Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generatie en On-Demand inleiding van Acute Ictale activiteit in knaagdier en menselijk weefsel

doi: 10.3791/57952 Published: January 19, 2019

Summary

Acute inbeslagneming modellen zijn belangrijk voor de studie van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de epileptiform gebeurtenissen. Bovendien biedt de mogelijkheid om het genereren van epileptiform evenementen op afroep een zeer efficiënte methode om te bestuderen van de exacte volgorde van de gebeurtenissen ten grondslag liggen aan hun inleiding. Hier beschrijven we de acute 4-aminopyridine corticale inbeslagneming modellen gevestigd in muis en menselijk weefsel.

Abstract

Controle van de vangsten, blijft een uitdagende kwestie voor de medische gemeenschap. Onderzoekers moeten om vorderingen te maken, een manier om uitvoerig bestuderen van inbeslagneming dynamiek en onderzoeken van de onderliggende mechanismen. Acute inbeslagneming modellen zijn handig, bieden de mogelijkheid voor het uitvoeren van elektrofysiologische opnames, en een grote hoeveelheid electrographic inbeslagneming-achtige (Ictale) gebeurtenissen kunnen genereren. De veelbelovende resultaten van acute inbeslagneming modellen kunnen vervolgens aan chronische epilepsie modellen en klinische proeven worden vooruitgegaan. Dus, bestuderen van de vangsten in acute modellen die getrouw het repliceren van de electrographic en dynamische handtekeningen van een klinische inbeslagneming is essentieel voor het maken van klinisch relevante bevindingen. Bestuderen van Ictale gebeurtenissen in acute inbeslagneming modellen bereid uit menselijk weefsel is ook belangrijk voor het maken van de bevindingen die klinisch relevant zijn. De belangrijkste focus in dit document is op de corticale 4-AP model vanwege zijn veelzijdigheid in Ictale gebeurtenissen genereert in zowel in vivo en in vitro studies, evenals in zowel muis en menselijk weefsel. De methoden in dit artikel zal ook beschrijven een alternatieve methode van inbeslagneming inductie met behulp van de nul-Mg2 + model en bieden een gedetailleerd overzicht van de voordelen en beperkingen van de activiteit van de epileptiform-achtige gegenereerd in de verschillende acute inbeslagneming modellen. Bovendien, door te profiteren van verkrijgbare optogenetic muis stammen, een lichte puls van korte (30 ms) kan worden gebruikt om een identiek zijn aan die welke voorkomen spontaan Ictale gebeurtenis te activeren. 30-100 ms soezen van neurotransmitters (Gamma-Amino Boterzuur of glutamaat) kunnen ook worden toegepast op het menselijke weefsel trigger Ictale gebeurtenissen die identiek zijn aan die welke voorkomen spontaan. De mogelijkheid om te activeren Ictale gebeurtenissen op afroep in acute inbeslagneming modellen biedt de pas ontdekte mogelijkheid om te observeren de exacte volgorde van de gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan de inbeslagneming initiatie dynamiek en efficiënt het evalueren van potentiële anti-epilepsie therapieën.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Acute inbeslagneming modellen kunnen met succes reproduceren electrographic handtekeningen die doet denken aan Ictale gebeurtenissen waargenomen in het electroencephalogram (EEG) van individuen een beslaglegging te ervaren. Onderzoekers gebruiken deze Ictale-achtige gebeurtenissen (hierna te noemen 'Ictale events') als surrogaten voor de inbeslagneming gebeurtenis1. Klinisch, dienen Ictale gebeurtenissen als een betrouwbare proxy voor inbeslagneming evenementen omdat vangsten zijn een neurologische aandoening die afkomstig van de hersenen is. In de controle unit van epilepsie, neurologen zijn afhankelijk van de opsporing van Ictale gebeurtenissen isoleren voor resectie2te bevestigen de epileptogene regio van de hersenen. Op de intensive care toezicht op artsen Ictale activiteit om te beoordelen wanneer een activiteit van de inbeslagneming ingetogen patiënten3 blijft. Controle van de vangsten blijft een uitdagende kwestie voor de medische gemeenschap, worden als 30% van de epilepsie patiënten drug resistent tegen de beschikbare medicatie4,5 zijn, en 10% van de medische gevallen waarbij drug-induced toevallen reageert niet op de standaardbehandeling3. Dit presenteert een ernstig probleem voor de samenleving, zoals 10% van de Amerikaanse bevolking is verkenden om te ervaren een inbeslagneming gebeurtenis in hun leven en 3% worden verwacht om epilepsie6.

Vangsten in chronische epilepsie modellen bestuderen is duur, arbeidsintensief en vaak maanden duren om te bereiden7. Het is ook moeilijk uit te voeren van elektrofysiologische opnames in vrij bewegende dieren. Klinische testen worden geconfronteerd met soortgelijke problemen, evenals extra complexiteit aan de patiënt toestemming, variabiliteit in de achtergronden van de deelnemers en de morele en ethische overwegingen betrokken8gerelateerde. Acute inbeslagneming modellen, aan de andere kant, zijn gunstig omdat ze relatief gemakkelijk te bereiden, kosten-efficiënte en geschikt voor het genereren van grote hoeveelheden Ictale gebeurtenissen voor studie9. Bovendien, wordt het weefsel vastgesteld in een stabiele positie, zodat de voorwaarden ideaal zijn voor het uitvoeren van de elektrofysiologische opnames nodig om te studeren van de dynamiek van de inbeslagneming en de bijbehorende onderliggende pathofysiologie. Acute inbeslagneming modellen blijven gunstig over in silico (computer) modellen, omdat ze zijn gebaseerd op biologisch materiaal bestaat uit de hersenen samenstellende neuronale netwerk met al zijn inherente factoren en synaptische verbinding, die niet kan worden vastgelegd modellen10door zelfs de meest gedetailleerde computer. Deze functies maken acute inbeslagneming modellen klaar om efficiënt op de screening voor potentiële anti-epilepsie therapieën en het maken van de voorlopige bevindingen voor het bevorderen van hen voor verder onderzoek in chronische epilepsie modellen en klinische proeven.

Acute inbeslagneming modellen zijn meestal ontleend aan de normale hersenweefsel die hyper-prikkelbaar voorwaarden heeft ondergaan. Om klinisch relevante Ictale gebeurtenissen in gezonde hersenweefsel, is het belangrijk om te begrijpen dat de hersenen optimaal functioneert in een kritieke toestand11 waar (E) excitatie en inhibitie (I) zijn evenwichtige12. Een verstoring van de E-ik evenwicht kan leiden tot de staat van de hyper-prikkelbaar inbeslagneming waarin neerslag Ictale gebeurtenissen. Daarom in dit conceptuele kader, er zijn twee belangrijke strategieën voor het genereren van Ictale gebeurtenissen in hersenen plakjes (in vitro) of in geheel-hersenen (in vivo) preparaten: verhoogd of verminderde remming ("disinhibitie") excitatie ("niet-disinhibitie"). Echter Ictale gebeurtenissen worden hoogst gerangschikt en gesynchroniseerd evenementen waarvoor de invloed van GABAergic interneuronen te orkestreren van de neurale netwerk activiteit13,14. Om deze reden zijn niet-disinhibitie modellen het meest effectief voor genereren Ictale evenementen in geïsoleerde neurale netwerken, zoals in een in vitro brain slice15, overwegende dat de in vitro disinhibitie modellen vaak leiden tot een stekelige activiteit denken aan The-achtige stekelige. Bovendien, deze conceptuele kader, een kortstondige synchroniseren gebeurtenis kan ook betrouwbaar leiden tot een Ictale gebeurtenis16. In feite, kan een Ictale gebeurtenis worden veroorzaakt door een kleine verstoring op de neurale systeem17 toegepast wanneer er op een kritieke toestand overgang ("bifurcatie") punt18. Traditioneel werden deze verstoringen veroorzaakt door elektrische stimulatie. De recente ontwikkeling van optogenetics in de neurowetenschappen, echter biedt nu een meer elegante strategie om kritieke toestand overgangen16.

De in dit document beschreven methoden laten zien hoe te genereren Ictale gebeurtenissen op afroep in acute inbeslagneming modellen voor zowel in vitro (stap 1 van het Protocol) en in vivo studies (stap 2 van het Protocol). Het gaat om de keuze van de regio van de hersenen, inbeslagneming inductie methode, studie type en soorten; de focus zal evenwel op de aanbevolen keuze van een acute 4-AP corticale inbeslagneming model vanwege haar veelzijdigheid in een breed scala aan studie typen. De 4-AP inbeslagneming acute in vitro model is gebaseerd op het standaardprotocol voor te bereiden op kwalitatief hoogwaardige hersenen segmenten elektrofysiologische opnames en imaging studies19. Al zijn deze protocollen gebruikt te maken van de in vitro coronale hersenen segmenten van de somatosensorische-motorische cortex van muizen16,20 en mens21. Wijzigingen voor het genereren van Ictale gebeurtenissen in dit soort hersenen segmenten zijn eerder aangetoond16 en de volledige details zijn beschreven in het Protocol hieronder. De acute in vivo 4-AP corticale inbeslagneming model is gebaseerd op het standaardprotocol voor te bereiden op een craniotomy imaging studies22. De wijziging is dat geen venster (glasplaatje) is geïnstalleerd na de craniotomy. In plaats daarvan, worden proconvulsant agenten (4-AP) topisch toegepast op de blootgestelde cortex ertoe Ictale gebeurtenissen terwijl het dier onder narcose. Om onze kennis was onze fractie de eerste om deze acute in vivo corticale inbeslagneming model in muizen16,23te ontwikkelen. De acute in vivo 4-AP corticale inbeslagneming model bereid uit volwassen muizen werd ontwikkeld ter aanvulling van de in vitro segment model uit jonge weefsel. De replicatie van de bevindingen in het volwassen in vivo inbeslagneming model helpt om te generaliseren van de bevindingen van segment modellen door de inherente problemen met betrekking tot de niet-fysiologische omstandigheden van een 2D hersenen segment (versus een 3-D geheel-hersenen structuur) en de fysiologische verschillen tussen jonge en volwassen weefsel.

De methode van op afroep Ictale gebeurtenis inleiding is aangetoond door middel van ofwel soezen van neurotransmitters met een picospritzer of optogenetic strategieën. Tot de beste van onze kennis is onze fractie de eerste Ictale gebeurtenissen in menselijk weefsel met behulp van neurotransmitters via een picospritzer16starten. Voor optogenetic strategieën is de C57BL/6 muizen stam de conventionele stam gebruikt voor het uitdrukken van transgenen. De expressie voor channelrhodopsin-2 (ChR2) in GABAergic interneuronen of glutamaterge piramidale cellen zal bieden de optionele mogelijkheid voor het genereren van Ictale gebeurtenissen op afroep met korte pulsen van licht. Geschikt optogenetic muizen stammen omvatten de verkrijgbare C57BL/6 variant die ChR2 in beide interneuronen uitdrukt, met behulp van de muis vesiculaire GABA vervoerder promotor (VGAT)24of piramidevormige cellen, met behulp van de muis thymus cel antigeen 1 promotor (Thy1)25. Deze verkrijgbare VGAT-ChR2 en Thy1-ChR2 muizen bieden de mogelijkheid om het activeren van de GABAergic neuronen of glutamaterge neuronen, respectievelijk in de neocortex met blauw (470 nm) licht. De mogelijkheid gebeurtenissen moet genereren Ictale on-demand in acute inbeslagneming modellen bieden nieuwe mogelijkheden om te studeren inbeslagneming initiatie dynamiek en efficiënt het evalueren van potentiële anti-epilepsie therapieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle onderzoek waarbij patiënten werd uitgevoerd onder een protocol dat is goedgekeurd door de University Health Network onderzoek Ethics Board overeenkomstig de verklaring van Helsinki. Procedures waarbij dieren werden overeenkomstig de richtsnoeren van de Canadese Raad over Animal Care en goedgekeurd door het Krembil Instituut Animal Care onderzoekscomité.

1. protocol I: Acute In vitro inbeslagneming Model

  1. Voorbereiding van de dissectie oplossingen en kunstmatige cerebrospinale vloeistof
    1. Carbogenate ultrazuiver water (water met een soortelijke weerstand van 18.2 MΩ·cm gefilterd) met carbogen (95% O2/5% CO2) gedurende 5 minuten met behulp van air stenen zeepbel diffusoren (beluchters voor aquaria).
      Opmerking: Air stenen kunnen worden aangesloten op van de carbogen tank regulator via standaard silicone slangen. Als lucht stenen niet beschikbaar zijn, seal dicht het einde van de Siliconen slang en porren kleine gaatjes in het zegel dat de carbogen gas aan bubble uit en carbogenate de oplossing.
    2. Bereid een dissectie-oplossing door het oplossen van de opgeloste stoffen van tabel 1 in ultrazuiver water. CaCl2 toevoegen aan een oplossing die is geweest carbogenated voor ten minste 5 min. te helpen oplossen.
      Opmerking: U kunt ook CaCl2 eerst toevoegen, zodat het gemakkelijk in een onverzadigde oplossing ontbinden kan. De oplossing, in vloeibare vorm, moet 300-320 mOsm/L en een pH van 7,4 hebben na verzadigd met carbogen.
      1. Chill de dissectie-oplossing voor 0 - 4 ° C. Laat de oplossing in de koelkast 's nachts of plaats de oplossing in de vriezer voor 1 h en voortdurend toezicht op de temperatuur.
        Opmerking: De dissectie-oplossing kan worden opgeslagen voor maximaal 3 nachten; daarna Gooi.
      2. Carbogenate de dissectie-oplossing voor 5-10 min vóór gebruik.
        Opmerking: Ideaal, de oplossing moet verschijnen als slush of overgang om slush voorafgaand aan gebruik.
    3. Knaagdier kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) door de ontbinding van de opgeloste stoffen van tabel 2 (of 3 van de tabel voor de menselijke ACSF) in ultrazuiver water bereiden. Carbogenate is de oplossing van de ACSF terwijl het in een waterbad verwarmd tot 35 ° C tot gebruik. CaCl2 toevoegen aan een oplossing die is geweest carbogenated voor ten minste 5 min. te helpen oplossen.
      Opmerking: U kunt ook CaCl2 eerst toevoegen zodat het gemakkelijker in een onverzadigde oplossing ontbinden kan. De oplossing, in vloeibare vorm, 290-320 mOsm/L en met een pH van 7,4 na verzadigd met carbogen. Oplossingen moeten in hoeveelheden van 1, 2 of 4 L afhankelijk van de duur van de experimenten worden gemaakt. Het maken van 4 L voor een volledige dag (8 h) van experimenten. De ACSF dient te geschieden verse elk dag; Bewaar het niet langer dan 1 d.
  2. Dissectie van de muis voor het verzamelen van hersenweefsel
    Opmerking: Voor menselijk weefsel, gaat u verder met de volgende stap (stap 1.3) op het maken van segmenten van de hersenen met de vibratome. De kubus-vormige blokken (1 cm3) van hersenweefsel moeten worden verkregen bij de neurochirurg met behulp van de procedures eerder beschreven26,27.
    1. Het verzamelen van alle gereedschappen en materialen die nodig zijn voor dierlijke dissecties. De werkruimte instellen voor dierlijke dissecties te bereiden.
      1. Controleer de carbogen tank (95 %O2/5%CO2) om ervoor te zorgen is niet leeg. Vervang de gasfles voorafgaand aan experimenten als er minder dan 500 psi druk blijven.
      2. Kalibreren van het vibratome (trillende blade weefsel slicer) volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Pas de vibratome instelt op een snijden amplitude van 1 mm en een snijsnelheid van 0,12 mm/s hebben.
        Opmerking: De optimale instellingen kunnen verschillen voor elke individuele trillend weefsel blade cutter; echter in het algemeen, de amplitude moet hoog en de snijsnelheid zou laag moeten zijn.
      3. De zaal van de incubatie van hersenen-segment, (dat wil zeggen, de hersenen segment houder) vullen met ACSF en het bubble met carbogen. Plaats dan de incubatie-zaal in een waterbad instellen op 35 ° C.
        Opmerking: Gebruik knaagdier ACSF voor knaagdier hersenen segmenten en menselijke ACSF voor segmenten van het menselijk brein.
    2. Het verkrijgen van een jonge muis van beide geslachten, tussen de leeftijd van 13 d (p13) tot en met 21 d (p21, waar p0 de datum van geboorte is).
    3. Anesthetize de muis met een intraperitoneale injectie van natrium pentobarbital (55 mg/kg lichaamsgewicht). Zodra de muis is diep verdoofd, zoals aangegeven door het ontbreken van de teen snuifje reflex, snel kunt een guillotine dierenarts-goedgekeurd instrument onthoofden van de muis in één snelle beweging.
      Opmerking: De natrium pentobarbital injectie volgens de procedures die zijn aanbevolen door institutionele richtsnoeren voor te bereiden.
    4. Houd de muis in de neus te stabiliseren van de onthoofde hoofd zachtjes een insnijding van de middellijn beginnen tussen de ogen van de muis en langs de gehele lengte van de hoofdhuid te bloot van de schedel. Zorg ervoor dat de schedel is niet gecomprimeerd door de druk van het scheermes. Gebruik de hoek van het scherp van de snede te verhogen van gesneden precisie.
    5. Gespreid de kleppen van de muis de hoofdhuid met behulp van de vingers bloot van de schedel. Gebruik vervolgens de verse hoek van een scherp van de snede te maken van een sneetje langs de middellijn van de schedel; Let goed op het vermijden van contact met de hersenschors.
    6. Invoegen splinter pincet in de oogkassen van de muis te stabiliseren van de onthoofde hoofd en breng dit in een petrischaal gevuld met koude (0 - 4 ° C) dissectie oplossing. Zorg ervoor dat het hoofd volledig wordt ondergedompeld in de dissectie-oplossing.
    7. Een tweede set van splinter verlostang gebruikt voor zachtjes schil weg van de muis hoofdhuid, verwijderen van de neus bone door peeling het en verwijder de achterkant (caudal zijde) van de schedel.
      Opmerking: De neus bone van jonge muizen is zeer zacht en gemakkelijk gebroken.
    8. Gebruik een micro spatel te snijden de optische zenuwen, trigeminal zenuwen en ruggemerg. Gebruik vervolgens de micro spatel om voorzichtig het scheiden van de hersenen van de schedel. Laat de hersenen volledig ondergedompeld in de petrischaal gevuld met dissectie oplossing.
  3. Voorbereiding van corticale segmenten van de somatosensorische-motorische cortex
    1. Vullen van de vibratome buffer lade met ~ 150 mL koude (0 - 4° C) dissectie oplossing.
      Opmerking: Houd desgewenst de buffer-lade in de vriezer totdat het nodig is om een lage temperatuur tijdens het snijden procedure.
    2. Lijm het hersenweefsel van muis of mens op het vibratome podium (model houder/tray) met behulp van instant Lijm lijm. Voor muizen, gesneden uit een kleine caudal gedeelte van de hersenen (dat wil zeggen, het cerebellum) zodat het gemakkelijk kan worden gelijmd plat op de monsterhouder (waardoor de rostraal kant van de hersenen onder ogen zien het plafond).
      Opmerking: U kunt ook horizontale muis hersenen segmenten kunnen bereid worden door lijmen de dorsale zijde van de hersenen naar de monsterhouder (de ventrale zijde van de hersenen moet het gezicht van het plafond)28.
    3. Plaats de monsterhouder (met hersenweefsel) zachtjes in de lade van de buffer. Zorg ervoor dat het dorsale gedeelte van de hersenen wordt geconfronteerd met de vibratome van blade.
      Opmerking: Het is cruciaal voor het minimaliseren van de hoeveelheid tijd dat de hersenen wordt blootgesteld aan lucht.
  4. Hersenen weefsel segmenteren en collectie
    1. Snijd de hersenen in 450 μm dikke plakjes met behulp van de vibratome in de dorsale ventrale richting. Ervoor zorgen dat de hersenen volledig verankerd aan het Dienblad van het specimen blijft terwijl het snijden.
      1. Maak de eerste snede in de hersenen van de muis te verwijderen van de bulbus olfactorius. Vervolgens maken verdere bezuinigingen totdat het gebied somatosensorische-motor wordt waargenomen (ligt ongeveer halverwege tussen de bulbus olfactorius en bregma).
        Opmerking: Optioneel, segment de hersenen in dunner (200 μm) plakjes totdat het corpus callosum verschijnt in de coronale weergave van de hersenen, wat dat aangeeft het gebied somatosensorische-motor is dichtbij.
    2. Gebruik een wide-boring overdracht pipet voor het verzamelen van coronale segmenten (450 μm) die de somatosensorische-motor gebied bevatten en dompelen hen in een petrischaal met koude (0 - 4 ° C) dissectie oplossing.
    3. Gebruik een nieuwe scheermesje en sneed eventuele overtollige weefsel van de segmenten. Voor coronale plakjes van muizen, verrichten een dwarse snede net onder de neocortical commissuur (d.w.z., corpus callosum). Dus knip niet af in een zaagmachines beweging; gewoon druk uitoefenen op het blad in het weefsel en gebruik een detaillering borstel voorzichtig het scheiden van het weefsel. Zorg ervoor om te minimaliseren van het verkeer van de coronale segment.
    4. Gebruik een pipet wide-boring overdracht over te dragen van het dorsale gedeelte van de coronale segmenten waarin de neocortex (layer 1-6) naar een tweede petrischaal gevuld met warm (35 ° C) ACSF voor een moment (~ 1 s). Vervolgens onverwijld overbrengen in de segmenten een cupje van de incubatie met warm (35 ° C) carbogenated ACSF.
      Opmerking: Het doel van de overdracht in de petrischaal met ACSF is om te minimaliseren van de overdracht van de dissectie oplossing aan de incubatie kamer tijdens het overzetten van hersenen segmenten met de pipet wide-boring. Gebruik maken van de incubatie van kamer meerdere putten te houden verschillende hersenen segmenten georganiseerd.
    5. Gooi de rest van de hersenen en het karkas van de dieren volgens de richtlijnen van de institutionele.
  5. Incubatie en onderhoud
    1. Laat de plakjes van de hersenen iets ondergedompeld in de zaal van de incubatie bij 35 ° C gedurende 30 minuten. Vervolgens de incubatie kamer verwijderen uit het waterbad en laat ze terugkomen op kamertemperatuur (20-25 ° C). Wacht 1 h voor de segmenten van de hersenen te herstellen voordat u elektrofysiologische opnames.
      Opmerking: Zorg ervoor er geen luchtbellen die onder de segmenten van de hersenen in het incubatie-kamer verzamelen. Luchtbellen zijn lucht-interfaces die weefselschade veroorzaken. De muis hersenen segmenten kunnen worden gehandhaafd voor 6-8 h, terwijl het menselijk hersenweefsel kan worden opgeslagen gedurende maximaal 24 uur in een zaal van de incubatie goed-carbogenated met de juiste ACSF.
  6. Elektrofysiologische opnames van de oppervlakkige laag van corticale
    Opmerking: Ictale gebeurtenissen worden waargenomen in de extracellulaire lokale potentiële (LFP) veldopnames uit segmenten van de hersenen. De LFP van het segment van de hersenen kan worden geobserveerd en geregistreerd met een interface type kamer29 of een verzonken multi elektrodenserie (MEA) systeem16. De procedure is eerder beschreven16 en aanvullende details worden hieronder beschreven.
    1. Een wide-boring overdracht pipet of een detaillering borstel gebruiken om te verplaatsen van een segment van de hersenen op iets grotere voorgesneden lens papier dat wordt gehouden in plaats met behulp van een tandheelkundige pincetten. Het papier van de lens (dat het segment van de hersenen is rustend op) overbrengen met de opname-zaal en veilig in positie met een harp-scherm.
    2. Run warm (35 ° C), carbogenated ACSF perfusaat door de kamer opnemen in het segment van de hersenen met een snelheid van 3 mL/min (~ 1 infuus/s). Gebruik een digitale thermometer om ervoor te zorgen dat de opname-kamer is 33-36° C.
    3. Trek glas elektroden met een impedantie van 1-3 MΩ van borosilicaatglas slang (met een buitendiameter van 1,5 mm) met een trekker. Aanvulling funderingsput de elektroden glas met ACSF (~ 10 µL) met behulp van een injectiespuit Hamilton. Onmiddellijk de elektrode te negeren als de tip is beschadigd.
      Opmerking: De zilveren draad (5 min) bleekmiddel en alleen een minimaal gedeelte (dat wil zeggen, het topje) van de zilver draad om te worden ondergedompeld in de ACSF rug gevulde glazen elektroden tot een minimum beperken van lawaai en drift tijdens de opnames. Eventuele overtollige ACSF verwijderen door de glazen elektrode met een spuit van de Hamilton indien nodig.
    4. Gebruik een 20 X stereo microscoop nauwkeurig de opname glaselektrode in de oppervlakkige corticale guide layer (2/3) met behulp van handmatige manipulatoren. Record-/ view de elektrische activiteit van het segment van de hersenen op een computer met standaard software.
      Opmerking: Levensvatbare (hoogwaardige) hersenen segmenten zal vertonen een robuuste evoked potentieel in reactie op de toegepaste elektrische prikkels (100 µs, 30-300 μA) of lichte pulsen (30 ms, 10 mW/mm2) voor optogenetic weefsel.
  7. Inductie van inbeslagneming-achtige activiteiten
    1. Perfuse ACSF met 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) over het segment van de hersenen. Los 80 mg 4-AP in 8,5 mL water te maken van een stamoplossing van 100 mM 4-AP. Voeg 100 µL van 100 mM 4-AP stockoplossing tot 100 mL van ACSF om een ACSF perfusaat met 100 µM 4-AP.
      Opmerking: U kunt nul-Mg2 + ACSF (tabel 4), een gewijzigde ACSF oplossing met geen toegevoegde Mg2 +, perfuse van het segment van de hersenen. Voor menselijk weefsel, gebruik een combinatie van 100 µM 4-AP in nul-Mg2 + menselijke ACSF (tabel 5) om optimale resultaten te bereiken. De gemiddelde tijd voor Ictale evenementen te verschijnen is 15 min; het duurt echter maximaal 40 min. voor sommige segmenten van de hersenen.
  8. Op afroep inbeslagneming generatie: een strategie van de optogenetic voor optogenetic muizen
    1. Toepassing van een korte (30 ms) puls van blauw (470 nm) licht (met een minimaal 1 mW/mm2 uitvoer intensiteit) tot een Ictale gebeurtenis gestart. Gebruik een handmatige manipulator om de positie van een 1.000 µm Kern diameter optische vezel (0.39 nvt) direct boven de opname-regio.
      Opmerking: Stelt het tarief van de foto-stimulatie overeenkomt met de gewenste baudrate van het voorval Ictale gebeurtenis (dat wil zeggen, 1 pulse elke 50 s). Echter kan niet het tempo overdreven worden overdreven van de intrinsieke groeisnelheid waartegen Ictale gebeurtenissen plaatsvinden.
  9. Op afroep inbeslagneming generatie: een niet-optogenetic strategie voor menselijk weefsel
    1. Plaats de hersenen segment zodat de oppervlakkige lagen stroomopwaarts zijn en de diepe lagen stroomafwaarts naar de stroom van het perfusaat door de kamer van de opname.
    2. Trek een glaselektrode (hetzelfde type als gebruikt voor de opnames van de LFP) en zachtjes aanraken haar tip met een Wisser van de delicate taak maken van een kleine opening. Aanvulling funderingsput de elektrode met ~ 25 µL van 100 mM GABA (opgelost in water) en deze koppelen aan de picospritzer. U kunt ook maakte het Internet aanvulling funderingsput de elektrode met 200 µM glutamaat (opgelost in water).
      Opmerking: Als u wilt schatten het volume van de picospritzer (~ 50 µL) worden opgeblazen, gelden een trekje van de test op een kunststof plaat (bij voorkeur gerasterde). Vervolgens passen een druppel van bekende volumes (dat wil zeggen, 10 µL, 20 µL, 50 µL of 100 µL) met een pipet voor een vergelijking met de test trekje.
    3. Soesjes van de neurotransmitter (GABA of glutamaat) toepassen door het menselijke weefsel met een picospritzer (10-20 psi voor 30-100 ms) om een Ictale gebeurtenis gestart. Een enkel trekje van 100 mM GABA op de diepe laag (5) van het hersenweefsel gebeurtenissen moet genereren Ictale in de oppervlakkige laag van toepassing (2/3). U kunt ook een enkel trekje van 200 µM glutamaat rechtstreeks op de oppervlakkige laag gebeurtenissen moet genereren Ictale in de oppervlakkige laag van toepassing.
      Opmerking: Stelt het tarief van de picospritzer bladerdeeg overeenkomt met de gewenste baudrate van het voorval Ictale gebeurtenis (dat wil zeggen, 1 pulse elke 50 s). Echter kan niet het tempo overdreven worden overdreven van de intrinsieke groeisnelheid waartegen Ictale gebeurtenissen plaatsvinden.

2. protocol II: Acute In vivo inbeslagneming Model

  1. Chirurgische voorbereiding en chirurgie
    1. Het verkrijgen van een volwassen muis (p35 - p60) van beide geslachten.
    2. Diep anesthetize muis met Ketamine (95 mg/kg) en Xylazine (5 mg/kg). Het uitvoeren van de test teen-snuifje reflex om ervoor te zorgen dat de muis is verdoofd. U kunt ook kunt Isofluraan (4% voor inductie, 1,5-2% voor chirurgie) anesthetize van de muis.
      Opmerking: De keuze van de verdoving kan invloed hebben op de inbeslagneming activiteit30,31.
    3. Monteer de muis in een stereotaxic kader door het veiligstellen van haar hoofd met oor bars. Plaats een verwarmde pad onder de muis voor de duur van de operatie.
    4. De bovenkant van de muis het hoofd met behulp van een knaagdier trimmer bloot van de hoofdhuid te scheren. Injecteren 0.3 mL van lidocaïne met een 25 G 5/8 in de naald in het beenvlies om excessief bloeden of pijn te vermijden. Oog zalf toepassen door de ogen van de muis om te voorkomen dat ze uitdrogen tijdens het experiment.
    5. Knijpen en til het midden van de hoofdhuid van de muis te beoordelen als de reflexen verdwenen zijn. Vervolgens voeren een horizontale gesneden te bloot de bregma lambda regio van de schedel. Voorzichtig schrapen de hele blootgestelde gebied van de schedel met een wattenstaafje om een droog oppervlak te maken.
    6. Voer een craniotomy van 4 mm in diameter aan coördinaten 2.0 mm lateromedial en -2,0 mm rostrocaudal de Somatosensorische cortex bloot te stellen. Markeer de locatie met een cirkel (4 mm in doorsnede) met behulp van een permanent marker. Boor rond de cirkel met een pneumatische tandheelkundige boor tot de resterende laag van het bot craniotomy geeft gemakkelijk manier wanneer omlaag geduwd. Zoutoplossing op de laag van het bot toepassen voordat u de craniotomy verwijdert met een splinter Tang. Vervolgens toepassing warme zoutoplossing op de blootgestelde regio.
  2. Opname methoden en chemische inductie van vangsten
    1. Trek glas elektroden met een impedantie van 1-3 MΩ van borosilicaatglas slang (met een buitendiameter van 1,5 mm) met een trekker. Aanvulling funderingsput de glas-elektroden met ~ 10 µL van ACSF of zoutoplossing met behulp van een Hamilton syringe. Onmiddellijk de elektrode te negeren als de tip is beschadigd.
      Opmerking: De zilveren draad (5 min) bleekmiddel en alleen een minimaal gedeelte (dat wil zeggen, het topje) van de zilver draad om te worden ondergedompeld in de ACSF rug gevulde glazen elektroden tot een minimum beperken van lawaai en drift tijdens de opnames. Eventuele overtollige ACSF verwijderen door de glazen elektrode met een spuit van de Hamilton indien nodig.
    2. Gebruik een handmatige manipulator te begeleiden van de glazen elektrode in de oppervlakkige corticale laag (2/3) op het gebied van somatosensorische-motor. Record-/ view de elektrische activiteit van het segment van de hersenen op een computer met standaard software.
      Opmerking: Layer 2/3 is ongeveer 0.3 mm diepe van de oppervlakte32.
    3. Topisch ~0.5 mL 1.5 mM 4-AP zoutoplossing op de blootgestelde cortex van de muis worden toegepast met een spuit totdat het volledig de craniotomy bedekt. Los 14 mg 4-AP in 100 mL isotonische zoutoplossing te maken van een stamoplossing 1,5 mM 4-AP zoutoplossing.
      Opmerking: Bereiden de 4-AP zoutoplossing, voordat het experiment wordt gestart. Ictale gebeurtenissen lijken gemiddeld, 15-30 min na topische applicatie.
  3. Op afroep generatie van beslagleggingen in optogenetic muizen
    1. Toepassing van een korte (30 ms) puls van blauw (470 nm) licht (met een minimum 10 mW/mm2 uitvoer intensiteit) tot een Ictale gebeurtenis gestart. Gebruik een handmatige manipulator om de positie van een 1.000 µm Kern diameter optische vezel (0.39 nvt) direct boven de opname-regio.
      Opmerking: Stelt het tarief van de foto-stimulatie overeenkomt met de gewenste baudrate van het voorval Ictale gebeurtenis (dat wil zeggen, 1 pulse elke 300 s). Echter kan niet het tempo overdreven worden overdreven van de intrinsieke groeisnelheid waartegen Ictale gebeurtenissen plaatsvinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De toepassing van 100 µM 4-AP aan kwalitatief goede (onbeschadigd) 450 µm en middelgrote corticale hersenen segmenten van een jonge VGAT-ChR2 geïnduceerde betrouwbaar terugkerende Ictale muisgebeurtenissen (> 5 s) binnen 15 min (figuur 1Ai). De toepassing van 100 µM 4-AP op segmenten van slechte kwaliteit resulteerde in barsten van gebeurtenissen of stekelige activiteit (figuur 1Aii). Gemiddeld 40% van de segmenten van de hersenen van elke ontleed muis gegenereerd met succes Ictale gebeurtenissen. Bovendien, 83% (25/30) van de ontleed muizen geresulteerd in ten minste één hersenen segment dat Ictale gebeurtenissen gegenereerd. In plakjes van de hersenen met spontaan voorkomende Ictale evenementen, de toepassing van een korte 30 ms lichte puls op de hersenen slice betrouwbaar gebeurtenis heeft veroorzaakt een Ictale was identiek in morfologie (figuur 1Aiii en 1Aiv). De dezelfde bevindingen werden gemaakt in hersenen plakjes van Thy1-ChR2 muizen (figuur 1B). Dus, ongeacht welke neuronale-subpopulatie werd geactiveerd, ieder korte synchroniseren evenement in de geïsoleerde corticale neuraal netwerk leidde tot het begin van een Ictale gebeurtenis. Deze Ictale gebeurtenissen werden samengesteld van een sentinel (preictal) spike (figuur 2Aii en 2Bii), tonic-achtige bakken (figuur 2Aiii en 2Biii), klonische-achtige bakken (figuur 2Aiv en 2Biv) en vol activiteit aan het einde (figuur 2Av en 2Bv); ze waren gelijk in de natuur aan de electrographic handtekeningen die verwant zijn met klinische vangsten33. Bovendien waren deze jonge muizen fysiologisch volwassene-achtige, zoals de toevoeging van 10 µM bumetanide (BUM), een NKCC1 blocker, geen effect op de resulterende Ictale gebeurtenissen (Figuur 2 hadden).

Het 4-AP corticale segment in vitro model betrouwbaar gegenereerd consistente Ictale gebeurtenissen voor ~ 1 h (figuur 1Ai), overwegende dat het nul-Mg2 + model gegenereerd meestal Ictale gebeurtenissen voor ~ 10 min voordat snel omzetten in burst-achtige activiteit) Figuur 3A). Echter, als een niet-4-AP-methode van inbeslagneming inductie verplicht is, de nul-Mg2 + model kan worden gewijzigd met de toevoeging van 5-10 µM baclofen (een GABAB receptoren agonist) activiteit te veranderen de barsten terug naar Ictale gebeurtenissen (figuur 3B) . In het algemeen, methoden van niet-remmingen te verhogen van prikkelbaarheid (d.w.z., 4-AP of nul-Mg2 + ACSF) betrouwbaar gereproduceerd Ictale gebeurtenissen in corticale hersenen plakjes. In tegenstelling, resulteerde methoden van disinhibitie [d.w.z., bicuculline (BMI), een GABAA receptor antagonist] in stekelige activiteit die doet denken aan The activiteit of barsten activiteit, in plaats van Ictale gebeurtenissen (figuur 4A). Ook acute inbeslagneming modellen bereid uit 100 µM 4-AP-behandeld hippocampal segmenten gegenereerd the-achtige blancobepalingen activiteit of status epilepticus-achtige omstandigheden in de CA3 (figuur 4B). De in vivo 4-AP corticale model gegenereerd dienovereenkomstig terugkerende Ictale gebeurtenissen (> 5 s). Ictale evenementen werden waargenomen in de oppervlakkige laag (2/3) binnen ~ 30 min 1.5 mM 4-AP op de blootgestelde cortex van volwassen VGAT-ChR2 muizen topisch toe te passen. De toepassing van een korte 30 ms lichte puls op de blootgestelde cortex geactiveerd betrouwbaar Ictale gebeurtenissen die waren morfologisch gelijk aan die spontaan optreedt (Figuur 5).

De toepassing van nul-Mg2 + gegenereerd menselijke ACSF met 100 µM 4-AP aan 'niet-epileptische' corticale hersenen segmenten (450 µm) van temporale kwab epilepsie patiënten betrouwbaar terugkerende Ictale gebeurtenissen (> 5 s) binnen ~ 30 min (figuur 6Ai en 6Bi). Segmenten van slechte kwaliteit gegenereerd blancobepalingen activiteit of geen activiteit (figuur 1Aii). De levensvatbaarheid van hersenen segmenten werd geacht 'goede kwaliteit' wanneer een korte elektrische prikkel (100 µs, 30-300 µA) veroorzaakte een robuuste en evoked respons in de LFP aan het begin van het experiment. Zodra Ictale gebeurtenissen begon te precipiteren, de toepassing van een korte bladerdeeg (75 ms op 20 psi) van 100 mM GABA op het segment van de hersenen geactiveerd betrouwbaar Ictale gebeurtenissen die identiek in morfologie aan degenen die zich spontaan waren (figuur 6Aii en 6Aiii) . Een lagere concentratie van GABA, 100-200 µM, zal waarschijnlijk worden effectief ook voor in vitro experimenten34; echter wordt een hogere concentratie van GABA, 100 mM, aanbevolen voor in vivo experimenten35. Dezelfde opmerkingen werden gereproduceerd wanneer een korte trekje van 200 µM glutamaat werd toegepast op menselijk brein segmenten (figuur 6Bii en 6Biii). Dus, ongeacht welke post synaptic receptoren werden geactiveerd, een korte synchroniseren in de geïsoleerde menselijke corticale neuraal netwerk betrouwbaar gebeurtenis een Ictale gebeurtenis.

Figure 1
Figuur 1: Acute in vitro 4-AP corticale inbeslagneming model. De zwarte lijnen geven de lokale veld potentiële (LFP) opname; de blauwe lijnen vertegenwoordigen de lichte stimulus. (A) deze panelen zijn gebaseerd op de resultaten van een muismodel van VGAT-ChR2. Ze illustreren Ictale gebeurtenissen waargenomen in de LFP-opname van de oppervlakkige laag (2/3) van een hoge kwaliteit corticale hersenen segment behandeld met 100 µM 4-app. ik) dit paneel toont een overzicht van de LFP opname. ii) Dit zijn voorbeelden van de LFP opname van slechte kwaliteit hersenen segmenten. De bar van de verticale schaal is 0.4 mV, de horizontale schaal bar is 20 s. iii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van een licht geactiveerd Ictale evenement. iv) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van een spontane Ictale evenement. (B) deze paneel zijn gebaseerd op de resultaten van een muismodel van Thy1-ChR2. Ze illustreren Ictale gebeurtenissen waargenomen in de LFP-opname van de oppervlakkige laag (2/3) van een segment van de corticale hersenen behandeld met 100 µM 4-app. ik) dit paneel toont een overzicht van de LFP opname. ii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van een licht geactiveerd Ictale evenement. iii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van een spontane Ictale evenement. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Ictale gebeurtenissen gegenereerd in een segment van de hersenen (layer 2/3) van een minderjarige (p13) VGAT-ChR2-muis geperfundeerd met 4-AP en bumetanide (BUM). De zwarte lijnen geven de lokale veld potentiële (LFP) opname; de blauwe lijnen vertegenwoordigen de lichte stimulus. (A) deze panelen Toon een spontane Ictale gebeurtenis. ik) dit paneel toont een overzicht van het gehele Ictale evenement. De volgende panelen Toon ii) een sentinel spike, iii) tonic-achtige afvuren, iv) klonische-achtige bakken en v) uiteenspatten van activiteit. (B) deze panelen tonen een licht geactiveerd Ictale evenement. ik) dit paneel toont een overzicht van het gehele Ictale evenement. De volgende panelen Toon ii) een licht geactiveerd sentinel piek van hetzelfde segment opname, iii) tonic-achtige afvuren, iv) klonische-achtige bakken en v) uiteenspatten van activiteit. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Acute in vitro nul-Mg corticale inbeslagneming model2 + . De zwarte lijnen geven de lokale veld potentiële (LFP) opname; de blauwe lijnen vertegenwoordigen de lichte stimulus. (A) Deze panelen zijn gebaseerd op de resultaten van een muismodel van VGAT-ChR2. ik) dit paneel toont de status epilepticus-achtige voorwaarden waargenomen in de LFP-opname van de oppervlakkige laag (2/3) van een segment van de corticale hersenen behandeld met nul-Mg2 + ACSF. ii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van een licht geactiveerd Ictale evenement. iii) Dit is een ingezoomd-in weergave van de status epilepticus-achtige vol activiteit. (B) deze panelen tonen hetzelfde segment opname met de toevoeging van baclofen. ik) de toepassing van 5 µM baclofen op de nul-Mg2 + ACSF transformeert de barst activiteit terug in overzichtelijke, periodieke Ictale gebeurtenissen. ii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van de barst activiteit. iii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van de afzonderlijke Ictale gebeurtenis. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Acute in vitro barsten/stekelige modellen. De zwarte lijnen geven de lokale veld potentiële (LFP) opname; de blauwe lijnen vertegenwoordigen de lichte stimulus. (A) deze panelen tonen de resultaten van een corticale segment van een VGAT-ChR2mouse, ter illustratie van de barst activiteit waargenomen in de oppervlakkige laag (2/3) na de toevoeging van 10 µM BMI om 100 µM 4AP. ik) Dit is een overzicht van de LFP opname. De rode stippellijn geeft aan wanneer de BMI van kracht werd. ii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van een licht geactiveerd Ictale evenement. iii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van de spontane barsten activiteit. (B) deze panelen tonen de resultaten van een hippocampal segment van een VGAT-ChR2-muis, ter illustratie van een status epilepticus-achtige gebeurtenis waargenomen op het gebied van de CA3 na de datum van de aanvraag van 100 µM 4AP. i) Dit is een overzicht van de LFP opname. ii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van een Ictale gebeurtenis. iii) Dit is een ingezoomd-in weergave van licht-geactiveerd en spontane barst van de evenementen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Acute in vivo 4-AP corticale inbeslagneming model. De zwarte lijnen geven de lokale veld potentiële (LFP) opname; de blauwe lijnen vertegenwoordigen de lichte stimulus. (A) deze panelen laten zien de resultaten van een volwassene (p56) VGAT-ChR2-muismodel met 1.5 mM 4-AP topisch toegepast op de blootgestelde cortex. ik) dit paneel illustreert een licht geactiveerd Ictale gebeurtenis waargenomen in de oppervlakkige laag (2/3) van het gebied somatosensorische-motor. ii) Dit is een weergave in-of uitgezoomd-in van de licht-geactiveerd Ictale gebeurtenis vanuit deelvenster Ai. iii) Dit is een super ingezoomd-in weergave van het intreden van het licht-geactiveerd Ictale evenement (aangegeven door de zwarte pijl). Dit cijfer is de ongefilterde versie van een figuur uit Chang et al. 16. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Acute in vitro menselijke corticale inbeslagneming model. De zwarte lijnen geven de lokale veld potentiële (LFP) opname; de bruine lijnen geven de picospritzer bladerdeeg. (A) deze panelen tonen de resultaten van een segment van de corticale hersenen van een patiënt mediale temporale kwab epilepsie (MTLE), ter illustratie van de Ictale gebeurtenissen waargenomen in de oppervlakkige laag (2/3) na een perfusie met 100 µM 4-AP en nul-Mg2 + menselijke ACSF . ik) Dit is een overzicht van de LFP opname. De volgende panelen Toon ii) in-of uitgezoomd-in uitzicht op een 100 mM GABA bladerdeeg-geactiveerd Ictale gebeurtenis en iii) een ingezoomd-in-beeld van een spontane Ictale evenement. (B) deze panelen tonen de resultaten van een segment van de corticale hersenen uit een andere patiënt van het MTLE, ter illustratie van de Ictale gebeurtenissen waargenomen in de oppervlakkige laag (2/3) na een perfusie met 100 µM 4-AP en nul-Mg2 + menselijke ACSF. ik) Dit is een overzicht van de LFP opname. De volgende panelen Toon ii) in-of uitgezoomd-in uitzicht op een 200 µM glutamaat bladerdeeg-geactiveerd Ictale gebeurtenis en iii) een ingezoomd-in-beeld van een spontane Ictale evenement. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: recept voor de oplossing van de dissectie. Dit zijn de instructies voor het maken van 1 L en 2 L volumes. MW = molecuulgewicht van de opgeloste stof.

# Reagens Conc. [mM] MW (g/mol) 1L (g) 2L (g)
1 Sacharose 248 342.3 84.89 169.78
2 Natriumbicarbonaat (NaHCO2) 26 84.01 2.18 4,37
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 1.8 3.6
4 Kaliumchloride (KCl) 2 74.55 0,15 0.3
5 Magnesium-sulfaat (MgSO4·7H2O) 3 246.47 0,74 1.48
6 Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (H2NaPO4· H2O) 1,25 137.99 0,17 0.34
7 Calciumchloride (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,15 0,29

Tabel 2: recept voor knaagdieren kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (ACSF). Dit zijn de instructies voor het maken van 2 L of 4 L volumes. MW = molecuulgewicht van de opgeloste stof.

# Reagens Conc. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumchloride (NaCl) 123 58,4 14.37 28.73
2 Natriumbicarbonaat (NaHCO2) 26 84.01 4,37 8.74
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Kaliumchloride (KCl) 4 74.55 0.6 1.19
5 Magnesium-sulfaat (MgSO4· H2O) 1.3 246.47 0.64 1.28
6 Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Calciumchloride (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0.44 0.88

Tabel 3: recept voor menselijke kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (menselijke ACSF). Dit zijn de instructies voor het maken van 2 L of 4 L volumes. MW = molecuulgewicht van de opgeloste stof.

# Reagens Conc. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumchloride (NaCl) 123 58,4 14.38 28.75
2 Natriumbicarbonaat (NaHCO2) 25.2 84.01 4.23 8.46
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Kaliumchloride (KCl) 4 74.55 0.6 1.19
5 Magnesium-sulfaat (MgSO4· H2O) 1 246.47 0,49 0.99
6 Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Calciumchloride (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,29 0.59

Tabel 4: recept voor nul-Mg 2 + knaagdier kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (nul-Mg2 + ACSF). Dit zijn de instructies voor het maken van 2 L of 4 L volumes. MW = molecuulgewicht van de opgeloste stof.

# Reagens Conc. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumchloride (NaCl) 123 58,4 14.37 28.73
2 Natriumbicarbonaat (NaHCO2) 26 84.01 4,37 8.74
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Kaliumchloride (KCl) 4 74.55 0.6 1.19
5 Magnesium-sulfaat (MgSO4· H2O) Nominaal gratis 246.47 0 0
6 Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Calciumchloride (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0,29 0.59

Tabel 5: recept voor nul-Mg 2 + menselijke kunstmatige cerebrale spinale vloeistof (nul-Mg2 + menselijke ACSF). Dit zijn de instructies voor het maken van 2 L of 4 L volumes; MW = molecuulgewicht van de opgeloste stof.

# Reagens Conc. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumchloride (NaCl) 123 58,4 14.38 28.75
2 Natriumbicarbonaat (NaHCO2) 25.2 84.01 4.23 8.46
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Kaliumchloride (KCl) 4 74.55 0.6 1.19
5 Magnesium-sulfaat (MgSO4· H2O) Nominaal gratis 246.47 0 0
6 Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Calciumchloride (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,29 0.59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De segmenten van de hersenen worden behandeld met een proconvulsant drug of een gewijzigde ACSF perfusaat verhogen van het neurale netwerk prikkelbaarheid en bevorderen van een neerslag van Ictale evenementen (electrographic inbeslagneming-achtige events). Bij muizen, moeten de voorkeur coronale segmenten van de somatosensorische-motor ruimte bevatten die de cortex cingularis, gebied 2 (CG), maar niet het retrosplenial gebied (RS); Deze anatomische Markeringen helpen bij het identificeren van het bereik van coronale segmenten die het beste voor inducerende Ictale gebeurtenissen zijn. Een optionele modificatie voor muizen weefsel is te snijden van de twee hemisferen van de hersenen-segment in de helft voor evenementen-pair experimentele designs, zoals de twee hemisferen zijn vrijwel identiek (soortgelijke experimentele eenheden). Bij de voorbereiding van hersenen segmenten Ictale gebeurtenissen moet genereren, is het noodzakelijk om de integriteit van het neurale netwerk en de synaptische verbindingen, omdat Ictale gebeurtenissen een neuraal netwerk fenomeen zijn. Drie zijn punten in stap 1 van het Protocol die essentieel zijn voor de kwaliteit van het segment 1) de segmenteringshulplijnen procedure 2) incubatie en oxygenatie 3). In de eerste plaats vereist de segmenteringshulplijnen procedure een evenwicht tussen snelheid en techniek. Het is van cruciaal belang om de tijd tussen de onthoofding (of chirurgische resectie) te minimaliseren en incubatie, terwijl ook voorzichtig met elk contact en beweging van het segment van de hersenen om schade te voorkomen. Ten tweede, de kwaliteit van het weefsel is zeer gevoelig voor de incubatietemperatuur en duur. Het is belangrijk dat u een timer en thermometer om ervoor te zorgen de incubatie is bij 35 ° C gedurende 30 minuten in de derde, de levensvatbaarheid van het hersenweefsel gevoelig zijn voor blootstelling aan iets anders dan zuurstofrijk (kunstmatige) cerebrale spinale vloeistof. Het segment van de hersenen verloopt als het niet is geperfundeerd met carbogenated ACSF voor een langere periode (~ 1 min).

Segmenten van de hersenen van muizen leeftijd p13 - p16 bieden de hoogste kans op succes Ictale gebeurtenissen genereert. De reden is dat muizen ≤ p16 hoeven niet een transcardial perfusie vóór dissecties. Dit effectief vermindert de kans op fouten en versnelt het proces van de dissectie, dat een enorm voordeel, is omdat de hoeveelheid tijd tussen de onthoofding en incubatie is omgekeerd gecorreleerd met de levensvatbaarheid van de segment van de hersenen. Ondertussen muizen > p13 afgenomen hoeveelheid NKCC1 die vergelijkbaar zijn met een volwassen36. In het algemeen, jonge (< p21) weefsel is duurzamer dan volwassen weefsel als gevolg van een uitzonderlijke vermogen om te herstellen van de schadelijke segmenteringshulplijnen procedure. Deze week durende venster tussen p13 en p21 biedt de mogelijkheid om misbruik van de muizen volwassene-achtige fysiologie en juveniele-achtige vermogen om eenvoudig genereren Ictale gebeurtenissen37,38. Echter als experimenten nodig Ictale gebeurtenissen in hersenen plakjes van volwassen muizen studeren, zal een NMDG gebaseerde ACSF met HEPES, thioureum, en ascorbaat helpen bevorderen van de levensvatbaarheid van volwassen weefsel24,39,40, 41. voor menselijk weefsel, de toevoeging van antioxidanten, zoals α-tocopherol, aan de dissectie-oplossing kan profiteren weefsel levensvatbaarheid, vooral tijdens vervoer over lange afstanden (> 30 min) tussen de operatiekamer en het laboratorium voor 8,26te snijden. Voor alle segmenten van de hersenen zijn de gunstige voorwaarden Ictale gebeurtenissen moet genereren van het opnemen van 450 µm dikke sneden bij 36 ° C. Hersenen segmenten moeten ten minste 350 µm dik genoeg neuronen in het neuraal netwerk voor het genereren van de gestructureerde Ictale gebeurtenis bevatten. Echter segmenten kunnen niet dikker dan 500 µm, zoals die het moeilijk voor zuurstof maken zal te verspreiden in het midden van het weefsel. Segmenten die 450 µm zijn vertegenwoordigen een optimale dikte, waar een ruime hoeveelheid neuronale netwerkverbinding wordt gehouden zonder het belemmeren van de perfusie van zuurstof in de weefsels. Tot slot, de neerslag van Ictale gebeurtenissen is optimaal bij 33-36 ° C; Als de opname vergaderzaal niet tenminste 33 ° C is, zal het moeilijk zijn voor Ictale gebeurtenissen optreden.

Een beperking van de acute inbeslagneming model is dat ze niet aanvallen genereren. Ze genereren alleen Ictale gebeurtenissen, die de electrographic handtekening van een aanval. Ictale gebeurtenissen hebben geen bijbehorende gedrags onderdelen, zoals het verlies van bewustzijn of motor convulsies, die een aanval definiëren. Bijgevolg, acute inbeslagneming modellen kunnen niet worden gebruikt om te bevestigen de effectiviteit van potentiële anti-epilepsie drugkandidaten of krijgen inzicht in epileptogenese; dergelijke onderzoeksvragen moeten worden aangepakt door chronische epilepsie modellen en klinische proeven. Acute inbeslagneming modellen dient alleen voor het beoogde gebruik van het fundamentele voorbereidende studies uitvoeren op inbeslagneming mechanismen. Alleen de meest veelbelovende resultaten van acute inbeslagneming modellen moeten worden gevorderd op hogere modellen die zijn duurder, moeizaam voor te bereiden, en vereisen veel complexer ethische overwegingen.

Om vorderingen te maken bij epilepsie en inbeslagneming onderzoek, is het noodzakelijk is om een betrouwbare acute inbeslagneming-model dat de activiteit van de electrographic beslag klinisch waargenomen in het EEG van inbeslagneming patiënten nauwkeurig kunt repliceren. Om betrouwbaar Ictale gebeurtenissen in plakjes van de hersenen, zijn niet-disinhibitie methoden van verhoging van de prikkelbaarheid vereist, terwijl methoden van disinhibitie (dat wil zeggen, de GABAA receptor antagonist BMI) normaal gesproken resulteren in het stekelige activiteit denken aan de interictale activiteit, in plaats van Ictale gebeurtenissen (figuur 3A). De geprefereerde methode voor niet-disinhibitie is toe te passen van de proconvulsant agent 4-AP omdat het betrouwbaar consistente Ictale gebeurtenissen voor 1 h kan genereren. In tegenstelling, genereert het nul-Mg2 + corticale model Ictale gebeurtenissen voor slechts ~ 10 min voordat snel omzetten in burst-achtige activiteit (figuur 2A). Als met behulp van de nul-Mg2 + model, de toevoeging van 5-10 µM baclofen, zal een GABAB receptor agonist, bijdragen tot het transformeren van de barst activiteit terug naar Ictale gebeurtenissen (figuur 2B), als eerder is laten zien in hippocampal segmenten42. Het 4-AP inbeslagneming in vitro model heeft bovendien de voorkeur, omdat de bevindingen van dat model kunnen worden gerepliceerd in zijn in vivo tegenhanger, de in vivo 4-AP corticale inbeslagneming model (Figuur 4). Het is niet haalbaar om de hele cerebrale spinale vloeistof van een levende volwassen muis opnieuw de acute in vivo nul-Mg2 + -omgeving te wijzigen.

De toepassing van 4-AP in corticale hersenen segmenten kan de activiteit van de inbeslagneming waargenomen klinisch15,33nauwkeurig reproduceren. In tegenstelling, zijn 4-AP-behandeld hippocampal segmenten vatbaar voor het genereren van interictale-achtige blancobepalingen activiteit43 en status epilepticus-achtige omstandigheden (figuur 3B). Dus, voor de doeleinden van het bestuderen van de vangsten, de acute in vitro 4-AP corticale model verdient de voorkeur over de in vitro 4-AP hippocampal model. Verder zijn er vrijwel geen mogelijkheden om het opnemen van levensvatbare menselijke hippocampal segmenten, zoals de meest hippocampal resections hebben de CA1 en CA3 beschadigd21. Niet-pathologische menselijke corticale weefsel is daarentegen beter toegankelijk zijn, want dat is de secundaire resultaten van subcorticale neurochirurgische procedures zoals temporaalkwab epilepsie chirurgie. Niet-epileptische 'control' neocortical weefsel kan ook worden verkregen uit de tumor resectie chirurgie. Om deze redenen is de cortex de aangewezen site voor het modelleren van inbeslagneming activiteit vanwege haar transporteerbaarheid tussen muis en menselijk weefsel te bevestigen van klinische relevantie. Tot slot, de stam van de C57BL/6 van muizen verdient de voorkeur omdat ze gemakkelijk transgenen express en optogenetic varianten commercieel verkrijgbaar zijn. Optogenetic muizen modellen voorzien in de opening van de op afroep van Ictale gebeurtenissen via een minimaal invasieve, korte lichte stimulatie. Dit maakt de studie van vangsten ongelooflijk efficiënt door het elimineren van wachttijden en rekening houdend met de gerichte activering van neuronale subpopulaties. Voorts staat de mogelijkheid om te leiden tot aanvallen op afroep naar nieuwe manieren om definitief de afbakening van het exacte punt van inbeslagneming inleiding en de effectiviteit van anti-epilepsie drugkandidaten potentieel te bestuderen. Een gebruiksvriendelijke MATLAB-programma is speciaal ontwikkeld voor het opsporen en classificeren van de verschillende soorten epileptiform-gebeurtenissen die in de in vitro en in vivo 4-AP inbeslagneming modellen plaatsvinden. Dit programma voor virusopsporing is beschikbaar voor download van de Valiante Lab GitHub repository (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (MOP 119603 Peter L. Carlen en Taufik A. Valiante), het Ontario hersenen Instituut (Taufik A. Valiante) en de Mightex Student onderzoeksbeurs (naar Michael Chang). We zouden graag bedanken Liam Long voor zijn hulp bij het filmen van het video manuscript. Wij willen erkennen Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran en Shadini Dematagoda voor hun hulp bij het opstellen van de figuren en tabellen in dit manuscript. Figuren 1A, 3Aen 4A 6A zijn alle originele figuren gemaakt van gegevens die zijn gepubliceerd in Chang et al. 16.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium pentobarbital N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe N/A N/A Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle N/A N/A Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue N/A N/A Purchased through UT Med Store
Lens paper N/A N/A Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula N/A N/A Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end N/A N/A Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0 N/A N/A Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer N/A N/A Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital) N/A N/A Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2 N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome Leica N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)  Scientific Systems Design Inc N/A
Sodium Chloride (NaCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dextrose N/A N/A Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sucrose N/A N/A Purchased through UT Med Store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19, (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53, (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81, (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342, (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22, (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31, (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511, (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50, (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95, (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30, (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137, (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88, (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55, (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25, (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1, (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61, (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42, (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31, (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7, (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23, (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468, (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7, (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26, (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303, (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410, (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50, (1), 98-110 (2006).
Generatie en On-Demand inleiding van Acute Ictale activiteit in knaagdier en menselijk weefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).More

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter