한 결과입니다. 하지만 민감한, 진단 검사 목적에 유용, 애벌레 물고기 행동 임계값 대표 다른 생활사 단계 또는 자연적인 인구에 있는 물고기의 수 있습니다. 더 연구는 보증 비슷한 여부 결정 하 행동 응답 임계값 것 자연에서 발생 되며 생물 학적 조직의 개인 이나 인구 수준에 불리 한 결과의 표시.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 연구는 미국 국립 과학 재단에 의해 제공 된 지원 (# 프로젝트: CHE 1339637) 미국 환경 보호국에서 추가 지원. 우리 일반 실험실 지원에 대 한 닥터 존스 코랄, 닥터 로렌 Kristofco, 개 빈 Saari, 사무엘 드는, Bekah Burket 및 Bridgett 힐 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViewPoint Zebrabox ViewPoint ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine Sigma-Aldrich C0750-100G Study chemical
Incubator VWR 9110589 Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator Thermo Fisher Scientific 35824-636 Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakers VWR 89000-200 Zebrafish exposure chambers 
500 mL glass beakers  Pyrex EW-34502-03 Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipette Eppendorf Research 5000 Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes VWR 414-004-004 Used to transfer study organisms 
48-well plates Fisher Scientific 08-772-52 Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates VWR 10062-896 Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate Sigma-Aldrich C3771 For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506 For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate  Sigma-Aldrich S5761 For reconstituted hard water
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For reconstituted hard water
z-mod recirculating system Marine Biotech Systems Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software Sigma Plot  Version 13.0 Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software Graphpad Prism Prism 5 Used to produce figures 
Autosampler/quaternary pumping system Agilent Technologies Infinity 1260 model  Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source Agilent Technologies Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer  Agilent Technologies Model 6420 Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)  Agilent Technologies 685775-914T Caffiene chromatography 
MassHunter Optimizer Software  Agilent Technologies Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6

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애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용
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Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks,… More

Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine. J. Vis. Exp. (137), e57938, doi:10.3791/57938 (2018).

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