Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Experimentellt protokoll för att pröva beteendemässiga svar profiler i Larval fisk: ansökan till Neuro-stimulerande koffein

Published: July 24, 2018 doi: 10.3791/57938
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka larval zebrafiskar och fathead minnow rörelseapparaten aktiviteter och photomotor svar (PMR) med hjälp av en automatiserad mjukvara. När den integreras i gemensamma toxikologi bioassays, ger analyser av dessa beteenden ett diagnostiskt verktyg för att undersöka kemiska bioaktivitet. Detta protokoll beskrivs med koffein, en modell neurostimulant.

Abstract

Fisk modeller och beteenden används alltmer inom biomedicinsk vetenskap; fisk har dock länge varit föremål för ekologiska, fysiologiska och toxikologiska studier. Med hjälp av automatiserad digital tracking plattformar, senaste ansträngningar i neurofarmakologi utnyttjar larval fisk rörelseapparaten beteenden för att identifiera potentiella terapeutiska mål för romanen små molekyler. Liknande till dessa insatser, forskning i miljövetenskap och jämförande farmakologi och toxikologi undersöker olika beteenden av fisk modeller som diagnostiska verktyg i skiktad utvärdering av föroreningar och realtidsövervakning av ytvatten för främmande hot. Zebrafiskar är en populär larval fisk modell inom biomedicinsk vetenskap, är fathead minnow en gemensam larval fisk modell i ekotoxikologi. Fathead minnow larver har tyvärr fått betydligt mindre uppmärksamhet i beteendevetenskapliga studier. Här, vi utveckla och demonstrera en beteendevetenskaplig profil-protokollet använder koffein som en modell neurostimulant. Även photomotor Svaren av fathead promelas påverkades ibland av koffein, zebrafiskar var betydligt mer känsliga för photomotor och rörelseapparaten slutpunkter, som svarat på miljömässigt relevanta nivåer. Framtida studier behövs för att förstå jämförande beteendemässiga känslighet skillnader bland fiskar med ålder och tid på dagen, och att avgöra om liknande beteendemässiga effekter skulle uppstå i naturen och vara vägledande för negativa resultat på enskilde eller befolkningsnivåer av biologisk organisation.

Introduction

Även om fisk modeller används alltmer för biomedicinska studier, har fisk rutinmässigt använts för studier av ekologi och fysiologi, att undersöka kontaminering av ytvatten och förstå toxikologiska gränsvärden av kemikalier. Sådana insatser är viktiga eftersom kemiska föroreningar kan försämra akvatiska ekosystem och äventyra kvaliteten på källa vattenförsörjning1,2. De flesta av kemikalier i handel, dock saknas även grundläggande toxikologi information3.

Djurmodell analyser som traditionellt använts i föreskrivande toxicitetstester är resurskrävande och inte ger hög genomströmning, tidig tier screening behövs för toxicitet i 21st century4. Därefter finns det en växande drivkraft att anta och utnyttja in vitro- modeller som kan snabbare och mer effektivt skärmen föreningar för biologiska aktiviteter3,5. Även om cellbaserade modeller presentera många möjligheter, de saknar ofta biologisk komplexitet, och står alltså inte för många viktiga hela organismen processer, inklusive metabolism6.

Zebrafiskar är en gemensam biomedicinsk djurmodell som vinner popularitet som ett alternativ modell i vattenlevande toxikologi och ekotoxikologi7,8. Med tanke på deras ringa storlek, snabb utveckling och hög fruktsamhet, kan fisk modeller användas för att snabbt och effektivt skärmen kemikalier för bioaktiviteten och toxicitet vid den hela organism skala9. Med hjälp av automatiserad mjukvara ger larval zebrafiskar beteenden förbättrade diagnostiska verktyg i screening föroreningar för toxicitet10,11. Studier i de farmaceutiska vetenskaperna har visat att rörelseapparaten slutpunkter är informativa av kemiska verkningsmekanismer, kan användas till fenotyp beteenden och sedan identifiera preliminärt subcellulär mål för romanen molekyler12, 13. Zebrafiskar är en populär larval fisk modell inom biomedicinsk vetenskap, fathead minnow är en gemensam, ekologiskt viktiga fisk-modell som används för ekotoxikologiska studier och under blivande (t.ex. nya kemiska utvärderingar) och retrospektiv (t.ex. omgivande ytvatten eller avlopp spillvatten ansvarsfrihet övervakning) miljöbedömningar. Beteendemässiga Svaren av larval fathead promelas har tyvärr fått markant mindre uppmärksamhet än zebrafisk. Vår pågående forskning med två gemensamma larval fisk modeller, zebrafiskar och fathead minnow, antyder att larver fiskar simma mönster visas unika för förväntade lägen eller verkningsmekanismer för olika kemikalier. Således ger beteendemässiga slutpunkter potential att snabbt och känsligt undersöka kemikalier för toxicitet och att identifiera subcellulär mål för industriella kemiska och andra föroreningar, särskilt under tidig tier bedömningar.

Vi rapporterar här, ett protokoll för att pröva beteendemässiga svar profiler i larval fisk. Vi visar dessa metoder använder koffein, en modell neurostimulant och en gemensam vattenlevande förorening som introduceras till akvatiska system genom utsläpp från avloppsvatten behandlingar växter efter konsumtion av livsmedel, drycker, och läkemedel formulerat med koffein14. Vi undersöker beteendemässiga Svaren till koffein i båda larval zebrafiskar och fathead minnow, inklusive till en plötslig förändring i belysning villkorar, som ofta kallas ett photomotor svar (PMR) under farmaceutiska studier med embryonala och larver Zebrafiskar13,15. Vi har ytterligare identifiera effekterna av koffein över flera rörelseapparaten slutpunkter att utveckla kemiska svar profiler för varje fisk modell. Nivåer för behandling av koffein som används i denna studie utgör den övre centiles av exponering distributioner baserat på uppmätta miljövärden koffein16. Vi har även behandlingar referensanvändare larval fisk LC50 värdena och terapeutiska hazard värdet (THV), en farmaceutisk koncentration i vatten som förväntas resultera i plasmanivåer i fisk konsekvent med en plasma från människa terapeutisk dos.

Protocol

Studier i detta protokoll allmänt följa standardiserade experimentell design och rekommenderade statistisk analys riktlinjer från den US Environmental Protection Agency (EPA nr 2000.0) för fathead promelas och organisationen för ekonomiskt samarbete och Utveckling (OECD nr 236) för zebrafiskar. Dessa experimentella mönster (t.ex., öka replikering) kan ändras inom det nuvarande protokollet för framtida studier. Fiskodling villkor följer tidigare publicerad litteratur17. Alla experimentella procedurer och fisk kultur protokoll följt institutionella djur vård och användning kommittén protokoll godkändes vid Baylor University.

1. exponera fisk till kemisk behandling

  1. Förbereda koffein exponeringslösningar genom upplösning koffein i ombildade hårt vatten. Utföra lämpliga seriella utspädningar genom att späda ut högre koffein behandlingar med hårt vatten för att producera lägre nivåer för behandling av koffein.
    Obs: Tabell 1 sammanfattar varje behandling nivåer används i detta experiment.
Zebrafisk Fathead Minnow
Behandling Nominella koffein koncentration (mg/L) Uppmätta koffein koncentration (mg/L) Behandling Nominella koffein koncentration (mg/L) Uppmätta koffein koncentration (mg/L)
Kontroll 0 < LOD Kontroll 0 < LOD
75th variablen * 0,001 0,001 75th variablen * 0,001 0,001
95: e variablen * 0,039 0,013 95: e variablen * 0,039 0,009
99 variablen * 0,412 0.361 99 variablen * 0,412 0,310
THV 4.07 3,81 THV 4.07 4.12
10% LC50 48.46 46.66 10% LC50 14.1 14,7
40% LC50 193.82 186.67 40% LC50 56.38 53.91

Tabell 1: Experimental koffein behandlingar för zebrafiskar och fathead minnow experiment. Nominella och uppmätta värden av koffein för varje behandling ges. * De koffein behandlingar som används i denna studie utgör den övre centiles av exponering distributioner baserat på uppmätta miljövärden koffein16. THV: Terapeutiska Hazard värde. LOD: Detektionsgräns

  1. Häll den beredda lösningen i enskild exponering champers. Använd 100 mL glasbägare fylld med 20 mL exponering för zebrafiskar exponering chambers och 500 mL bägare med 200 mL exponering för fathead minnow exponering chambers.
  2. Med överföring pipett placera 10 zebrafiskar embryon år 4-6 h efter befruktning (hpf) i var och en av fyra replikera exponering kammare per behandling.
  3. Plats 10 fathead minnow larver åldern inom 24 timmar efter kläckning i alla tre replikera exponering kammare per behandling. För att tillgodose den större storleken av fathead minnow larver, skär spetsen på pipetten överföring av före överföring.
  4. Underhålla zebrafiskar experiment på en 16:8 h ljus: mörk Ljusperioden och en konstant temperatur på 28 ± 1 ° C. Använda samma ljusperiod regimen för fathead minnow studier, men vid en temperatur av 25 ± 1 ° C.
  5. Efter 96 h av kemisk exponering plattor belastning individuella fiskar i separata brunnar av 48 (för zebrafisk) och 24 (för fathead minnow) väl.
    1. För att säkerställa att varje väl innehåller en lika stor volym av lösningen, överföra zebrafiskar larver till 48 plattor med en 5000 µL autopipette för en 1000 µL volym per brunn. Använda autopipette att ta ut och överföra både zebrafiskar larver och exponering lösning samtidigt.
    2. På grund av sin större storlek, överföra fathead minnow larver med överföring pipett med toppen avskuren. Innan du överför fathead minnow larver till enskilda brunnar, fylla varje väl till 2 000 µL med hjälp av en autopipette. När du överför enskilda fathead larver till brunnar, Placera spetsen på pipetten överföring i väl lösningen och låt fisken att simma från pipettspetsen i brunnen.

2. kalibrering av Video-spårning parametrar

  1. Innan beteendemässiga åtgärder, ange observation och kalibrering parametrar i programvaran videospåret (se tabell för material).
    1. Placera en väl platta i inspelning kammaren med minst 1 larval fisk i en enskild brunn. Använda plattan och associerade fisk som representationer ställa kalibreringsparametrar.
    2. Videospåret programvaran, klicka på ”fil | Generera Protocol ”, som kommer att öppna en” protokoll skapande wizard ”dialogen låda. I fältet ”läge Count”, ange antalet enskilda brunnar i väl plattan och klicka sedan på ”OK”.
    3. På toppen av skärmen, klicka på ”Visa | Full Screen ”, som uppmanas att systemet visar en overhead kameravyn av väl plattan.
    4. Klicka på ikonen ”Rita områden”, som visas som tre mångfärgade former. Till höger om väl plattan visningsyta, Välj ikonen cirkel i fältet märkt ”områden”.
    5. Använda markören för att avgränsa cirkulär videon spårning område i övre vänstra väl av väl plattan. Välj ”överst till höger markerar” och sedan beskriva visningsfältet i toppen rätt väl. Välj sedan ”botten märke” att beskriva botten rätt väl.
      Obs: Efter ritning cirkulär dispositionen, positionen kommer sannolikt behöva justeras.  Att justera position i dispositionen, klicka på ”Välj” och sedan använda markören för att flytta området beskrivs. Konturer kan också replikeras genom att klicka på ”Kopiera” och sedan ”Klistra in”.
    6. Efter längst upp till vänster, överst till höger, och botten rätt väl spåra områden har definierats, klicka på ”bygg” för att uppmana programvaran för att automatiskt avgränsa områdena visning av återstående brunnarna.
    7. I området märkt ”kalibrering”, klicka på ”Rita Scale”. Använda markören för att rita en vågrät linje över plattan. När linjen dras, visas en dialogruta som heter ”kalibrering mätning”. Ange väl plattan längden och klicka ”OK”.
    8. Avsluta ritningen chefen genom att klicka på ikonen ”Rita områden”.
    9. Klicka på ikonen ”plattor”.  Använda markören, markera alla rutor som visas på bildskärm så att varje ruta är grön.
      Obs: Ikonen plattor visas som en grupp av sex enskilda små rutor
    10. ”Klicka på Visa | Helskärmsläge ”.  Till höger om tallriken visningsyta, klickar du på ”Bkg” i rutan som heter ”påvisbara gränsen”. Använd fältet tröskelvärde justering för att ställa den pixel påvisbara gränsen. En gång, den lämpliga pixel påvisbara gränsen är markerad, klicka på ”tillämpa i grupp”.
      Obs: Detta protokoll ett tröskelvärde upptäckt 13 i svart läge för zebrafiskar observationer och 110 i öppet läge för fathead minnow observationer.
    11. Ange önskad rörelsehastighet spårning parametrar i rutan märkt ”tröskel”. När hastighet parametrar har ställts in, klicka på ”tillämpa i grupp”.
      Obs: Detta protokoll innehåller små/stora rörelser på 20 mm/s och inaktiva/små rörelser på 5 mm/s. Dessa val program programvaran att spåra larval fisk rörelse på tre olika hastigheter: inaktiva (frysning) = < 5 mm/s, små (cruising) = 5-20 mm/s, och stora (sprack) = > 20 mm/s.
    12. Klicka på ”parametrar | Protokoll parametrar ”från droppa-ned menyn. I dialogrutan, Välj fliken ”tid” retur den observation och integration. Klicka på ”Ok” när parametrar anges.
    13. Ställ den ljust/mörkt fotoperiod gånger och ljusintensitet för varje fotoperiod öppen ljus drivrutinens inställningar dialogrutan genom att välja ”Light driver” från de ”parametrarna” rullgardinsmenyn.
      Obs: Se protokollet video för inställning av flera ljus-mörker fotoperioder.
    14. Efter videon spårning parametrar har ställts in, spara protokollet observation.
      Obs: Detta protokoll har påpekat fisk beteende under en 50 min period som inkluderar en 10 min acklimatisering fas följt av 4 att ändra ljus/mörk faser bestående av två 10 min lätta perioder och två 10 min mörka perioder. Att mäta beteende för varje minut 50 min beteendemässiga rättegången ställs integration tiden.

3. observation av Larval fisk som motoriskt och Photomotor beteende

  1. Placera väl plattan innehållande experimentell fisk i behavioral inspelning kammaren.
  2. I videon spårning programvara, öppna den spårning-protokoll som utvecklats i steg 3.
  3. Kontrollera för att se till att alla larver syns på datorskärmen, det enda enskilda larvaen är närvarande i varje brunn, och att enskilda brunnar är justerade inom observation som definierades i steg 2.1.5 och 2.1.6 i visningsprogrammet för video spårning.
  4. Klicka på ”Experiment | Att köra ”.
    Obs: Systemet kommer att uppmana användaren att ange ett namn och en plats att spara observationsdata.
  5. En gång namnet och spara platsen för observationen data har angetts, klicka på ikonen ”flera livebilder” för att markera alla de fördefinierade visning områdena
    Obs: Denna ikon ligger högst upp på datorskärmen och visas som en ruta uppdelad i fyra mindre kvadrater. Klicka på denna ikon kommer att belysa alla fördefinierade visning områden.
  6. Stäng panelen inspelning avdelning och klicka på ”bakgrund | Start ”på bildskärmen.

4. analysera beteendedata

  1. För att hämta larval fisk aktivitetsdata, öppna kalkylbladet, som sammanställs automatiskt av mjukvara och är i mappen som anges av användaren innan du initierar beteendemässiga prövningar (steg 3,4).
  2. Se figurerna 1A och 1B för representativa mätningar av naiva rörelseaktivitet oexponerad zebrafiskar och fathead minnow larver, respektive. Se siffror 1 c och 1 D för PMR beräkningar, som effektivt granska omfattningen av rörelse skillnaden mellan ljusa till mörka eller mörkt ljus övergångar.

Figure 1
Figur 1: Exempel på baslinjen aktivitet oexponerad zebrafiskar (A och B) och fathead minnow (C och D). Medelvärdet (± SEM) avståndet simmade för zebrafisk (A) och fathead minnow (C) ges av prickar varje representerar en minut intervall av aktivitet. Två mörka och två lätta perioder av photomotor svar mäts. Sist (a, c, e och g) och första (b, d, f och h) minut av varje fotoperiod används för beräkning av Sebrafisken (B) svar på PMRs. Photomotor och fathead minnow (D) mäts som förändring i medelvärdet (±SEM) sträcka mellan den sista timmen en inledande fotoperiod och den första minuten av följande period. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

Koffeinnivåer behandling varierar inte märkbart under de 96 h experiment med zebrafiskar och fathead minnows. Till exempel redovisas i tabell 1 analytiskt verifierade koncentrationer av varje behandling nivå. Detta protokoll verifierade vattenprover för koffein behandling nivåer av Isotoputspädning vätskekromatografi tandem masspektrometri (LC-MS/MS) generellt efter tidigare rapporterade metoder28. Bildandet av paraxanthine, den primära metaboliten av koffein, kvantifierades också. En beskrivning av dessa analytiska förfaranden föreskrivs i de kompletterande analytisk informationen. På grund av likheterna mellan nominella och analytisk kontroll av behandlingar presenteras nominella behandling nivåer under återstoden av detta manuskript. Koffein har signifikant zebrafiskar och fathead minnow beteenden. Zebrafiskar rörelseapparaten Svaren var dock konsekvent mer känsliga för koffein än fathead minnows. De mest känsliga beteendemässiga effektmåtten för zebrafiskar och fathead minnow larver påverkades av koffein i en koncentration av 0,039 mg/L. tabell 2 sammanfattar lägsta observerade effekten koncentrationer (LOECs) och koncentrationer utan verkningar observeras (NOEC) för varje beteende endpoint i båda fisk-modellerna.

Zebrafisk Fathead minnow
Endpoint LOEC (mg/L) NOEC (mg/L) Endpoint LOEC (mg/L) NOEC (mg/L)
Total sträcka mörk 0,412 0,039 Total sträcka mörk − 56.38
Total sträcka ljus 48.46 4.07 Total sträcka ljus − 56.38
Totalt räknar mörk 0,412 0,039 Totalt räknar mörk − 56.38
Totalt räknar ljus 48.46 4.07 Totalt räknar ljus − 56.38
Spricker avstånd mörk − 193.82 Spricker avstånd mörk − 56.38
Spricker avståndet ljus 193.82 48.46 Spricker avståndet ljus − 56.38
Spricker räknar mörk 193.82 48.46 Spricker räknar mörk − 56.38
Spricker räknas ljus 193.82 48.46 Spricker räknas ljus − 56.38
Spricker Spellängd mörk 193.82 48.46 Spricker Spellängd mörk − 56.38
Spricker Spellängd ljus − 193.82 Spricker Spellängd ljus − 56.38
Cruising avstånd mörk 0,412 0,039 Cruising avstånd mörk − 56.38
Cruising avstånd ljus 48.46 4.07 Cruising avstånd ljus − 56.38
Cruising räknar mörk 0,412 0,039 Cruising räknar mörk − 56.38
Cruising räknas ljus 48.46 4.07 Cruising räknas ljus − 56.38
Cruising Spellängd mörk 0,412 0,039 Cruising Spellängd mörk − 56.38
Cruising Spellängd ljus 48.46 4.07 Cruising Spellängd ljus − 56.38
Frysa avstånd mörk 0,412 0,039 Frysa avstånd mörk 0,039 0,001
Frysning avstånd ljus 0,039 0,001 Frysning avstånd ljus − 56.38
Frysning räknar mörk 0,412 0,039 Frysning räknar mörk − 56.38
Frysning räknar ljus 48.46 4.07 Frysning räknar ljus − 56.38
Frysa Spellängd mörk − 193.82 Frysa Spellängd mörk 56.38 14.10
Frysa Spellängd ljus 48.46 4.07 Frysa Spellängd ljus − 56.38
Mörk 1 PMR 48.46 4.07 Mörk 1 PMR 0,039 0,001
Ljus 1 PMR 48.46 4.07 Ljus 1 PMR − 56.38
Mörk 2 PMR 48.46 4.07 Mörk 2 PMR − 56.38
Ljus 2 PMR 48.46 4.07 Ljus 2 PMR − 56.38
Spricker mörk 1 PMR − 193.82 Spricker mörk 1 PMR − 56.38
Spricker ljus 1 PMR − 193.82 Spricker ljus 1 PMR − 56.38
Spricker mörk 2 PMR 193.82 48.46 Spricker mörk 2 PMR − 56.38
Spricker ljus 2 PMR − 193.82 Spricker ljus 2 PMR − 56.38
Cruising mörk 1 PMR 48.46 4.07 Cruising mörk 1 PMR − 56.38
Cruising ljus 1 PMR 48.46 4.07 Cruising ljus 1 PMR − 56.38
Cruising mörk 2 PMR 48.46 4.07 Cruising mörk 2 PMR − 56.38
Cruising ljus 2 PMR 193.82 48.46 Cruising ljus 2 PMR 56.38 14.10
Frysa mörk 1 PMR 48.46 4.07 Frysa mörk 1 PMR − 56.38
Frysa ljus 1 PMR 193.82 48.46 Frysa ljus 1 PMR − 56.38
Frysa mörk 2 PMR 48.46 4.07 Frysa mörk 2 PMR − 56.38
Frysa ljus 2 PMR 193.82 48.46 Frysa ljus 2 PMR − 56.38

Tabell 2: zebrafiskar och fathead minnow beteendemässiga NOEC och LOECs för koffein. Inga observerade effekt koncentration (NOEC) och lägsta observerade effekt koncentration (LOEC) (mg/L) värden för varje ljus/mörker simning aktivitet slutpunkter och photomotor svar för zebrafiskar och fathead promelas utsätts för koffein. Streck anger att inga effekter observerades på en viss endpoint över alla behandling nivåer.

Figur 2 presenterar totala rörelseaktivitet och PMRs av zebrafisk och fathead minnow efter 96 h exponering för koffein. Fathead minnow larver PMRs förändrades av koffein på lägre nivåer av behandling (0.038 mg/L) än zebrafisk, men ett betydligt större antal photomotor slutpunkter påverkades i zebrafiskar. Högsta behandling koffein (193.82 mg/L) förändrad PMR hos zebrafiskar, där dessa svar var exakt motsatt från kontroller. På denna förhöjda behandling, dock PMRs minskade i mörka och ökade i ljusförhållanden.

Figure 2
Figur 2: Simsport och photomotor svar av Sebrafisken (A och B) och fathead minnow (C och D) efter 96 h exponering för koffein. Medelvärdet (± SEM) avståndet simmade för zebrafisk (A) och fathead minnow (C) ges av prickar varje representerar 1-min intervaller på aktivitet. Photomotor svaren från zebrafisk (B) och fathead minnow (D) mäts som förändring i medelvärdet (± SE) totala sträcka mellan last minutes av en inledande fotoperiod och den första minuten av följande period. Två mörka och två lätta perioden photomotor svar mättes. Totalt 24 (4 replikeras varje av 6 larver) zebrafiskar och 12 (3 replikeras varje av 4 larver) fathead promelas användes för beteendemässiga observation. p < 0.10; p < 0,05; p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Förutom att mäta larval PMRs, analyserades ljusa och mörka rörelseaktivitet över tre hastighet tröskelvärden för avstånd flyttade, antal rörelser och varaktighet av rörelser. Dessa data används för att utveckla beteendemässiga svar profiler för koffein (figur 3, Supplemental figur 1). I båda modellerna fisk påverkat koffein hämmade aktivitet alls väsentligen rörelseapparaten slutpunkter. Både fisk modeller visat ökad aktivitet vid sprängning hastighet tröskelvärdena efter exponering för koffein, men inte nämnvärt. Liknar resultaten av PMR observationerna, koffein verkställde ett större antal zebrafiskar rörelseapparaten slutpunkter. I själva verket signifikant koffein flera rörelseapparaten Svaren under mörka förhållanden på miljömässigt realistiska nivåer under THV. Fathead minnow rörelseaktivitet påverkades dock inte signifikant under ljusförhållanden av någon behandling nivå.

Figure 3
Figur 3: svar profiler av larval zebrafiskar och fathead promelas efter 96 h exponering för koffein. Menar zebrafiskar mörkt (A) och ljus (B) simning aktivitet jämfört med menar fathead minnow mörka (C) och ljus (D) aktivitet efter 96 h exponering för koffein. Plottade data representerar aktivitet över två 10 min mörka fotoperioder och två 10 min lätta fotoperioder för varje fisk modell. Data är normaliserad till control, som är representerad på 0 axel i varje figur. Beteendemässiga parametrar inkluderar avstånd simmade, antal rörelser (antal) och varaktighet för varje rörelse över 3 hastigheter, spricker (> 20 mm/s), cruising (5 – 20 mm/s), och frysning (< 5 mm/s). Total sträcka simmade förutom rörelsemönster vid varje hastighet tröskelvärdena, och totala antalet rörelser representeras. ↑ utgör en betydande ökning i aktivitet jämfört med kontroll och ↓ indikerar en signifikant minskning i aktivitet jämfört med kontroll. Totalt 24 (4 replikeras varje av 6 larver) zebrafiskar och 12 (3 replikeras varje av 4 larver) fathead minnow där används i beteendemässiga observationer för varje grupp. p < 0.10; p < 0,05; p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Photomotor svaren från zebrafisk (A och B) och fathead minnow (C och D) över tre hastighet tröskelvärden. Sebrafisken (A, B och C) och fathead minnow larver (D, E och F) photomotor svar över tre hastighet tröskelvärden (frysning: 20 mm/s) efter 96 Tim exponering för koffein. Photomotor svar hos zebrafiskar och fathead minnow mäts som förändring i medelvärdet (±SE) totala sträcka mellan last minutes av en inledande fotoperiod och den första minuten av följande period. Två mörka och två lätta perioden photomotor svar mättes. Totalt 24 (4 replikeras varje av 6 larver) zebrafiskar och 12 (3 replikat av 4 larver) fathead promelas användes för beteendemässiga observation. * p < 0,01 vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

När du väljer kemisk behandling nivåer för beteendemässiga toxikologistudier, måste flera faktorer beaktas. Behandling koffeinnivåer i den aktuella studien valdes ut baserat på övre variablen värden för förväntade miljömässiga exponeringsscenarier från avloppsvatten avloppsvatten16. När det är möjligt väljer vi rutinmässigt för vattenlevande toxikologistudier med probabilistiska exponering bedömningar av miljömässiga observationer19,20,21nivåer på behandling. En THV, som är calculable för läkemedel, ingick också som en behandling i den aktuella studien. THV värden (ekv. 1)22,23 definieras som förutspådde vatten koncentrationer leder till humana terapeutiska doser (Cmax) av läkemedel i fisk23, inspirerade från inledande plasma modellering insatser24och är beräknat på blod: vatten kemiska partitionering koefficienter (ekv 2)25.

THV = Cmax / log PBW (ekv. 1)

log PBW = log [(100,73. log Kow · 0,16) + 0.84] (ekv 2)

Här väljer vi också subletala behandling nivåer i förhållande till zebrafiskar och fathead minnow LC50-värden. Vi anser detta synsätt en användbar benchmarking-förfarande för beteendemässiga svar, särskilt när man jämför trösklar av specifika beteenden med en fisk modell över flera kemikalier. Det underlättar ytterligare beräkningar av akut till kronisk nyckeltal, som kan vara diagnostiskt användbar i vattenlevande toxikologi för mekanistiska studier och utvärderingar. LC50-värden erhölls från preliminära toxicitet bioassays standardiserade riktlinjer i steg 2.1.

I detta protokoll, vi anställer gemensamma experimentell design och statistiska metoder rekommenderas av US EPA och OECD standardiserade metoder för toxikologiska studier med fisk modeller. Även om vi rapportera p värden (t.ex., < 0,01, < 0,05, < 0,10), signifikanta skillnader (α = 0,10) i aktivitet identifieras nivåer bland behandlingar med variansanalys (ANOVA) om normalitet och likvärdighet av variansen antaganden är uppfyllda. Dunnetts eller Tukey's HSD post hoc-test utförs för att identifiera behandling nivåskillnader. Vi väljer denna alpha (α = 0,10) värde för att minska typ II fel, särskilt för tidig tier analyser och när en förståelse av biologiskt viktiga effekt storlek är begränsad för understudied beteende endpoints och modell organismer26, i stället för anställa förfaranden vanligare inom biomedicinsk vetenskap för multipla jämförelser (t.ex., Bonferroni korrigering för RNA-Seq data)27.  Framtida studier behövs för att förstå variationer av dessa beteendemässiga svar och eventuellt ändra experimentell mönster (t.ex., öka replikering) därefter.

Ett antal faktorer kan påverka beteendet hos larver fisk förutom kemisk exponering. Exempelvis tiden av dagen, ålder, bra storlek, temperatur, ljusförhållanden och volym exponering lösning i varje väl representerar viktiga överväganden11,30. Av dessa skäl bör försiktighetsåtgärder vidtas för att minimera effekterna av externa faktorer som kunde påverka rörelseapparaten beteende av larval fisken under experiment. Beteendemässiga observationer bör utföras i smala tidsfönster (3 till 4 h) och över tidsperioder när tiden för dagen effekter förväntas ha minimal påverkan på larval rörelseapparaten beteende11. Larval fisk bör dessutom bibehållas vid en jämn temperatur (28 ± 1 ° C för zebrafisk) och 24 ± 1 ° C för FHM och på en definierad ljus/mörk cykel i temperaturreglerade inkubatorer under hela exponeringen. Temperaturen i laboratoriet där beteenden registreras bör dessutom bibehållas villkor tillnärma experimentella förhållanden att undvika temperaturpåverkan på beteenden. Ytterligare, brunnar används under beteendemässiga observationer bör behållas på en konsekvent volym för varje individuella fiskar.

Larver och embryonala zebrafiskar PMRs har tidigare använts i biomedicinsk vetenskap för att identifiera potentiella terapeutiska mål för romanen ämnen12,13. Detta protokoll expanderar på tidigare beteendevetenskaplig forskning med zebrafisk genom att utnyttja 38 slutpunkter för att undersöka kemiska bioaktivitet av miljöföroreningar. Även om koffein är en gemensam vattenlevande förorening med en förstås verkningsmekanism (MoA), saknar många föreningar i commerce viktiga mekanistiska data. Detta protokoll kan därför användas för att få inblick i MoAs för föreningar saknar toxicitetsdata, inklusive kommersiella kemikalier39. Protokollet ger dessutom metoder för två av de vanligaste fisk-modellerna. Som nämnts tidigare, medan zebrafiskar är en gemensam biomedicinsk fisk modell som blir allt populärare i ekotoxikologi, det fathead minnow används ofta som en ekologisk modell för miljöbedömning program men har fått jämförelsevis mindre uppmärksamhet i beteendevetenskapliga studier med automatiserade system jämfört med zebrafiskar. Men det finns fortfarande inga standardiserade regelverk metoder för fisk beteendemässiga toxikologistudier, ger detta protokoll en strategi för att stödja framtida insatser.

Koffein framkallade beteendemässiga svaren i varje fisk modell på nivåer som har upptäckts i vattenmiljön16. Rodriguez-Gil et al. 2018 utvecklat globala miljöexponering distributioner i akvatiska system baserat på uppmätta värden av koffein16. Specifikt, skulle 95% av förutsedd avloppsvatten avloppsvatten koncentrationer understiga LOECs för de mest känsliga beteendemässiga effektmåtten av zebrafisk och fathead minnow i den aktuella studien (tabell 2). Även om flera beteendemässiga effekter av koffein hos zebrafiskar (särskilt i mörka förhållanden) på miljömässigt relevanta nivåer, är det oklart huruvida dessa beteendemässiga förändringar kan uppstå i naturliga fiskbestånd eller resultera i ekologiskt viktiga negativa resultat. Även användbar för screening för känslig, diagnostiska ändamål, larval fisk beteendemässiga tröskelvärden inte företrädare för andra liv historia skeden eller fisk i naturliga populationer. Ytterligare forskning är befogad för att avgöra om liknande beteendemässiga svar trösklar skulle uppstå i naturen och vara vägledande för negativa resultat på enskilda eller befolkningen nivåer av biologisk organisation.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Stöd för denna studie lämnades av US National Science Foundation (projekt nr: CHE-1339637) med ytterligare stöd från U.S. Environmental Protection Agency. Vi tackar Dr. Jone Corrales, Dr. Lauren Kristofco, Gavin Saari, Samuel Haddad, Bekah Burket och Bridgett Hill för allmänna lab stöd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ViewPoint Zebrabox ViewPoint ZebraLab and ZebraLab platform for automated behavioral observations
Caffeine Sigma-Aldrich C0750-100G Study chemical
Incubator VWR 9110589 Maintains light/dark cycle and temperature for fathead minnow experiments
Incubator Thermo Fisher Scientific 35824-636 Maintains light/dark cycle and temperature for zebrafish experiments
100 mL glass beakers VWR 89000-200 Zebrafish exposure chambers 
500 mL glass beakers  Pyrex EW-34502-03 Fathead minnow exposure chambers
5,000 µL auto-pipette Eppendorf Research 5000 Used to fill individual wells in well plates
Transfer Pippettes VWR 414-004-004 Used to transfer study organisms 
48-well plates Fisher Scientific 08-772-52 Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates VWR 10062-896 Larval fathead minnow behavioral recording chambers
Calcium sulfate dihydrate Sigma-Aldrich C3771 For reconstituted hard water
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506 For reconstituted hard water
Sodium Bicarbonate  Sigma-Aldrich S5761 For reconstituted hard water
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For reconstituted hard water
z-mod recirculating system Marine Biotech Systems Recirculating system to maintian zebrafish cultures
Statistical analysis software Sigma Plot  Version 13.0 Used to analyze beahvioral data and produce figures
Statistical analysis software Graphpad Prism Prism 5 Used to produce figures 
Autosampler/quaternary pumping system Agilent Technologies Infinity 1260 model  Analytical verification of caffeine treatment levels
Jet stream thermal gradient electrospray ionization source Agilent Technologies Analytical verification of caffeine treatment levels
Triple quadrupole mass analyzer  Agilent Technologies Model 6420 Analytical verification of caffeine treatment levels
10 cm × 2.1 mm Poroshell 120 SB-AQ column (120Å, 2.7)  Agilent Technologies 685775-914T Caffiene chromatography 
MassHunter Optimizer Software  Agilent Technologies Determine the ionization mode, monitored transitions, and instrumental parameters for caffeine/caffeine-d9 and paraxanthine/paraxanthine-d6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malaj, E., et al. Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).
  2. Schäfer, R. B., Kühn, B., Malaj, E., König, A., Gergs, R. Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems. Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).
  3. Andersen, M. E., Krewski, D. Toxicity testing in the 21st century: bringing the vision to life. Toxicological Sciences. 107 (2), 324-330 (2008).
  4. Rovida, C., Hartung, T. Re-evaluation of animal numbers and costs for in vivo tests to accomplish REACH legislation requirements for chemicals-a report by the transatlantic think tank for toxicology (t (4)). Altex. 26 (3), 187-208 (2009).
  5. Council, N. R. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , National Academies Press. (2007).
  6. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  7. Scholz, S., Fischer, S., Gündel, U., Küster, E., Luckenbach, T., Voelker, D. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment-applications beyond acute toxicity testing. Environmental Science and Pollution Research. 15 (5), 394-404 (2008).
  8. Fraysse, B., Mons, R., Garric, J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 63 (2), 253-267 (2006).
  9. Noyes, P. D., Haggard, D. E., Gonnerman, G. D., Tanguay, R. L. Advanced morphological-behavioral test platform reveals neurodevelopmental defects in embryonic zebrafish exposed to comprehensive suite of halogenated and organophosphate flame retardants. Toxicological Sciences. 145 (1), 177-195 (2015).
  10. Colón-Cruz, L., et al. Alterations of larval photo-dependent swimming responses (PDR): New endpoints for rapid and diagnostic screening of aquatic contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety. 147, 670-680 (2018).
  11. Kristofco, L. A., et al. Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine. Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).
  12. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327 (5963), 348-351 (2010).
  13. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).
  14. Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -O., Halden, R. U. Contaminants of Emerging Concern in the Environment: Ecological and Human Health Considerations. , ACS Publications. 257-273 (2010).
  15. Woudenberg, A. B., et al. Zebrafish embryotoxicity test for developmental (neuro) toxicity: Demo case of an integrated screening approach system using anti-epileptic drugs. Reproductive Toxicology. 49, 101-116 (2014).
  16. Rodríguez-Gil, J., Cáceres, N., Dafouz, R., Valcárcel, Y. Caffeine and paraxanthine in aquatic systems: Global exposure distributions and probabilistic risk assessment. Science of the Total Environment. 612, 1058-1071 (2018).
  17. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kristofco, L. A., Brooks, B. W. Global scanning of antihistamines in the environment: Analysis of occurrence and hazards in aquatic systems. Science of the Total Environment. 592, 477-487 (2017).
  20. Saari, G. N., Scott, W. C., Brooks, B. W. Global assessment of calcium channel blockers in the environment: Review and analysis of occurrence, ecotoxicology and hazards in aquatic systems. Chemosphere. , (2017).
  21. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  22. Berninger, J. P., et al. Effects of the antihistamine diphenhydramine on selected aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (9), 2065-2072 (2011).
  23. Brooks, B. W. Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later. Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).
  24. Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).
  25. Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. W. Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology. 55 (1-2), 23-34 (2001).
  26. Scheiner, S. M., Gurevitch, J. Design and Analysis of Ecological Experiments. , Oxford University Press. (2001).
  27. Nakagawa, S. A farewell to Bonferroni: the problems of low statistical power and publication bias. Behavioral Ecology. 15 (6), 1044-1045 (2004).
  28. Bean, T. G., et al. Pharmaceuticals in water, fish and osprey nestlings in Delaware River and Bay. Environmental Pollution. 232, 533-545 (2018).
  29. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behavioural Brain Research. 228 (1), 99-106 (2012).
  30. Padilla, S., Hunter, D., Padnos, B., Frady, S., MacPhail, R. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: Influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 624-630 (2011).
  31. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  32. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  33. Hutson, L. D., Liang, J. O. Making an impact: zebrafish in education. Zebrafish. 6, 119 (2009).
  34. Hutson, L. D., Liang, J. O., Pickart, M. A., Pierret, C., Tomasciewicz, H. G. Making a difference: education at the 10th international conference on zebrafish development and genetics. Zebrafish. 9 (4), 151-154 (2012).
  35. Kane, A., Salierno, J., Brewer, S. Fish models in behavioral toxicology: automated techniques, updates and perspectives. Methods in Aquatic Toxicology. 2, 559-590 (2005).
  36. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods in Ecology and Evolution. 9 (3), 460-464 (2018).
  37. Hamm, J., Wilson, B., Hinton, D. Increasing uptake and bioactivation with development positively modulate diazinon toxicity in early life stage medaka (Oryzias latipes). Toxicological Sciences. 61 (2), 304-313 (2001).
  38. Kristofco, L. A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).
  39. Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses. Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).

Tags

Miljövetenskap utfärda 137 beteendemässiga svar profilering beteendemässiga toxikologi zebrafiskar Fathead Minnow koffein Neuro stimulerande
Experimentellt protokoll för att pröva beteendemässiga svar profiler i Larval fisk: ansökan till Neuro-stimulerande koffein
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks,… More

Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine. J. Vis. Exp. (137), e57938, doi:10.3791/57938 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter