Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Eksperimentell protokollen for å undersøke Behavioral respons profiler i larver fisk: programmet Nevro-stimulerende koffein

Published: July 24, 2018 doi: 10.3791/57938
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å undersøke larver sebrafisk og fathead ørekyte locomotor og photomotor svar (PMR) bruker en automatisert sporing. Når innarbeidet felles toksikologi bioassay, gi analyser av disse virkemåtene et diagnostisk verktøy for å undersøke kjemiske bioactivity. Denne protokollen er beskrevet ved hjelp av koffein, en modell neurostimulant.

Abstract

Fisk modeller og atferd blir vanligere i biomedisinsk vitenskapene; imidlertid har fisk lenge vært gjenstand for økologiske, fysiologiske og toksikologiske studier. Ved hjelp av automatisert digital sporing plattformer, siste innsats i neuropharmacology er å utnytte larver fisk locomotor atferd for å identifisere potensielle terapeutiske mål for romanen små molekyler. Ligner på disse anstrengelser, forskning i Miljøfag og komparativ farmakologi og toksikologi undersøker ulike atferd av fisk modeller som diagnoseverktøy i lagdelt evaluering av miljøgifter og real-time overvåkning av overflatevann for miljøgifter trusler. Mens sebrafisk er en populær larver fisk modell i biomedisinsk vitenskapene, er fathead ørekyte en vanlig larver fisk modell økotoksikologi. Dessverre, fathead ørekyte Larvene har fått betydelig mindre oppmerksomhet i atferdsmessige studier. Her vi utvikle og demonstrere en opptreden profil protokoll med koffein som en modell neurostimulant. Om photomotor svar av fathead ørekyte ble noen ganger berørt av koffein, sebrafisk var markert mer følsom for photomotor og locomotor sluttpunkter, som svarte på miljømessig relevante nivåer. Fremtidige studier er nødvendig å forstå sammenlignende atferdsmessige følsomhet forskjeller fisk med alder og tid på dagen, og avgjøre om liknende atferd effekter skulle oppstå i naturen og angivende for uønskede resultater på enkelt eller innbyggere nivåer av biologisk organisasjon.

Introduction

Selv om fisken modeller brukes stadig mer for biomedisinsk studier, har fisk vært rutinemessig ansatt for økologi og fysiologi studier, undersøke forurensning av overflatevann og forstå toksikologiske terskler av kjemikalier. Slikt arbeid er viktig fordi kjemisk forurensning kan svekke akvatiske økosystemer og svekker kvaliteten på kilde vannforsyninger1,2. De fleste av kjemikaliene i handel, men mangel selv grunnleggende toksikologi informasjon3.

Dyremodell analyser tradisjonelt brukt i regulatoriske toksisitet testing er ressurskrevende og kan ikke gi den høy gjennomstrømningen, tidlig tier screening nødvendig for toksisitet i 214. Deretter er det en voksende drivkraft å vedta og bruke i vitro modeller som kan mer raskt og effektivt skjermen forbindelser for biologiske aktiviteter3,5. Om cellen basert modeller presenterer mange muligheter, de mangler ofte biologiske kompleksiteten, og dermed ikke gjøre rede for mange viktige hele organismen prosesser, inkludert metabolisme6.

Sebrafisk er en vanlig biomedisinsk dyr modell som står popularitet som en alternativ modell i akvatiske toksikologi og økotoksikologi7,8. Gitt deres liten størrelse, rask utvikling, og høy fruktbarhet, kan fisk modeller brukes til raskt og effektivt skjermen kjemikalier for bioactivity og toksisitet hele organismen skala9. Ved hjelp av automatiserte sporing gir larver sebrafisk atferd forbedret diagnostiske verktøy i screening forurensninger for toksisitet10,11. Studier i farmasøytiske realfag har vist at locomotor endepunktene er informativ av kjemiske virkningsmekanismer, kan brukes til fenotypen atferd, og deretter kan foreløpig identifisere subcellular mål for romanen molekyler12, 13. Mens sebrafisk er en populær larver fisk modell i biomedisinsk vitenskapene, fathead ørekyte er en felles, økologisk viktige fisk modell som brukes for økotoksikologi studier og under potensielle (f.eks nye kjemiske evalueringer) og retrospektiv (f.eks ambient overflatevann eller avløpsvann avløpsvann utslipp overvåking) miljømessige vurderinger. Dessverre, atferdsmessige responser av larver fathead ørekyte fått betydelig mindre oppmerksomhet enn sebrafisk. Våre pågående forskning med to vanlige larver fisk modeller, sebrafisk og fathead ørekyte, antyder at larver fisk som svømmer mønstre vises unike til forventet eller virkningsmekanismer for ulike kjemikalier. Dermed gir atferdsmessige endepunktene potensial raskt og følsomt undersøke kjemikalier for toksisitet og identifisere subcellular mål for industriell kjemiske og andre forurensninger, spesielt under tidlig tier vurderinger.

Her rapporterer vi en protokoll for å undersøke behavioral respons profiler i larver fisk. Vi viser metodene koffein, en modell neurostimulant og en felles vannlevende miljøgifter som er introdusert til akvatiske systemer gjennom utslipp fra avløpsvann behandlinger planter etter konsum av matvarer, drikkevarer, og legemidler formulert med koffein14. Vi undersøker atferdsmessige responser til koffein i begge larver sebrafisk og fathead ørekyte, inkludert en brå endring i lysforhold, som ofte omtales som photomotor svar (PMR) under farmasøytiske studier med embryonale og larver sebrafisk13,15. Vi identifisere ytterligere effektene av koffein på tvers av flere locomotor endepunktene å utvikle kjemisk reaksjon profiler for hver fisk modell. Koffein behandling nivåer i denne studien representerer den øvre centiles av eksponering distribusjoner basert på miljømessige måleverdiene koffein16. Vi har også behandlinger benchmarked larver fisk LC50 verdier og terapeutiske fare verdien (THV), en farmasøytisk konsentrasjon i vann som er forventet for å resultere i Plasmanivåer i fisk samsvar med en menneskelig terapeutiske plasma dose.

Protocol

Studier i denne protokollen vanligvis følge standardiserte eksperimentell design og anbefalt statistisk analyse retningslinjer fra det oss Environmental Protection Agency (EPA nr. 2000.0) for fathead ørekyte og organisasjonen for økonomisk samarbeid og Utvikling (OECD nr 236) for sebrafisk. Disse eksperimentelle design (f.eksøke replikering) kan endres innenfor gjeldende protokollen for framtidige studier. Fisk kultur vilkårene følger tidligere publisert litteratur17. Alle eksperimentelle prosedyrer og fisk kultur protokoller fulgte institusjonelle Animal Care og bruk komité protokoller godkjent hos Baylor University.

1. utsette fisk til kjemisk behandling

  1. Klargjør koffein eksponering løsninger ved oppløsning koffein i rekonstituert hardt vann. Utføre riktig serielle fortynninger fortynne høyere koffein behandlinger med hardt vann å produsere lavere koffein behandling nivåer.
    Merk: Tabell 1 oppsummerer hver behandling nivåer i dette eksperimentet.
Sebrafisk Fathead ørekyte
Behandling Nominell koffein konsentrasjon (mg/L) Målt koffein konsentrasjon (mg/L) Behandling Nominell koffein konsentrasjon (mg/L) Målt koffein konsentrasjon (mg/L)
Kontroll 0 < LOD Kontroll 0 < LOD
75 Centile * 0,001 0,001 75 Centile * 0,001 0,001
95te Centile * 0.039 0.013 95te Centile * 0.039 0,009
99nde Centile * 0.412 0.361 99nde Centile * 0.412 0.310
THV 4.07 3,81 THV 4.07 4,12
10% LC50 48.46 46.66 10% LC50 14.1 14.7
40% LC50 193.82 186.67 40% LC50 56.38 53.91

Tabell 1: eksperimentell koffein behandlinger for sebrafisk og fathead ørekyte eksperimenter. Nominell og målte verdier av koffein for hver behandling gis. * Koffein behandlinger brukt i denne studien representerer den øvre centiles av eksponering distribusjoner basert på miljømessige måleverdiene koffein16. THV: Fare for terapeutisk verdi. LOD: Grensen for påvisning

  1. Hell løsningen i individuelle eksponering champers. Bruk 100 mL glass kanner fylt med 20 mL eksponering for sebrafisk eksponering kamre og 500 mL kanner med 200 mL eksponering for fathead ørekyte eksponering kamre.
  2. Bruker en overføring pipette, plassere 10 sebrafisk embryo alderen 4-6 h innlegget befruktning (hpf) i hver av fire Repliker eksponering kamre per behandling.
  3. Sted 10 fathead ørekyte Larvene alderen innen 24 timer av klekking i hver av tre Repliker eksponering kamre per behandling. For å imøtekomme større størrelsen på fathead ørekyte larver, avskåret spissen av overføring pipette før overføring.
  4. Opprettholde sebrafisk eksperimenter på en 16:8 h lys: mørke fotoperiode og en konstant temperatur på 28 ± 1 ° C. Bruk samme fotoperiode regimet for fathead ørekyte studier, men ved en temperatur på 25 ± 1 ° C.
  5. Etter 96 h kjemisk eksponering plater Last fisk i separate brønner 48 (for sebrafisk) og 24 (for fathead ørekyte) godt.
    1. For å sikre at hver også inneholder en lik mengde løsning, overføre sebrafisk Larvene til 48 bra plater ved hjelp av en 5000 µL autopipette for et 1000 µL volum per brønn. Bruk autopipette å trekke og overføre både sebrafisk larver og eksponering løsning samtidig.
    2. På grunn av deres større størrelse, kan du overføre fathead ørekyte Larvene bruker en overføring pipette spissen avskåret. Før du overfører fathead ørekyte Larvene individuelle brønner, fylle hver godt til 2000 µL ved hjelp av en autopipette. Når du overfører personlige fathead Larvene brønner, plassere overføring Pipetter i godt løsningen og la fisken å svømme fra pipette spissen i brønnen.

2. kalibrering av Video-sporingsparametre

  1. Før atferdsmessige tiltak, angi observasjon og kalibrering parametere i videosporet programvaren (se tabell for materiale).
    1. Plass en frisk plate i innspillingen kammer med minst 1 larver fisk i en enkelt brønn. Bruke plate og tilknyttede fisk som representasjoner sette kalibrering.
    2. I videosporet programvaren, klikker du "fil | Generere Protocol", som åpner en dialogboks for"protokollen opprettelsesveiviseren". I feltet "sted Count" Angi antall personer ble av godt plate og klikk "OK".
    3. På toppen av skjermen, klikker du "Vis | Full skjerm", som vil be systemet en overhead kamera visningen av godt plate.
    4. Klikk "Tegne områder"-ikonet, som vises som tre flerfargede figurer. Til høyre for godt platen visningsområdet, velger du sirkelikonet i feltet "Områder".
    5. Bruk markøren for å avgrense sirkulær videoen sporing området i øverst venstre godt av godt plate. Velg "Øverst til høyre merke" og deretter disponere visningsområdet toppen akkurat godt. Velg "Bunnen merke" skissere bunnen rett også.
      Merk: Etter sirkulær disposisjonen, sin posisjon vil trolig må justeres.  Juster plasseringen av disposisjonen, klikk "Velg" og deretter bruke markøren for å flytte disponerte området. Disposisjoner kan også replikeres ved å klikke "Kopier" og "Lim inn".
    6. Når øverst til venstre, øverst til høyre, og bunnen rett også sporing områder har definert, klikker du "Bygge" å be programvaren å avgrense automatisk vise områdene av gjenværende.
    7. Klikk "Tegne skala" i området merket "Kalibrering". Bruk markøren for å trekke en horisontal linje over tallerkenen. Når linjen hentes, vises en dialogboks som er merket "Kalibrering measurement". Angi hvor godt plate og klikk "OK".
    8. Avslutt tegning manager ved å klikke ikonet "Tegne områder".
    9. Klikk på "Fliser"-ikonet.  Bruke markøren, Merk alle boksene som vises på skjermen slik at hver boks er grønn.
      Merk: Fliser ikonet vises som en gruppe av seks personlige små kvadrater
    10. "Klikk Vis | Full skjerm".  Til høyre for platen visningsområde, klikker du "Bkg" i boksen merket "Oppdagelsen terskelen". Bruk terskelen justeringslinjen for å angi piksel oppdagelsen terskelen. En gang, aktuelle pixel oppdagelsen terskelen er valgt, klikk "Bruke til Group".
      Merk: Denne protokollen angir oppdagelsen terskelen på 13 i svart modus for sebrafisk observasjoner og 110 i transparent modus for fathead ørekyte observasjoner.
    11. Angi den ønskede bevegelseshastighet sporing parametere i boksen merket "Bevegelse terskelen". Når hastigheten er angitt, klikker du "Bruk til Group".
      Merk: Denne protokollen angir små/store bevegelser på 20 mm/s og inaktive/små bevegelser på 5 mm/s. Disse valgene program programvaren å spore larver fisk bevegelse på tre ulike hastighet nivåer: inaktiv (frysing) = < 5 mm/s liten (cruising) = 5-20 mm/s, og store (bursting) = > 20 mm/s.
    12. Klikk "parametere | Protokollen parametere"fra det miste-ned menyen. I dialogboksen, velger du kategorien "Tid" Enter den observasjon og integrering. Når parametere angis klikk "Ok".
    13. Hvis du vil angi rullegardinmenyen av lys/mørke fotoperiode ganger og lysintensiteten for hver fotoperiode åpne lys driverinnstillingene dialog boksen ved å velge "Lys kjøre" fra "Parametere".
      Merk: Se protokollen video for å angi flere lys og mørke photoperiods.
    14. Når de video sporingsparametre er angitt, lagre observasjon protokollen.
      Merk: Denne protokollen observerer fisk oppførsel over en 50 min periode som inkluderer en 10 min acclimation fase etterfulgt av 4 endre lys/mørke faser som består av to 10 min lys perioder og to 10 min mørke perioder. Integrering klokkeslettet angis å måle atferd for hvert minutt av 50 min atferdsmessige rettssaken.

3. observasjon av larver fisk Locomotor og Photomotor virkemåte

  1. Plass godt platen med eksperimentelle fisk i atferdsdata opptak kammeret.
  2. I videoen sporing, åpner du sporing protokollen utviklet i trinn 3.
  3. Kontroller for å sikre at alle Larvene er synlige på skjermen, den eneste individuelle Larven er tilstede i hver brønn, og at individuelle brønner, justeres innen observasjon som ble definert i trinn 2.1.5 og 2.1.6 i video sporing-visningen.
  4. Klikk på "eksperiment | Kjøre".
    Merk: Systemet vil be brukeren om å oppgi navn og plassering for å lagre observasjon dataene.
  5. Når navn og lagringssted i observasjonen data er angitt, klikk på ikonet "Flere Live bilder" å merke alle de forhåndsdefinerte visning
    Merk: Dette ikonet er plassert øverst på skjermen og vises som en delt inn i fire mindre ruter. Klikke på dette ikonet vil markere alle forhåndsdefinert visning områder.
  6. Lukk panel av opptak kammeret og klikk "bakgrunn | Start"på dataskjermen.

4. analysere atferdsdata

  1. For å gjenerverve larver fisk aktivitetsdata, åpne regnearket som samles automatisk av sporing og i mappen angitt av brukeren før du iverksetter atferdsmessige studier (trinn 3,4).
  2. Se tallene 1A og 1B for representant målinger naiv locomotor aktivitet ueksponerte sebrafisk og fathead ørekyte larvene, henholdsvis. Se på tallene 1 c og 1 D for PMR beregninger, som effektivt undersøker omfanget av bevegelse forskjellen mellom lys til mørk til lys eller mørk overganger.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på planlagt aktivitet av ueksponerte sebrafisk (A og B) og fathead ørekyte (C og D). Mean (± SEM) avstanden svømte for sebrafisk (A) og fathead ørekyte (C) er gitt av prikker hver representerer ett minutts mellomrom aktivitet. To mørke og to lys perioder med photomotor svar måles. Sist (a, c, e og g) og (b, d, f og h) minutt av hver fotoperiode brukes til å beregne PMR. Photomotor svar av sebrafisk (B) og fathead ørekyte (D) måles som endring i gjennomsnitt (±SEM) distanse mellom siste minutt en første fotoperiode og det første minuttet av neste periode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

Koffein behandling nivåer varierer ikke merkbart under 96 h eksperimenter med sebrafisk og fathead ørekyte. Tabell 1 viser for eksempel analytisk bekreftet konsentrasjoner av nivåene behandling. Denne protokollen bekreftet vannprøver for koffein behandling nivåer av isotop-fortynning flytende kromatografi tandem massespektrometri (LC-MS/MS) vanligvis etter tidligere rapporterte metoder28. Dannelsen av paraxanthine, primære metabolitten av koffein, var også kvantifisert. En beskrivelse av disse analytisk prosedyrer finnes i analytisk tilleggsinformasjon. På grunn av likheter mellom nominell og analytisk verifisering av behandlinger presenteres nominell behandling nivåer hele resten av dette manuskriptet. Koffein betydelig endret sebrafisk og fathead ørekyte atferd. Sebrafisk locomotor svar var imidlertid stadig mer følsomme for koffein enn fathead ørekyte. Mest sensitive atferdsmessige endepunktene for sebrafisk og fathead ørekyte Larvene ble påvirket av koffein i en konsentrasjon av 0.039 mg/L. tabell 2 oppsummerer laveste observert effekt konsentrasjoner (LOECs) og ingen konsentrasjoner observerte effekt (NOECs) for hver opptreden sluttpunktet i både fisk-modeller.

Sebrafisk Fathead ørekyte
Endepunkt LOEC (mg/L) NOEC (mg/L) Endepunkt LOEC (mg/L) NOEC (mg/L)
Total distanse mørk 0.412 0.039 Total distanse mørk − 56.38
Total distanse lys 48.46 4.07 Total distanse lys − 56.38
Totalt teller mørke 0.412 0.039 Totalt teller mørke − 56.38
Totalt antall lys 48.46 4.07 Totalt antall lys − 56.38
Sprengning avstand-mørk − 193.82 Sprengning avstand-mørk − 56.38
Sprengning avstand lys 193.82 48.46 Sprengning avstand lys − 56.38
Sprengning teller mørke 193.82 48.46 Sprengning teller mørke − 56.38
Sprengning teller lys 193.82 48.46 Sprengning teller lys − 56.38
Sprengning varighet mørk 193.82 48.46 Sprengning varighet mørk − 56.38
Sprengning varighet lys − 193.82 Sprengning varighet lys − 56.38
Cruising avstand-mørk 0.412 0.039 Cruising avstand-mørk − 56.38
Cruising avstand lys 48.46 4.07 Cruising avstand lys − 56.38
Cruising teller mørke 0.412 0.039 Cruising teller mørke − 56.38
Cruising teller lys 48.46 4.07 Cruising teller lys − 56.38
Cruising varighet-mørk 0.412 0.039 Cruising varighet-mørk − 56.38
Cruising varighet lys 48.46 4.07 Cruising varighet lys − 56.38
Frysing avstand mørke 0.412 0.039 Frysing avstand mørke 0.039 0,001
Frysing avstand lys 0.039 0,001 Frysing avstand lys − 56.38
Frysing teller mørke 0.412 0.039 Frysing teller mørke − 56.38
Frysing teller lys 48.46 4.07 Frysing teller lys − 56.38
Frysing varighet mørke − 193.82 Frysing varighet mørke 56.38 14.10
Frysing varighet lys 48.46 4.07 Frysing varighet lys − 56.38
Mørk 1 PMR 48.46 4.07 Mørk 1 PMR 0.039 0,001
Lys 1 PMR 48.46 4.07 Lys 1 PMR − 56.38
Mørk 2 PMR 48.46 4.07 Mørk 2 PMR − 56.38
Lys 2 PMR 48.46 4.07 Lys 2 PMR − 56.38
Sprengning mørk 1 PMR − 193.82 Sprengning mørk 1 PMR − 56.38
Sprengning lys 1 PMR − 193.82 Sprengning lys 1 PMR − 56.38
Sprengning mørk 2 PMR 193.82 48.46 Sprengning mørk 2 PMR − 56.38
Sprengning lys 2 PMR − 193.82 Sprengning lys 2 PMR − 56.38
Cruising mørk 1 PMR 48.46 4.07 Cruising mørk 1 PMR − 56.38
Cruising lys 1 PMR 48.46 4.07 Cruising lys 1 PMR − 56.38
Cruising mørk 2 PMR 48.46 4.07 Cruising mørk 2 PMR − 56.38
Cruising lys 2 PMR 193.82 48.46 Cruising lys 2 PMR 56.38 14.10
Frysing mørk 1 PMR 48.46 4.07 Frysing mørk 1 PMR − 56.38
Frysing lys 1 PMR 193.82 48.46 Frysing lys 1 PMR − 56.38
Frysing mørk 2 PMR 48.46 4.07 Frysing mørk 2 PMR − 56.38
Frysing lys 2 PMR 193.82 48.46 Frysing lys 2 PMR − 56.38

Tabell 2: sebrafisk og fathead ørekyte atferdsmessige NOECs og LOECs for koffein. Ingen observert effekt konsentrasjon (NOEC) og laveste observert effekt konsentrasjon (LOEC) (mg/L) verdier for hver av lys/mørke svømming aktivitet sluttpunkt og photomotor svar for sebrafisk og fathead ørekyte utsatt for koffein. Streker angir at ingen effekter ble observert på et bestemt sluttpunkt over alle behandling nivåer.

Figur 2 viser totalt locomotor aktivitet og PMR av sebrafisk og fathead ørekyte etter 96 h eksponering til koffein. Fathead ørekyte Larvene PMR ble endret av koffein på lavere behandling nivåer (0.038 mg/L) enn sebrafisk, men et betydelig større antall photomotor endepunktene ble berørt i sebrafisk. Høyeste for behandling av koffein (193.82 mg/L) endret PMR sebrafisk, der disse svarene var nøyaktig motsatte fra kontroller. På dette forhøyet behandling nivået, men PMR ned i mørket og økte i lysforholdene.

Figure 2
Figur 2: Svømming aktivitet og photomotor svar sebrafisk (A og B) og fathead ørekyte (C og D) etter 96 h eksponering for koffein. Mean (± SEM) avstanden svømte for sebrafisk (A) og fathead ørekyte (C) er gitt av prikker hver representerer 1 minutters intervaller aktivitet. Photomotor svar sebrafisk (B) og fathead ørekyte (D) måles som endring i mean (± SE) total distanse mellom last minutes av en første fotoperiode og det første minuttet av neste periode. To mørke og to lys perioden photomotor svar ble målt. Totalt 24 (4 gjentak hver av 6 Larvene) sebrafisk og 12 (3 gjentak hver av 4 Larvene) fathead ørekyte ble brukt for atferdsdata observasjon. p < 0.10; p < 0,05; p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

I tillegg til å måle larver PMR, ble lyse og mørke locomotor aktivitet analysert over tre hastighet terskler for avstand flyttet, antall bevegelser og varighet av bevegelser. Disse dataene brukes til å utvikle behavioral respons profiler for koffein (Figur 3, Supplemental figur 1). I begge fisk modellene påvirket koffein hemmet aktivitet på alle betydelig locomotor endepunktene. Både fisk modeller viste økt aktivitet på sprengning hastighet tersklene etter eksponering for koffein, men ikke vesentlig. Ligner resultatene av PMR observasjoner, koffein tegnet et større antall sebrafisk locomotor endepunktene. Faktisk endret koffein betydelig flere locomotor svar under mørke forhold ved miljømessig realistisk nivåer under THV. Imidlertid er fathead ørekyte locomotor aktivitet ikke betydelig påvirket under lys av alle behandling nivå.

Figure 3
Figur 3: svar profiler av larver sebrafisk og fathead ørekyte etter 96 h eksponering for koffein. Mener sebrafisk mørk (A) og lys (B) svømming aktivitet sammenlignet med mener fathead ørekyte mørk (C) og lys (D) aktivitet etter 96 h eksponering for koffein. Plottet dataene representerer aktivitet over to 10 min mørke photoperiods og to 10 min lys photoperiods for hver fisk modell. Dataene normaliseres kontroll, som er representert på 0 aksen i hver figur. Atferdsmessige parametere inkluderer avstand svømte, antall bevegelser (teller) og varighet for hver bevegelse over 3 hastighet nivåer, sprengning (> 20 mm/s), cruising (5-20 mm/s), og frysing (< 5 mm/s). I tillegg til bevegelsesmønstre på hver av hastighet grensene, total distanse svømte, og totalt antall bevegelser er representert. ↑ representerer en betydelig økning i aktivitet i forhold til kontrollen og ↓ indikerer en betydelig reduksjon i aktivitet i forhold til kontrollen. Totalt 24 (4 gjentak hver av 6 Larvene) sebrafisk og 12 (3 gjentak hver av 4 Larvene) fathead ørekyte hvor brukt i atferdsdata observasjoner for hver gruppe. p < 0.10; p < 0,05; p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra figur 1: Photomotor svar sebrafisk (A og B) og fathead ørekyte (C og D) over tre hastighet terskler. Sebrafisk (A, B og C) og fathead ørekyte Larvene (D, E og F) photomotor svar over tre hastighet terskler (frysing: 20 mm/s) etter 96hr eksponering for koffein. Photomotor svar av sebrafisk og fathead ørekyte måles som endring i gjennomsnitt (±SE) total distanse mellom last minutes av en første fotoperiode og det første minuttet av neste periode. To mørke og to lys perioden photomotor svar ble målt. Totalt 24 (4 gjentak hver av 6 Larvene) sebrafisk og 12 (3 gjenskapninger av 4 Larvene) fathead ørekyte ble brukt for atferdsdata observasjon. * p < 0,01 Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Når du velger kjemisk behandling nivåer for atferdsdata toksikologi studier, må flere faktorer vurderes. Koffein behandling nivåer studien ble valgt basert på øvre centile verdier for spådd miljømessige eksponering scenarier fra avløpsvann avløpsvann16. Når velger vi rutinemessig behandling nivåer for vannlevende toksikologi studier med probabilistisk eksponering vurderinger av miljømessige observasjoner19,20,21. En THV, som er calculable for medisiner, var inkludert som en behandling studien. THV verdier (Eq. 1)22,23 defineres som spådde vann konsentrasjoner fører til menneskelig terapeutiske doser (Cmax) av legemidler i fisk23, er inspirert av første plasma modellering innsats24og er beregnet basert på blod: vann kjemiske partisjonering koeffisientene (Eq. 2)25.

THV = Cmax / logge PBW (Eq. 1)

logge PBW = Logg [(100.73. logge Kow · 0,16) + 0.84] (Eq. 2)

Her, velge vi også sublethal behandling nivåer i forhold til sebrafisk og fathead ørekyte LC50 verdier. Vi anser denne tilnærmingen benchmarking fremgangsmåten for atferdsdata svar, spesielt når du sammenligner terskler av spesifikk atferd med en fisk over flere kjemikalier. Den letter ytterligere beregninger av akutt til kronisk prosenter, som kan være diagnostically nyttig i akvatiske toksikologi for mekanistisk studier og vurderinger. LC50 verdier Hentet fra foreløpig toksisitet bioassay følge standardiserte retningslinjene i trinn 2.1.

I denne protokollen, vi bruker vanlige eksperimentell design og statistiske teknikker anbefalt av det amerikanske EPA og OECD standardiserte metoder for toksikologi studier med fisk modeller. Selv om vi rapportere p -verdier (f.eks., < 0,01, < 0,05, < 0,10), betydelige forskjeller (α = 0,10) i aktivitet identifiseres nivåer blant behandlinger bruker variansanalyse (ANOVA) hvis normalitet og likeverdig varians forutsetninger er oppfylt. Dunnetts eller Tukeys "HSD" post hoc tester utføres for å identifisere behandling nivå forskjeller. Vi velger dette alpha (α = 0,10) verdi å redusere type II feil, spesielt for tidlig tier analyser og når en forståelse av biologisk viktig effekt størrelsen begrenses for lite studert atferdsmessige endepunkter og modell organismer26, i stedet for ansette prosedyrer mer vanlig i biomedisinsk vitenskapene for flere sammenligninger (f.eks., Bonferroni korreksjon for RNA-Seq data)27.  Fremtidige studier for å forstå variasjon av disse atferdsdata svar og potensielt endre eksperimentell design (f.eks, øke replikering) tilsvarende.

En rekke faktorer kan påvirke atferden til larver fisk i tillegg til kjemisk eksponering. For eksempel tid, alder, godt størrelse, temperatur, lysforhold og volumet av eksponering løsning i hver godt representerer viktige hensyn11,30. For disse grunner, bør forholdsregler tas til effekten av eksterne faktorer som kan påvirke locomotor oppførsel av larver under eksperimentering. Atferdsmessige observasjoner skal utføres i smale tidsvinduer (3 til 4 h) og over tidsperioder når tid av dag effekter forventes å ha minimal påvirkning på larver locomotor atferd11. I tillegg skal larver fisk vedlikeholdes på en jevn temperatur (28 ± 1 ° C i sebrafisk) og 24 ± 1 ° C for FHM og på en definert lys/mørke syklus i temperaturkontrollerte inkubatorer gjennom eksponeringen perioden. I tillegg bør temperaturen i laboratoriet hvor atferd registreres opprettholdes forhold tilnærmelsesvis eksperimentelle forhold å unngå temperatur påvirkninger på atferd. Videre bør brønner brukes under atferdsmessige observasjoner opprettholdes med konsistent volum for hver enkelt fisk.

Larver og embryonale sebrafisk PMR har tidligere blitt brukt i biomedisinsk vitenskapene for å identifisere potensielle terapeutiske mål for romanen forbindelser12,13. Denne protokollen bygger på tidligere atferdsdata forskning med sebrafisk ved å bruke 38 endepunktene for å undersøke kjemiske bioactivity av miljøgifter. Selv om koffein er en felles vannlevende miljøgifter med en forstått virkningsmekanismen (MoA), mangler mange forbindelser i handel viktige mekanistisk data. Denne protokollen kan derfor brukes til å få innsikt i MoAs for forbindelser mangler toksisitet data, inkludert kommersielle kjemikalier39. Videre gir protokollen metoder for to av de mest brukte fisk modellene. Som nevnt tidligere, mens sebrafisk er en felles modell som biomedisinsk fisk som blir stadig mer populær i økotoksikologi, fathead ørekyte brukes vanligvis som en økologiske modell for miljøvurdering programmer men har mottatt forholdsvis mindre oppmerksomhet i atferdsmessige studier med automatiserte systemer sammenlignet sebrafisk. Men det er fortsatt ingen standardisert regulatoriske metoder for fisk atferdsmessige toksikologi studier, gir denne protokollen en tilnærming for å støtte arbeidet.

Koffein vakte atferdsdata svar i fisk modellene på nivåer som er oppdaget i vannmiljøet16. Rodriguez-Gil et al. 2018 utviklet globale miljømessige eksponering distribusjoner i akvatiske systemer basert på måleverdiene koffein16. Spesielt ville 95% av spådd avløpsvann avløpsvann konsentrasjoner falle under LOECs for de mest sensitive atferdsmessige endepunktene på sebrafisk og fathead ørekyte studien (tabell 2). Selv om flere atferdsmessige effektene av koffein ble observert i sebrafisk (spesielt i mørke forhold) på miljømessig relevante nivåer, er det uklart om disse atferdsmessige endringer kan oppstå i naturlige fiskebestandene eller føre økologisk viktige uønskede resultater. Selv om det er nyttig for følsom, diagnostiske screening formål, kanskje ikke larver fisk atferdsmessige terskler representant andre livshistorie faser eller fisk i naturlige populasjoner. Videre forskning er berettiget til å bestemme om lignende behavioral respons terskler ville oppstå i naturen og angivende for uønskede resultater på de enkelte eller befolkningen nivåene av biologisk organisasjon.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Støtte for denne studien ble gitt av US National Science Foundation (prosjekt #: CHE-1339637) med ekstra støtte fra det amerikanske Environmental Protection Agency. Vi takker Dr. Jone Corrales, Dr. Lauren Kristofco, Gavin Saari, Samuel Haddad, Bekah Burket og Bridgett Hill for generelt laboratorie-støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViewPoint Zebrabox ViewPoint ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine Sigma-Aldrich C0750-100G Study chemical
Incubator VWR 9110589 Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator Thermo Fisher Scientific 35824-636 Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakers VWR 89000-200 Zebrafish exposure chambers 
500 mL glass beakers  Pyrex EW-34502-03 Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipette Eppendorf Research 5000 Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes VWR 414-004-004 Used to transfer study organisms 
48-well plates Fisher Scientific 08-772-52 Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates VWR 10062-896 Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate Sigma-Aldrich C3771 For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506 For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate  Sigma-Aldrich S5761 For reconstituted hard water
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For reconstituted hard water
z-mod recirculating system Marine Biotech Systems Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software Sigma Plot  Version 13.0 Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software Graphpad Prism Prism 5 Used to produce figures 
Autosampler/quaternary pumping system Agilent Technologies Infinity 1260 model  Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source Agilent Technologies Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer  Agilent Technologies Model 6420 Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)  Agilent Technologies 685775-914T Caffiene chromatography 
MassHunter Optimizer Software  Agilent Technologies Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaj, E., et al. Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).
  2. Schäfer, R. B., Kühn, B., Malaj, E., König, A., Gergs, R. Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems. Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).
  3. Andersen, M. E., Krewski, D. Toxicity testing in the 21st century: bringing the vision to life. Toxicological Sciences. 107 (2), 324-330 (2008).
  4. Rovida, C., Hartung, T. Re-evaluation of animal numbers and costs for in vivo tests to accomplish REACH legislation requirements for chemicals-a report by the transatlantic think tank for toxicology (t (4)). Altex. 26 (3), 187-208 (2009).
  5. Council, N. R. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , National Academies Press. (2007).
  6. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  7. Scholz, S., Fischer, S., Gündel, U., Küster, E., Luckenbach, T., Voelker, D. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment-applications beyond acute toxicity testing. Environmental Science and Pollution Research. 15 (5), 394-404 (2008).
  8. Fraysse, B., Mons, R., Garric, J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 63 (2), 253-267 (2006).
  9. Noyes, P. D., Haggard, D. E., Gonnerman, G. D., Tanguay, R. L. Advanced morphological-behavioral test platform reveals neurodevelopmental defects in embryonic zebrafish exposed to comprehensive suite of halogenated and organophosphate flame retardants. Toxicological Sciences. 145 (1), 177-195 (2015).
  10. Colón-Cruz, L., et al. Alterations of larval photo-dependent swimming responses (PDR): New endpoints for rapid and diagnostic screening of aquatic contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety. 147, 670-680 (2018).
  11. Kristofco, L. A., et al. Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine. Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).
  12. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327 (5963), 348-351 (2010).
  13. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).
  14. Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -O., Halden, R. U. Contaminants of Emerging Concern in the Environment: Ecological and Human Health Considerations. , ACS Publications. 257-273 (2010).
  15. Woudenberg, A. B., et al. Zebrafish embryotoxicity test for developmental (neuro) toxicity: Demo case of an integrated screening approach system using anti-epileptic drugs. Reproductive Toxicology. 49, 101-116 (2014).
  16. Rodríguez-Gil, J., Cáceres, N., Dafouz, R., Valcárcel, Y. Caffeine and paraxanthine in aquatic systems: Global exposure distributions and probabilistic risk assessment. Science of the Total Environment. 612, 1058-1071 (2018).
  17. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kristofco, L. A., Brooks, B. W. Global scanning of antihistamines in the environment: Analysis of occurrence and hazards in aquatic systems. Science of the Total Environment. 592, 477-487 (2017).
  20. Saari, G. N., Scott, W. C., Brooks, B. W. Global assessment of calcium channel blockers in the environment: Review and analysis of occurrence, ecotoxicology and hazards in aquatic systems. Chemosphere. , (2017).
  21. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  22. Berninger, J. P., et al. Effects of the antihistamine diphenhydramine on selected aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (9), 2065-2072 (2011).
  23. Brooks, B. W. Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later. Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).
  24. Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).
  25. Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. W. Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology. 55 (1-2), 23-34 (2001).
  26. Scheiner, S. M., Gurevitch, J. Design and Analysis of Ecological Experiments. , Oxford University Press. (2001).
  27. Nakagawa, S. A farewell to Bonferroni: the problems of low statistical power and publication bias. Behavioral Ecology. 15 (6), 1044-1045 (2004).
  28. Bean, T. G., et al. Pharmaceuticals in water, fish and osprey nestlings in Delaware River and Bay. Environmental Pollution. 232, 533-545 (2018).
  29. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behavioural Brain Research. 228 (1), 99-106 (2012).
  30. Padilla, S., Hunter, D., Padnos, B., Frady, S., MacPhail, R. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: Influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 624-630 (2011).
  31. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  32. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  33. Hutson, L. D., Liang, J. O. Making an impact: zebrafish in education. Zebrafish. 6, 119 (2009).
  34. Hutson, L. D., Liang, J. O., Pickart, M. A., Pierret, C., Tomasciewicz, H. G. Making a difference: education at the 10th international conference on zebrafish development and genetics. Zebrafish. 9 (4), 151-154 (2012).
  35. Kane, A., Salierno, J., Brewer, S. Fish models in behavioral toxicology: automated techniques, updates and perspectives. Methods in Aquatic Toxicology. 2, 559-590 (2005).
  36. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods in Ecology and Evolution. 9 (3), 460-464 (2018).
  37. Hamm, J., Wilson, B., Hinton, D. Increasing uptake and bioactivation with development positively modulate diazinon toxicity in early life stage medaka (Oryzias latipes). Toxicological Sciences. 61 (2), 304-313 (2001).
  38. Kristofco, L. A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).
  39. Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses. Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).

Tags

Miljøfag utstede 137 atferdsmessige respons profilering atferdsmessige toksikologi sebrafisk Fathead ørekyte koffein Nevro sentralstimulerende
Eksperimentell protokollen for å undersøke Behavioral respons profiler i larver fisk: programmet Nevro-stimulerende koffein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks,… More

Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine. J. Vis. Exp. (137), e57938, doi:10.3791/57938 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter