Summary
Qui, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione. Una regolazione manuale della pressione intraluminale delle cavità cardiache è implementata per rendere funzionalmente intatto miociti adatto per studi di accoppiamento eccitazione-contrazione.
Abstract
In questo articolo, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule atriali cardiomiociti (ACMs) da un modello del ratto della sindrome metabolica (MetS)-correlate a insufficienza cardiaca con frazione di eiezione preservata (HFpEF). La prevalenza di MetS-correlati HFpEF è in aumento, e malattie del miocardio atriale associati rimodellamento atriale e fibrillazione atriale sono clinicamente altamente rilevanti come rimodellamento atriale è un preannunciatore indipendente della mortalità. Studi con cardiomiociti isolati unicellulare utilizzati frequentemente per corroborare e integrare i risultati in vivo . Rarefication vaso circolatorio e fibrosi del tessuto interstiziale rappresentano un fattore potenzialmente limitante per l'isolamento di singole cellule successo di ACMs da modelli animali di questa malattia.
Abbiamo affrontato questo problema con l'ausilio di un dispositivo in grado di regolare manualmente la pressione intraluminale delle cavità cardiache durante la procedura di isolamento, sostanzialmente aumentando il rendimento della ACMs morfologicamente e funzionalmente intatto. Le cellule acquisite possono essere utilizzate in una varietà di diversi esperimenti, come coltura cellulare e formazione immagine funzionale del calcio (cioè, accoppiamento eccitazione-contrazione).
Forniamo il ricercatore con un protocollo passo dopo passo, un elenco di soluzioni ottimizzate, approfondite istruzioni per preparare l'attrezzatura necessaria e una completa guida sulla risoluzione dei problemi. Mentre l'implementazione iniziale della procedura potrebbe essere piuttosto difficile, un efficace adattamento permetterà al lettore di eseguire isolamenti di ACM di state-of-the-art in un modello del ratto di MetS-relative HFpEF per un ampio spettro di esperimenti.
Introduction
MetS descrive un cluster di fattori di rischio per diabete mellito tipo 2 e malattie cardiovascolari e include un aumento della pressione sanguigna arteriosa, dislipidemia (trigliceridi di sollevato e abbassato il colesterolo della lipoproteina ad alta densità), aumentato il digiuno glucosio e l'obesità centrale1. La prevalenza in tutto il mondo dei MetS è stimata essere di 25 – 30% e costantemente aumentante2. HFpEF è una sindrome clinica eterogenea, spesso associata a MetS. Il rimodellamento cardiaco durante HFpEF e le sue fasi precedenti (cioè, cardiopatia ipertensiva) è accompagnato anche da un rimodellamento del atria3. Riduzione della funzione contrattile e cambiamenti strutturali dell'atrio sinistro sono stati associati con la mortalità aumentata, fibrillazione atriale e scompenso cardiaco di nuova insorgenza4. Rimodellamento atriale è caratterizzata da cambiamenti nella funzione dei canali ionici, omeostasi del Ca2 + , struttura atriale, l'attivazione dei fibroblasti e dei tessuti fibrosi5. Lasciato il rimodellamento atriale in MetS-correlati HFpEF e suoi sottostanti meccanismi patologici sono ancora poco conosciuti e richiedono un ulteriore approfondimento. Modelli animali hanno dimostrato di essere uno strumento prezioso e portare a molti progressi nel campo delle malattie del miocardio atriale6,7,8,9.
Studi con cardiomiociti isolati unicellulare utilizzati frequentemente per corroborare e integrare i risultati in vivo . Un isolamento e coltura delle cellule successive potenziali, consentire per l'indagine su segnalazione di percorsi, canali ionici correnti e accoppiamento eccitazione-contrazione. In condizioni fisiologiche, cardiomiociti non proliferano. La fusione tra le sequenze regolatrici trascrizionale di un fattore natriuretico atriale e un virus simian 40 grande T antigene in topi transgenici hanno portato alla creazione del primo ACMs immortalizzate, denominata AT-110. L'ulteriore sviluppo delle cellule AT-1 ha dato origine alle cellule HL-1, che non possono solo essere attraversate in serie ma anche contraggono spontaneamente11. Esse, tuttavia, mostrano differenze strutturali e funzionali rispetto alle cellule di recente isolate, come un'ultrastruttura meno organizzata, un alto avvenimento di sviluppare miofibrille11e un hyperpolarization-attivato verso l'interno corrente12. L'isolamento dei cardiomyocytes ventricolari (VCM) nei ratti e nei topi da una varietà di modelli è affermata13,14,15,16,17,18 , 19. in generale, il cuore asportata è montato un apparato di Langendorff e retrogradely irrorato con Ca2 +-buffer liberi contenenti enzimi digestivi, come collagenasi e proteasi. Calcio è poi reintrodotto in un modo graduale alle condizioni fisiologiche. Tuttavia, anche se dedicati all'isolamento della ACMs i protocolli sono disponibili20,21, a causa di una maggiore fibrosi e differenze di pressione-related, loro utilità nei modelli di malattia con rimodellamento atriale è limitato.
In questo articolo, abbiamo implementato un protocollo per l'isolamento di atriali unicellulare cardiomiociti da animali che mostrano atriale che ritocca (cioè, in particolare per il modello di ratto ZFS1 per MetS-correlati HFpEF)22. Esistenti protocolli di isolamento sono stati ottimizzati e completati da un dispositivo semplice, su misura per controllare e modificare la pressione intraluminale delle cavità cardiache, portando a rendimenti più elevati di cardiomiociti morfologicamente e funzionalmente intatti. Il seguente protocollo fornisce il ricercatore con una guida dettagliata, una descrizione dettagliata dell'apparecchiatura su misura, un elenco di soluzioni, come pure una guida completa alla risoluzione dei problemi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico locale (TVA T0060/15 e T0003-15) ed eseguiti in accordo con le linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Institute of Health, U.S.A).
Nota: Un diagramma di flusso della procedura semplificata è illustrato nella Figura 1.
1. predisposizioni
- Preparare i buffer secondo la tabella 1.
| Soluzione | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Reagente (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| Na2HPO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurina | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Glucosio | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0,01 | 0,125 | 0.25 | 0,5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Enzima purificato si fondono (media termolisina) | 0.195 Wünsch unità/mL | ||||||||
| pH regolato a | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| pH regolato a | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH regolato con | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Tabella 1: elenco dei buffer. PB: buffer di aspersione, che può essere conservato per 3 giorni a 4 ° C (300 mL / animale). CB: buffer di inserimento di una canula, che può essere conservato per 3 giorni a 4 ° C (200 mL / animale). DB: buffer di digestione, che deve essere utilizzato entro il giorno (40 mL per animale). SB: arresto buffer, che deve essere utilizzato entro il giorno (2 mL / animale). S1: Buffer di fase 1, che deve essere utilizzato entro il giorno (2 mL / animale). S2: Buffer di fase 2, che deve essere utilizzato entro il giorno (2 mL / animale). S3: Buffer di fase 3, che deve essere utilizzato entro il giorno (2 mL / animale). NT: Tyrode normale, che deve essere utilizzato entro il giorno (50 mL / animale).
-
Preparare l'apparato di Langendorff (Figura 2A).
- Lavare il sistema con 100 mL di etanolo al 70%, seguita da 2 vampate di 100 mL di acqua distillata. Riempire il sistema con 200 mL di buffer di aspersione (PB).
- Impostare la portata della pompa peristaltica a 3 mL/min.
- Calibrare la temperatura del PB lasciando l'apparato di Langendorff a 39 ° C.
- Posizionare la cannula su misura [16 G, 25 mm di lunghezza, sharp punta rimosso (Figura 3A)] in cima l'apparato di Langendorff e avviare il flusso. Accendere il modulo di riscaldamento e regolare il valore del modulo di riscaldamento per raggiungere la temperatura desiderata del PB sulla punta della cannula. Una volta completata la calibrazione di temperatura, è possibile spostare la cannula su misura alla siringa utilizzata per l'inserimento di una canula (Figura 2B).
- Preparare il dispositivo di controllo di pressione (Figura 3) accanto al sistema di Langendorff. Montare l'ago a farfalla sul morsetto treppiede e preparare 3 nodi di blocchi.
Nota: L'attività dell'enzima collagenasi varia con la temperatura. Un monitoraggio della temperatura dell'atrio sinistro, come pure una regolazione dinamica della stessa, è necessaria più avanti nella procedura.
- Impostare l'apparecchiatura per l'asportazione dell'organo e l'inserimento di una canula secondo Figura 2B. Riempire il becher, siringa e capsula di Petri con un buffer di inserimento di una canula ghiacciata (CB) e preparare i nodi di inserimento di una canula.
-
Eparinizzare il topo con 500 U.I. di eparina per 100 g di peso corporeo del ratto come segue.
- Mettere 2 mL di 100% isoflurane in una camera di induzione di anestesia adatto per roditori. Trasferimento il ratto obeso di ZFS-1 settimana-vecchio 21 dalla gabbia alla camera di induzione. Consentire il topo a immettere l'anestesia profonda, indicato da una decelerazione del respiro alla metà della sua frequenza iniziale.
- Rimuovere il ratto dalla camera di induzione. Iniettare 500 U.I. di eparina per 100 g di peso corporeo del ratto nel peritoneo utilizzando una siringa di eparina.
- Restituire il ratto nella sua gabbia e consente di sottoporli a svegliarsi.
Nota: Non è necessario mantenere la sterilità durante passaggio 1.4. Attendere 20 minuti prima di procedere al passaggio successivo. Un'anticoagulazione incompleta può causare sangue coagulazione, che conduce a micro-infarti, che possono avere un impatto significativo la qualità e la resa di cardiomiociti isolati.
2. cuore preparazione
- Mettere 2 mL di 100% isoflurane in una camera di induzione di anestesia adatto per roditori. Trasferimento il ratto obeso di ZFS-1 settimana-vecchio 21 dalla gabbia alla camera di induzione. Consentire il topo a immettere l'anestesia profonda, indicato da una decelerazione del respiro alla metà della sua frequenza iniziale.
- Eutanasia animale per decapitazione usando una ghigliottina adatta per roditori. Fissarsi degli arti del ratto su una superficie di polistirolo espanso. Sollevare e rimuovere la pelle che copre il processo xifoideo con forbici chirurgiche. Aprire il peritoneo sotto le gabbie di coste su entrambi i lati ed esporre il diaframma.
- Aprire il diaframma facendo un'incisione lungo l'arco anteriore utilizzando forbici bene. Tagliare le costole su entrambi i lati lungo la linea mediaclavicularis all'osso clavicular, utilizzando forbici chirurgiche, per esporre il mediastino in situ.
- Rimuovere i polmoni all'estremità distale della hila con forbice. Tagliare il timo per esporre l'arco aortico.
- Pizzicare la base del cuore utilizzando pinze e tirare delicatamente verso il basso verso la coda dell'animale. Tagliare attraverso l'aorta mantenendo una trazione sul cuore, lasciando un segmento lungo 5 mm dell'aorta associata al cuore. Trasferire rapidamente il cuore in CB ghiacciata 50 mL nel becher 50ml (Figura 2B).
Nota: Durante le fasi 2.5 – 3.3, il cuore è efficacemente in condizioni ischemiche. Evitare di superare un totale di 3 min per questi passaggi in modo da non danneggiare i cardiomiociti.
3. inserimento di una canula
- Attendere circa 10 s per il cuore a raffreddare e cogliere le contrazioni. Trasferire il cuore in una capsula di Petri contenente 50 mL di acqua, CB ghiacciata. Rimuovere delicatamente il tessuto grasso che circonda l'aorta utilizzando pinze e le forbici.
- Inserire la cannula su misura (lo stesso utilizzato nel passaggio 1.2.3), cui è collegata la siringa da 10 mL riempita con CB ghiacciata, 3mm in aorta. Fissare l'aorta sulla cannula legando uno dei due nodi di inserimento di una canula (Figura 3B) nella rientranza prossimale alla punta della cannula.
Nota: Fare attenzione a non danneggiare la valvola aortica con una penetrazione con la cannula. - Lavare delicatamente l'aorta con 5 mL di CB ghiacciata utilizzando la siringa collegata alla cannula fino a quando non più sangue è visibile nelle arterie coronarie. Delicatamente massaggiare l'atrio di sinistra usando il forcipe e iniettare i rimanenti 5 mL di CB, consentendo qualsiasi sangue in eccesso essere rimosso dalla cavità nella piastra di Petri.
- Legare il secondo nodo di inserimento di una canula (sutura: USP 3/0, seta) nella rientranza distale fino alla punta della cannula. Smontare la cannula con il cuore allegata dalla siringa. Montare la cannula con il cuore allegata alla Langendorff, utilizzando un opportuno adattatore.
Nota: Questo protocollo impiega la pressione elevata nella cavità ventricolare durante la perfusione presso l'apparato di Langendorff. Il nodo di ulteriore inserimento di una canula è necessaria per mantenere questa pressione evitando fuoriuscite di buffer anterograda attraverso l'aorta.
4. pressione di manipolazione e digestione
- Avviare la pompa peristaltica dell'apparato di Langendorff per avviare la perfusione del tessuto cardiaco con PB. Legare un nodo semplice doppio (sutura: USP 3/0, seta) intorno alla base del cuore, escluse l'aorta. Ripetere questo passaggio fino ad un'inflazione dell'atrio destro e sinistro, come pure il seno coronario, è notato.
- L'atrio di puntura con l'ago a farfalla del dispositivo di controllo di pressione (Figura 3D) e consentire l'atrio a sgonfiarsi. Manipolare la pressione intraluminale dell'atrio regolando l'altezza del tubo farfalla. Mantenere l'atrio leggermente gonfiato tutto il resto della procedura; monitorare e regolare di conseguenza.
Nota: Questo passaggio deve essere eseguito rapidamente, come un'inflazione prolungata dell'atrio sinistro si tradurrà nella morte dei cardiomiociti. - Misurare la temperatura approssimativa dell'atrio sinistro posizionando una sonda di temperatura tra l'atrio sinistro e ventricolo sinistro. Regolare la temperatura di Langendorff riscaldamento modulo di conseguenza, il targeting una temperatura di circa 37 ° C dell'atrio sinistro.
- Irrorare il cuore con PB per un totale di 3 min.
- Passare la perfusione in un buffer di digestione (DB) per circa 14 – 18 min.
Nota: La digestione è completa quando la struttura atriale sinistra crolla e il tessuto Acquista una consistenza lattiginosa. - Pizzicare l'atrio usando il forcipe ed emanare una leggera trazione. Rimuovere l'atrio di sinistra con le forbici bene e trasferire l'atrio in una grande barca di pesatura contenente 2 mL di buffer (SB), sommergendo completamente il tessuto di arresto.
- Smaltire il restante tessuto cardiaco seguendo le linee guida del laboratorio dove viene eseguita la procedura.
5. elaborazione e riadattamento del calcio delle cellule
- Tritare il tessuto atriale in pezzetti di circa 2 x 2 mm usando le forbici bene.
- Disperdere il tessuto da una leggera aspirazione e l'espulsione del chunk tessuto utilizzando una pipetta di trasferimento. Continuare questa procedura per circa 5 minuti fino a quando una dissociazione macroscopica del tessuto può essere osservata.
Nota: Evitare eventuali bolle d'aria durante questo passaggio, come l'esposizione delle cellule all'aria si tradurrà nella morte dei cardiomiociti. - Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Consentire i pezzi di tessuto a stabilirsi per 30 s. trasferimento il sovranatante in un'altra provetta conica da 15 mL. Permettono alle cellule di accontentarsi di 15 min.
- Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 2 mL di buffer di passaggio 1 (Vedi tabella 1). Consentire i cardiomiociti a stabilirsi per 10 min.
Nota: Il supernatante scartato include anche fibroblasti e cellule endoteliali. Fare riferimento ad altri protocolli, se si desidera utilizzare queste cellule per esperimenti14,23. Il pellet conterrà principalmente atriali cardiomiociti, che possono essere confermati da microscopia chiara. Le caratteristiche microscopiche dei cardiomiociti atriali sono discussi al punto 6.1. - Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 2 mL di tampone di passaggio 2. Consentire i cardiomiociti a stabilirsi per 10 min.
- Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 2 mL di buffer di passaggio 3. Consentire i cardiomiociti a stabilirsi per 10 min.
- Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 250 µ l di Tyrode normale (NT) contenente 1mm Ca2 +.
- Trasferire 50 µ l del normale Tyrode contenente atriale cardiomyocytes su un piatto fondo di vetro, che è stato rivestito con laminina 25% (e lasciato asciugare in anticipo). Consentire i cardiomiociti a stabilirsi per 10 min.
- Riempire un piatto con fondo di vetro con 500 µ l di NT contenente 1mm CaCl2.
6. valutazione funzionale di accoppiamento eccitazione-contrazione
- Valutare la morfologia delle cellule e l'attuabilità sotto un microscopio chiaro con un 20 ingrandimenti (Figura 4A e 4B). In modo casuale selezionare circa 100 celle e classificarli come vitali o non vitali al fine di stimare la redditività della procedura di isolamento delle cellule.
Nota: Le cellule vitali sono caratterizzate da struttura simmetrica sarcomero, l'assenza delle vescichette di membrana e una forma di asta. -
Caricare le celle con il Ca2 +-sensibili colorante fluorescente entro 20 min di completare passo 5.9.
- Aggiungere 10 µM Fluo4-AM a 500 µ l di NT. rimuovere il surnatante dal piatto con fondo di vetro (da passo 5,9). Aggiungere il NT contenente Fluo4-AM al piatto con fondo di vetro. Incubare la miscela per 20 min a temperatura ambiente. Rimuovere e scartare il surnatante. Lavare il campione 2 x utilizzando 500 µ l di NT.
-
Visualizzare il Ca2 +-eccitazione con un microscopio confocale come segue.
- Trasferire il piatto con fondo di vetro per un microscopio confocale e visualizzare il Ca2 +-eccitazione con un microscopio confocale (laser di intensità pari al 5,8%, eccitazione a 488 nm, emissione a 515 nm) utilizzando un ingrandimento 40x.
- Irrorare le cellule con NT riscaldata a 37 ° C, utilizzando un appropriato dispositivo di sopraffusione. In alternativa, tenere le cellule caldo utilizzando un incubatore di calore microscopio-montato.
- Stimolare i cardiomiociti in un campo elettrico con elettrodi stimolatore commercialmente disponibili, microscopio-montato ad una frequenza di 1 Hz e una corrente elettrica di 24 a. attesa per 1 min per consentire alle cellule di raggiungere uno stato costante di Ca2 + la gestione.
- Posizionare la linea di scansione parallela all'asse trasversale, a metà strada tra il nucleo e il bordo di un selezionato casualmente, in modo macroscopico contraenti delle cellule. Acquisire immagini di scansione di linee di scansione ripetitive.
- Utilizzare software di imaging liberamente disponibili per stimare l'intensità di segnale immediatamente prima di una stimolazione elettrica (F0) attraverso l'intera cella. Tracciare l'intensità del segnale attraverso l'intera cella nel corso del ciclo di 1 stimolazione (F). Dividere (F) per (F0) per ottenere le rispettive Ca2 + transitoria.
Figura 1: diagramma di flusso semplificato della procedura isolamento. La procedura è altamente sensibili al fattore tempo finché non viene completata la digestione enzimatica dei miociti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: preparazione di attrezzature prima dell'isolamento. (A), questo pannello mostra un apparato di Langendorff self-made: (1) un recipiente di reazione rivestito con PB; (2) un recipiente di reazione rivestito con CB; (3) un rubinetto a 3 vie; (4) una siringa; (5) una pompa peristaltica; (6) un immersione di riscaldamento; (7) un gorgogliatore rivestito; e (8) la cannula e il cuore. (B), questo pannello mostra il set-up per l'asportazione dell'organo e inserimento di una canula per un flusso di lavoro ottimizzato: (1) un becher da 100 mL con 50 mL di CB ghiacciata; (2) una siringa da 10 mL con CB ghiacciata; (3) una capsula di Petri con CB ghiacciata; (4) una fonte di luce; (5) la cannula su misura con un inserimento di una canula nodo (Vedi anche Figura 3A e 3B); (6) bene, curvo forcipe; (7) forcipe del tessuto; (8) forcipe fine, angolato 45°; (9) forbici chirurgiche addominale; (10) forbici chirurgiche bene; (11) 4 x 30 aghi G; e (12) un ago 15 G. (C), questo pannello mostra le apparecchiature montate su microscopio per l'imaging confocale: elettrodi (1) stimolatore elettrico; (2) una penna sopraffusione; (3) un piatto fondo di vetro con l'amianto; e (4) stimolatore elettrico platino immersi gli elettrodi. (D) questo pannello mostra il set-up di microscopio per l'imaging confocale: (1) il microscopio confocale; (2) una penna sopraffusione; (3) un serbatoio tampone sopraffusione; (4) un regolatore di flusso sopraffusione; (5) un superfusione riscaldamento modulo; (6) una postazione informatica; e (7) uno stimolatore elettrico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: attrezzatura su misura. (A), questo pannello spettacoli il 15 manipolati cannula G con un Luer lock. Le frecce indicano due rientranze per i nodi di inserimento di una canula. (B) questi sono i nodi di inserimento di una canula, due doppi nodi alla marinara, posizionati in cima a vicenda per serraggio rapido. Le frecce indicano dove e in che ordine il nodo deve essere stretto. (C), questo pannello mostra il dispositivo di controllo pressione assemblati. Un ago a farfalla 21 G è agganciato in un morsetto di treppiede. Il tubo è mantenuto alla stessa altezza come l'ago. Viene aperto il tappo a vite. L'elevazione del tubo farfalla possa essere modificata come indicato dalle frecce al fine di modificare la pressione intraluminale dell'atrio sinistro. (D) sinistra atrio è perforato con il dispositivo di controllo di pressione. Questa immagine mostra un atrio di sinistra idealmente gonfiato. L'ellisse contrassegna la posizione del nodo alla marinara. (E) sinistra atrio è perforato con il dispositivo di controllo di pressione. Questa immagine mostra un atrio sinistro eccessivamente gonfiato, che si tradurrà in una minore resa di ACMs praticabile. L'ellisse contrassegna la posizione del nodo alla marinara. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
A 21 settimane di età, 60 – 90% di vitali ACMs (stimato come descritto al punto 6.1), dopo il riadattamento del calcio (passo 5.4 – 5,7), possono essere isolati dai ratti obesi ZSF-1 da questo metodo (Figura 4A). Nei ratti, ACMs sono caratterizzati da una diversa e più fenotipo eterogeneo rispetto al sistema VCMs24,25. Figura 4B Mostra un ACM individuali con membrane conservate e struttura del sarcomero, entrambi forti indicatori di una cella funzionalmente integrale.
L'ACMs acquisiti possono essere elaborati in una varietà di modi. Come esemplificato nella Figura 5, le cellule possono essere caricate con coloranti fluorescenti utilizzate per studiare la morfologia e/o funzione. Ad esempio, di-8-ANEPPS è stata usata per delineare il sistema tubolare in una cella di ratto atriale (Figura 5A). In un'altra serie di esperimenti, mitocondri-macchiatura tintura lontano rosso-fluorescenza (ad es., mitotracker-rosso-FM) è impiegata per rilevare i mitocondri citosolici (figura 5B) nel rimodellamento atriale. Come illustrato nella Figura 5, ACMs isolato con questo protocollo sono anche adatti per vivere-cella Ca2 + imaging e mostrare intatto eccitazione-contrazione di accoppiamento con un 1 Hz Campo-stimolazione. Tutte le immagini possono essere utilizzate per ulteriori analisi utilizzando una varietà di algoritmi disponibili al ricercatore6,7 (Figura 5).
Figura 4: rispettivo rendimento d'America vitali, single-cell (A), questo pannello mostra il rendimento di un isolamento dopo il riadattamento della ACMs a 1 mM Ca2 + nel NT. (B), questo pannello mostra un cardiomyocyte atriale isolato, single-cell. La struttura del sarcomero, membrana cellulare e nel nucleo sono chiaramente visibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: colorazione del ratto ACMs con le tinture fluorescenti. (A) questo pannello mostra la colorazione di una membrana cellulare e la rete tubolare con il colorante fluorescente Di8ANNEPS. (B), questo pannello mostra la macchiatura dei mitocondri con la tintura fluorescente mitotracker-rosso-FM. (C) questo pannello mostra la scansione linea trasversale di Ca2 +-eccitazione con il colorante fluorescente Fluo4-AM su una singola cella. Le frecce indicano la stimolazione elettrica, condotta a 1 Hz. (D) questo pannello mostra i longitudenal Ca2 + transitori derivati da panel C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, abbiamo descritto prima un protocollo per l'isolamento di singole cellule ACMs da un modello del ratto di MetS-correlati HFpEF che mostra contrassegnato rimodellamento atriale22. La procedura è in modo univoco impegnativa come eccessivo tessuto adiposo può rendere la preparazione chirurgica, nonché l'inserimento di una canula dell'aorta, sempre più difficile. La guida alla risoluzione forniti in tabella 2 indirizzi i problemi più comuni della procedura di isolamento.
| Problema | Possibile causa | Soluzione |
| Nessun flusso attraverso tubo di farfalla | Chiusura impropria dell'aorta con i nodi di inserimento di una canula | Rimuovere il tessuto adiposo prima di serrare |
| Aggiungere 3 ° nodo di inserimento di una canula con rispettivo rientro | ||
| Tirare il nodo con la mano per forza maggiore | ||
| Dell'ago bloccato | Riaggiustare la posizione nel lumen | |
| Sbloccare da trazione del dolce con la siringa | ||
| Atrio destro / seno coronarico non gonfiato | Non corretta chiusura della base del cuore | Blocco di flusso con nodi aggiuntivi |
| Atrio destro danneggiato durante la preparazione | Chiudere la perdita con clip/nodi | |
| Cattiva digestione / atrio non ammorbidire | Attività enzimatica riduttrice attraverso temperatura sbagliata | Regolare la temperatura a 37 ° C |
| Enzima inattivo/degradato | Sostituire | |
| Vecchia/eccessivamente fibrotica atrio | Aumentare il tempo di digestione (a passi di + 50%) | |
| Valvola aortica danneggiata | Penetrazione superficiale durante l'inserimento di una canula | |
| Rendimento delle celle poveri | Atrium over-digerito | Ridurre i tempi di digestione (a passi di + 25%) |
| Ridurre la pressione intraluminal abbassando il tubo di farfalla | ||
| Atrio sotto-digerito | Aumentare il tempo di digestione (con incrementi del 25%) | |
| Aumentare la pressione intraluminal sollevando il tubo di farfalla | ||
| Dispersione delle cellule troppo aggressivo | Essere più dolce |
Tabella 2: risoluzione dei problemi Guida. Questa tabella consente di visualizzare problemi comuni delle loro rispettive soluzioni e la procedura di isolamento.
In un recente studio, abbiamo dimostrato che il modello di ratto obeso di ZFS-1 presenta ampio rimodellamento atriale con un aumento delle dimensioni atriale22. Un aumento della dimensione atriale sinistra è stato riconosciuto come un importante indicatore prognostico per disfunzione diastolica26 e provoca un rarefication dei vasi microvascolari del tessuto relativo. Questo porta ad una distribuzione in diminuzione del buffer digestiva attraverso la perfusione retrograda dell'aorta durante la procedura di isolamento, l'isolamento di singole cellule in questo modello particolarmente impegnativo di rendering. Altri tratti caratteristiche distintivi del rimodellamento atriale, fibrosi atriale e fibrosi aumentata sono stati indicati per i ratti ZDF — un modello del ratto per il diabete metabolico e un ceppo della ZFS1 ratti27. Depositi di collagene compromettere l'efficacia degli enzimi digestivi per liberare i cardiomiociti da matrice extracellulare e, pertanto, richiede ulteriori regolazioni della cella isolamento procedura28.
Il meccanismo mediante il quale il dispositivo di pressione facilita i risultati di isolamento migliorato in questo modello del rimodellamento atriale è molto probabilmente legati ad un'attenuazione localizzata del flusso sanguigno coronario dell'atrio sinistro. Un importante componente del flusso coronarico è pressione di perfusione coronarica, che è definita come il gradiente tra la pressione dell'arteria coronaria e la pressione telediastolica delle rispettive cavità29. Durante la procedura descritta, un blocco della base del cuore porta ad un aumento globale della pressione dell'arteria coronaria e pressione intraluminal in tutto il cuore. La puntura successiva dell'atrio sinistro facilita una goccia locale, selettiva di pressione intraluminal nella cavità atriale sinistra. Così, non solo un gradiente di pressione di perfusione coronarica grande è stabilito, ma anche aumenta il volume di perfusione dalla soluzione digestione deviate dal ventricolo sinistro congestionata all'atrio di sinistra.
Inoltre, la scelta degli enzimi di digestione è fondamentale per l'isolamento di ACM: purificato miscele degli enzimi della collagenosi I e II abbiamo dimostrato di essere superiore a meno enzimi mirati e meno puri come collagenasi30. Questo enzima non solo consente una maggiore resa dei cardiomiociti morfologicamente e funzionalmente intatti ma anche riduce al minimo qualsiasi aggregazione di singole cellule dopo il loro isolamento31. Enzima purificato miscele di collagenasi con un ulteriore dispase alta o media termolisina contenuto sono più comunemente utilizzati per gli isolamenti dei cardiomiociti di ratto. Mentre VCMs sono meglio isolate a concentrazioni più elevate, i migliori risultati dei miociti atriali sono stato acquistati con una concentrazione di 0,195 Wünsch unità/mL usando questo protocollo32.
Come la prevalenza di MetS-correlati HFpEF è aumento2 e malattie del miocardio atriale portando a rimodellamento atriale e atriale fibrillazione sono clinicamente molto rilevante, la ricerca in questo campo è di interesse fondamentale. Molti nuovi modelli animali per HFpEF stanno emergendo33,34 e rimodellamento in linea con un aumento dell'incidenza dei disturbi del ritmo atriale atriale sono caratteristiche di marchio di garanzia della malattia. Il metodo descritto consente ai ricercatori di isolare il singoli praticabili cardiomiociti da modelli del ratto con rimodellamento atriale per un ulteriore studio con un eccezionalmente alto rendimento e mantiene inalterata la funzione meccanica ed elettrica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da DZHK (centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, D.B.), EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) e da BMBF (Ministero tedesco dell'istruzione e della ricerca), così come la Bosnia-Erzegovina-Charité scienziato clinico programma finanziato della Charité - Universitätsmedizin Berlin e Berlin Institute of Health (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006).
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas'ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
