Summary
Hier beschreiben wir eine optimierte, Langendorff-basierte Verfahren zur Isolierung von einzelligen Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion. Eine manuelle Regelung der Intraluminal Druck von kardialen Hohlräumen wird implementiert, um funktionell intakt Myozyten geeignet für Erregung-Kontraktion-Kupplung Studien ergeben.
Abstract
In diesem Artikel beschreiben wir eine optimierte, Langendorff-basierte Verfahren zur Isolierung von einzelligen Vorhofflimmern Kardiomyozyten (ACMs) aus einem Rattenmodell des metabolischen Syndroms (MetS)-im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion (HFpEF). Die Prävalenz der MetS-bezogenen HFpEF steigt, und Vorhofflimmern Kardiomyopathien Vorhofflimmern Umbau und Vorhofflimmern zugeordnet sind klinisch sehr relevant, da Vorhofflimmern Umbau ein unabhängiger Prädiktor für die Mortalität ist. Studien mit isolierten einzellige Herzzellen werden häufig verwendet, zu bestätigen und in-Vivo -Befunde zu ergänzen. Herz-Kreislauf-Gefäß-Rarefication und interstitiellen Gewebe Fibrose stellen einen potenziell limitierenden Faktor für die erfolgreiche einzellige Isolation der asbesthaltiger aus Tiermodellen der Krankheit.
Wir haben dieses Problem behoben, durch den Einsatz eines Geräts manuell Regeln des Intraluminal Drucks der kardialen Hohlräume bei der Isolierung im wesentlichen Erhöhung der Ausbeute von morphologisch und funktionell intakt ACMs. Die gewonnenen Zellen können in einer Vielzahl von verschiedenen Experimenten, wie Zellkultur und funktionelle Bildgebung von Calcium (d.h. Erregung-Kontraktion-Kupplung) verwendet werden.
Die Forscher bieten wir eine Schritt für Schritt-Protokoll, eine Liste von optimierten Lösungen, genaue Anweisungen zur Vorbereitung der notwendigen Ausrüstung und eine umfassende Anleitung zur Fehlerbehebung. Während die erste Implementierung des Verfahrens würde schwierig sein, können eine erfolgreiche Anpassung den Leser State-of-the-Art-ACM-Isolationen in einem Rattenmodell der MetS-bezogenen HFpEF für ein breites Spektrum an Experimente durchführen.
Introduction
MetS beschreibt eine Ansammlung von Risikofaktoren für Diabetes Mellitus Typ 2 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen und enthält einen erhöhte arteriellen Blutdruck, Fettstoffwechselstörungen (Triglyceride angehoben und abgesenkt High-density-Lipoprotein-Cholesterin), erhöhte Fasten Glukose und zentrale Adipositas1. Die weltweite Prävalenz des MetS wird voraussichtlich 25 – 30 % und stetig steigende2sein. HFpEF ist ein heterogenes klinisches Syndrom oft im Zusammenhang mit MetS. Kardialen remodeling während HFpEF und seiner vorhergehenden Phasen (z.B. Hypertensive Herzkrankheit) einher geht auch eine Umgestaltung der Atrien3. Reduzierte KONTRAKTILE Funktion und strukturelle Veränderungen des linken Vorhofs wurden mit erhöhter Mortalität, Vorhofflimmern und neue einsetzende Herzinsuffizienz4verbunden. Vorhofflimmern Umbau zeichnet sich durch Änderungen in der Ionen-Kanal-Funktion, Ca2 + Homöostase, Vorhofflimmern Struktur, Aktivierung der Fibroblasten und Gewebe Fibrose5. Links Vorhofflimmern Umbau in MetS-bezogene HFpEF und die zugrunde liegenden pathogenen Mechanismen sind noch kaum erforscht und erfordern eine weitere eingehende Untersuchung. Tiermodellen haben gezeigt, dass ein wertvolles Instrument und führen zu viele Fortschritte auf dem Gebiet von Vorhofflimmern Kardiomyopathien6,7,8,9.
Studien mit isolierten einzellige Herzzellen werden häufig verwendet, zu bestätigen und in-Vivo -Befunde zu ergänzen. Eine Isolation und die mögliche spätere Zellkultur ermöglichen die Untersuchung der Signalisierung Bahnen, Ionische Kanal Ströme und Anregung-Kontraktion-Kupplung. Unter physiologischen Bedingungen Herzzellen nicht vermehren. Die Fusion zwischen die transkriptionellen regulatorischen Sequenzen Atrial Natriuretic Faktor und ein simian Virus 40 große T-Antigen bei transgenen Mäusen führte zu die Kreation der ersten verewigt asbesthaltiger Namen AT-1-10. Die Weiterentwicklung des AT-1-Zellen führte zu HL-1-Zellen, die können nicht nur seriell passagiert aber auch Vertrag spontan11. Sie zeigen jedoch strukturelle und funktionelle Unterschiede im Vergleich zu frisch isolierte Zellen, wie z. B. eine weniger organisierten Ultrastruktur, ein hohes auftreten Myofibrillen11und eine Hyperpolarisation aktiviert nach innen aktuelle12zu entwickeln. Die Isolation der ventrikulären Kardiomyozyten (VCM) bei Ratten und Mäusen aus einer Vielzahl von Modellen ist gut etablierte13,14,15,16,17,18 , 19. im allgemeinen ausgeschnittenen Herzen ist montiert auf einem Langendorff-Apparat und doppelthebel durchströmt mit Ca2 +-freie Puffer, enthält Verdauungsenzyme, wie Collagenases und Proteasen. Kalzium ist in gewissem Sinne schrittweise an die physiologischen Bedingungen dann wieder eingeführt. Jedoch obwohl widmet sich die Isolierung der asbesthaltiger Protokolle verfügbar20,21, aufgrund der erhöhten Fibrose und Druck-bezogene Unterschiede sind beschränkt sich ihre Nützlichkeit in Krankheitsmodellen mit der Umgestaltung von Vorhofflimmern.
In diesem Artikel haben wir ein Protokoll für die Isolierung von Vorhofflimmern einzellige Herzzellen von Tieren umgesetzt, die Vorhofflimmern umgestaltet (d. h., insbesondere für die ZFS1 Rattenmodell für MetS-bezogenen HFpEF)22zeigen. Bestehende Isolation Protokolle wurden optimiert und ergänzt durch eine einfache, maßgeschneiderte Gerät Intraluminal Druck der kardialen Hohlräume, führt zu höheren Erträgen von morphologisch und funktionell intakt Kardiomyozyten zu kontrollieren. Das folgende Protokoll sieht der Forscher eine schrittweise Anleitung, eine detaillierte Beschreibung der maßgeschneiderte Ausrüstung sowie eine Liste von Lösungen und eine umfassende Anleitung zur Fehlerbehebung.
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Protocol
Alle Experimente wurden von der lokalen Ethikkommission (TVA T0060/15 und T0003-15) genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Institute of Health, U.S.A.).
Hinweis: Ein vereinfachtes Flussdiagramm des Verfahrens ist in Abbildung 1dargestellt.
(1) Großereignis
- Bereiten Sie die Puffer gemäß Tabelle 1.
| Lösung | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Reagenz (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| Na2HPO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurin | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Glukose | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0,01 | 0,125 | 0,25 | 0,5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Gereinigtes Enzym Mischung (mittlere Thermolysin) | 0.195 Wünsch Einheiten/mL | ||||||||
| der pH-Wert eingestellt | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| bei der pH-Wert eingestellt | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| mit der pH-Wert eingestellt | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Tabelle 1: Liste der Puffer. PB: Perfusion Puffer, die für 3 Tage bei 4 ° C (300 mL pro Tier) gespeichert werden können. CB: Kanülierung Puffer, die für 3 Tage bei 4 ° C (200 mL pro Tier) gespeichert werden können. DB: Verdauung Puffer, welches im Laufe des Tages (40 mL pro Tier) verwendet werden. SB: stoppen Puffer, die muss innerhalb des Tages (2 mL pro Tier) verwendet werden. S1: Schritt 1 Puffer, welches im Laufe des Tages (2 mL pro Tier) verwendet werden. S2: Schritt 2 Puffer, welches im Laufe des Tages (2 mL pro Tier) verwendet werden. S3: Schritt 3 Puffer, welches im Laufe des Tages (2 mL pro Tier) verwendet werden. NT: normale Tyrode, welches im Laufe des Tages (50 mL pro Tier) verwendet werden.
-
Bereiten Sie den Langendorff-Apparat (Abbildung 2A).
- Spülen Sie das System mit 100 mL 70 % Ethanol, gefolgt von 2 Spülungen von 100 mL destilliertem Wasser. Füllen Sie das System mit 200 mL Perfusion Puffer (PB).
- Die Durchflussmenge der peristaltischen Pumpe bis 3 mL/min eingestellt.
- Kalibrieren Sie die Temperatur von der PB verlassen den Langendorff-Apparat auf 39 ° C.
- Legen Sie die maßgeschneiderte Kanüle [16 G, 25 mm lang, scharfe Spitze entfernt (Abbildung 3A)] auf den Langendorff-Apparat und starten Sie den Fluss. Schalten Sie das Heizmodul und passen Sie den Wert des Moduls Heizung auf die gewünschte Temperatur von PB an der Spitze der Kanüle zu erreichen. Nach Abschluss der Kalibrierung der Temperatur bewegen Sie die maßgeschneiderte Kanüle auf die Spritze für die Kanülierung (Abb. 2 b) verwendet.
- Bereiten Sie die Druck-Steuergerät (Abbildung 3) neben dem Langendorff-System. Montieren Sie die Butterfly-Nadel auf die Stativschelle und bereiten Sie 3 blockierende Knoten.
Hinweis: Kollagenase Enzym-Aktivität variiert mit der Temperatur. Eine Temperaturüberwachung des linken Vorhofs sowie eine dynamische Anpassung, wird später in der Prozedur benötigt.
- Stellen Sie das Gerät für die Orgel-Exzision und die Kanülierung gemäß Abb. 2 b. Füllen Sie den Becher, Spritze und Petrischale mit einem eiskalten Kanülierung Puffer (CB) und bereiten Sie die Kanülierung Knoten.
-
Heparinize der Ratte mit 500 IE Heparin pro 100 g Körpergewicht die Ratte wie folgt.
- Setzen Sie 2 mL 100 % Isofluran in einer Narkose Induktion Kammer für Nager geeignet. Transfer 21 Wochen alten ZFS-1 fettleibig Ratte aus dem Käfig der Induktion-Kammer. Lassen Sie die Ratte tief Anästhesie, angezeigt durch eine Verlangsamung der Atmung auf die Hälfte seiner ursprünglichen Frequenz eingeben.
- Entfernen Sie die Ratte aus der Induktion-Kammer. Injizieren Sie 500 IE Heparin pro 100 g Körpergewicht die Ratte in das Bauchfell mit einer Heparin-Spritze.
- Die Ratte in seinem Käfig zurück und ermöglichen es, aufzuwachen.
Hinweis: Es ist nicht notwendig, Sterilität während Schritt 1.4 beizubehalten. Warten Sie 20 Minuten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Eine unvollständige Antikoagulation kann dazu führen, dass Blut gerinnen, führt zu Mikro-Infarkte, die wesentlich die Qualität und den Ertrag der isolierten Kardiomyozyten auswirken können.
2. Herz-Vorbereitung
- Setzen Sie 2 mL 100 % Isofluran in einer Narkose Induktion Kammer für Nager geeignet. Transfer 21 Wochen alten ZFS-1 fettleibig Ratte aus dem Käfig der Induktion-Kammer. Lassen Sie die Ratte tief Anästhesie, angezeigt durch eine Verlangsamung der Atmung auf die Hälfte seiner ursprünglichen Frequenz eingeben.
- Einschläfern des Tieres durch Enthauptung mit einer Guillotine für Nager geeignet. Die Gliedmaßen der Ratte auf eine Styropor-Unterlage zu fixieren. Heben Sie an und entfernen Sie die Haut mit chirurgische Scheren Xiphoid Prozeß zu bedecken. Das Bauchfell unterhalb der Rippe Käfigen auf beiden Seiten zu öffnen und das Zwerchfell aussetzen.
- Öffnen Sie die Membrane durch ein Schnitt entlang der vorderen Bogen mit einer feinen Schere. Schnitt durch die Rippen auf beiden Seiten entlang der Linea Mediaclavicularis zum clavicular Knochen, chirurgische Scheren, das Mediastinum in Situaussetzen mit.
- Entfernen Sie die Lunge an den distalen Enden der Hila mit feiner Schere. Schneiden Sie den Thymus, den Aortenbogen verfügbar zu machen.
- Klemmen Sie die Basis des Herzens mit Pinzette und ziehen vorsichtig nach unten in Richtung der Schweif des Tieres. Quer durch die Aorta und gleichzeitig einen Zug auf das Herz, das Herz angebracht verlassen ein 5 mm langes Segment der Aorta. Schnelle Übertragung von Herzen in der 50 mL eiskaltes CB in 50 ml-Becherglas (Abb. 2 b).
Hinweis: Während der Schritte 2,5-3,3, ist das Herz effektiv bei ischämischen Bedingungen. Vermeiden Sie mehr als 3 min für folgendermaßen vor, um nicht die Herzmuskelzellen schädigen.
(3) Kanülierung
- Warten Sie ca. 10 s für das Herz zum Abkühlen und Kontraktionen zu ergreifen. Übertragen Sie das Herz in eine Petrischale mit 50 mL frisches, eiskaltes CB. Entfernen Sie vorsichtig das Fettgewebe rund um die Aorta mit Zange und Schere.
- Legen Sie die maßgeschneiderte Kanüle (das gleiche wie in Schritt 1.2.3 verwendet), das mit den 10 mL Spritze gefüllt mit eiskalten CB, 3 mm in die Aorta verbunden ist. Fixieren der Aorta auf die Kanüle durch das Binden eines der zwei Kanülierung Knoten (Abb. 3 b) in die Vertiefung proximal an der Spitze der Kanüle.
Hinweis: Achten Sie nicht, die Aortenklappe durch eine Penetration mit der Kanüle zu beschädigen. - Sanft Spülen der Aorta mit 5 mL eiskaltes CB mit der Spritze mit der Kanüle verbunden, bis kein Blut mehr in die Herzkranzgefäße sichtbar ist. Sanft massieren Sie den linken Vorhof mit Pinzette und injizieren Sie die restliche 5 mL CB, damit kein überschüssiges Blut in der Petrischale aus der Kavität entfernt werden.
- Die zweite Kanülierung Knoten (Naht: USP 3/0, Seide) in die Vertiefung distal an der Spitze der Kanüle. Deaktivieren Sie die Kanüle mit dem beigefügten Herzen aus der Spritze. Montieren Sie die Kanüle mit dem beigefügten Herzen auf die Verwendung eines entsprechenden Adapters Langendorff.
Hinweis: Dieses Protokoll beschäftigt erhöhten Druck in den linksventrikulären Hohlraum während der Perfusion der Langendorff-Apparat. Der zusätzliche Kanülierung Knoten ist erforderlich, um diesen Druck aufrecht zu erhalten, durch die Vermeidung von Undichtigkeiten Anterograde Puffer durch die Aorta.
4. Druck Manipulation und Verdauung
- Starten Sie die Peristaltische Pumpe Langendorff-Apparate, die Perfusion der das Herzgewebe mit PB zu initiieren. Binden Sie einen doppelten Überhandknoten (Naht: USP 3/0, Seide) rund um die Basis des Herzens, mit Ausnahme der Aorta. Wiederholen Sie diesen Schritt bis eine Inflation von den rechten und linken Vorhof sowie den Koronarsinus bemerkt.
- Punktion des Atriums mit der Butterfly-Nadel des Druck-Steuergerätes (Abbildung 3D) und lassen das Atrium zu entlüften. Manipulieren des Intraluminal Drucks des Atriums durch Anpassung der Höhe des Schlauches Schmetterling. Halten Sie das Atrium etwas aufgeblasen, während der Rest des Verfahrens; überwachen und entsprechend anzupassen.
Hinweis: Dieser Schritt muss zügig durchgeführt werden, da eine anhaltende Inflation des linken Vorhofs Cardiomyocyte Tod führen wird. - Messen Sie die ungefähre Temperatur des linken Vorhofs durch die Positionierung der Temperaturfühler zwischen dem linken Vorhof und die linke Herzkammer. Stellen Sie die Temperatur von Langendorff Heizung Modul entsprechend, Ausrichtung auf eine ungefähre Temperatur von 37 ° C des linken Vorhofs.
- Durchspülen Sie das Herz mit PB für eine Gesamtmenge von 3 min.
- Wechseln Sie die Perfusion zur Verdauung Puffer (DB) für ca. 14-18 min.
Hinweis: Die Verdauung ist abgeschlossen, wenn die linken atriale Struktur reduziert und das Gewebe eine milchige Konsistenz erwirbt. - Klemmen Sie das Atrium mit Pinzette und erlassen ein leichtes ziehen. Entfernen Sie den linken Vorhof mit einer feinen Schere und übertragen Sie das Atrium in einem großen mit einem Gewicht von Boot mit 2 mL Puffer (SB), das Gewebe vollständig untertauchen zu stoppen.
- Entsorgen Sie die restlichen Herzgewebe nach den Richtlinien des Labors, wo der Eingriff durchgeführt wird.
5. Handy-Verarbeitung und Kalzium erneute Anpassung
- Zerkleinere die atriale Gewebe in kleine Stücke von etwa 2 x 2 mm mit einer feinen Schere.
- Das Gewebe durch eine sanfte Saugwirkung zu zerstreuen und Auswurf des Gewebes Brocken mit einer transferpipette. Fahren Sie dieses Verfahren für ca. 5 min, bis eine makroskopische Dissoziation des Gewebes beobachtet werden kann.
Hinweis: Vermeiden Sie alle Luftblasen während dieses Schrittes, als die Zellen an der Luft ausgesetzt werden Cardiomyocyte Tod führen. - Übertragen Sie die Zellen auf eine 15 mL konische Rohr. Lassen Sie die Gewebe-Brocken für 30 S. Übertragung den überstand in ein anderes 15 mL konische Röhrchen zu begleichen. Lassen Sie die Zellen für 15 min zu begleichen.
- Entfernen und entsorgen des Überstands. Fügen Sie 2 mL Schritt 1 Puffer (siehe Tabelle 1). Lassen Sie die Kardiomyozyten für 10 min zu begleichen.
Hinweis: Der ausrangierte überstand enthält auch Fibroblasten und Endothelzellen. Finden Sie in anderen Protokollen, wenn es gewünscht ist, verwenden Sie diese Zellen für Experimente14,23. Das Pellet wird meist Vorhofflimmern Kardiomyozyten enthalten, die durch Lichtmikroskopie bestätigt werden kann. Die mikroskopischen Eigenschaften von Vorhofflimmern Kardiomyozyten sind im Schritt 6.1 diskutiert. - Entfernen und entsorgen des Überstands. 2 mL Schritt2 Puffer hinzugeben. Lassen Sie die Kardiomyozyten für 10 min zu begleichen.
- Entfernen und entsorgen des Überstands. Schritt 3-Puffer 2 mL hinzugeben. Lassen Sie die Kardiomyozyten für 10 min zu begleichen.
- Entfernen und entsorgen des Überstands. Fügen Sie 250 µL des normalen Tyrode (NT) mit 1 mM Ca2 +.
- 50 µL der normalen Tyrode mit Vorhofflimmern Kardiomyozyten auf einem Glasboden Gericht, das mit 25 % Laminin überzogen wurde (und vorher Trocknen) zu übertragen. Lassen Sie die Kardiomyozyten für 10 min zu begleichen.
- Füllen Sie eine Glasboden Gericht mit 500 µL 1 mM CaCl2mit NT.
6. Funktionelle Bewertung der Erregung-Kontraktion-Kupplung
- Bewerten Sie die Zellmorphologie und Lebensfähigkeit unter einem Lichtmikroskop mit 20 X Vergrößerung (Abb. 4A und 4 b). Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie etwa 100 Zellen und klassifizieren sie als lebensfähig oder nicht lebensfähig, um die Lebensfähigkeit der Zellen isoliert Verfahren zu schätzen.
Hinweis: Lebensfähige Zellen zeichnen sich durch symmetrische sarkomers Struktur, das Fehlen von Membran Blebs und ein Stab-Form. -
Die Wägezellen mit Ca2 +-sensible Fluoreszenzfarbstoff innerhalb von 20 Minuten ausfüllen Schritt 5.9.
- Fügen Sie 10 µM Fluo4-AM, 500 µL NT Entfernen des Überstands aus der Glasboden Schale (aus Schritt 5.9). Fügen Sie das NT mit Fluo4-Uhr auf den Glasboden Teller. Inkubieren Sie die Mischung für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen und entsorgen des Überstands. Waschen Sie die Probe 2 x mit 500 µL des NT.
-
Visualisieren Sie die Ca2 +-Anregung mit einem confocal Mikroskop wie folgt.
- Die Glasboden Schale auf einem confocal Mikroskop übertragen und visualisieren die Ca2 +-Anregung mit einem confocal Mikroskop (laser-Intensität mit 5,8 %, Erregung bei 488 nm, Emission bei 515 nm) mit einer 40 X Vergrößerung.
- Durchspülen Sie die Zellen mit NT auf 37 ° C mit einer entsprechenden superfusion Gerät erhitzt. Alternativ halten Sie die Zellen warm mit einem Mikroskop montierte Hitze Inkubator.
- Stimulieren Sie die Herzzellen in einem elektrischen Feld mit im Handel erhältlichen, Mikroskop montierte Stimulator Elektroden bei einer Frequenz von 1 Hz und einen elektrischen Strom von 24 A. warten Sie 1 Minute damit die Zellen ein Fließgleichgewicht Ca2 + Handling zu erreichen.
- Legen Sie die Scan-Linie parallel zur transversale Achse, auf halbem Weg zwischen dem Kern und den Rand einer zufällig ausgewählten makroskopisch contracting Zelle. Erwerben Sie Linie Scan Bilder durch sich wiederholende scannen.
- Verwenden Sie frei verfügbaren Software zur Abbilderstellung um die Signalintensität unmittelbar vor einer elektrischen Stimulation (F0) über die gesamte Zelle abzuschätzen. Zeichnen Sie die Signalintensität über die gesamte Zelle im Laufe von 1 stimulationszyklus (F). Teilen Sie (F) durch (F0), um die jeweiligen Ca2 + vorübergehend zu erhalten.
Abb. 1: vereinfachtes Flussdiagramm des Verfahrens Isolierung. Das Verfahren ist sehr zeitkritisch, bis die enzymatische Verdauung der Myozyten abgeschlossen ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vorbereitung der Ausrüstung vor der Isolation. (A) dieses Panel zeigt einen selbstgebauten Langendorff-Vorrichtung: (1) einem doppelwandigen Reaktionsgefäß mit PB; (2) einem doppelwandigen Reaktionsgefäß mit CB; (3) eine 3-Wege-Hahn; (4) eine Spritze; (5) eine Peristaltische Pumpe; (6) eine Heizung eintauchen; (7) eine doppelwandige Blase Falle; und (8) die Kanüle und das Herz. (B) dieses Panel zeigt das Setup für die Kanülierung und Orgel Exzision für einen optimierten Arbeitsablauf: (1) eine 100 mL-Becherglas mit 50 mL eiskaltes CB; (2) eine 10 mL Spritze mit eiskalten CB; (3) eine Petrischale mit eiskalten CB; (4) eine Lichtquelle; (5) die maßgeschneiderte Kanüle mit einem Kanülierung Knoten (siehe auch Abbildung 3A und 3 b); (6) feine, gebogene Zange; (7) Gewebe Zange; (8) feine Pinzette, gewinkelt 45°; (9) Bauch chirurgische Scheren; (10) feine chirurgische Scheren; (11) 4 x 30 G Nadeln; und (12) eine Nadel 15 G. (C) dieses Panel zeigt die Mikroskop montierte Ausrüstung für die konfokale Bildgebung: (1) elektrischen Stimulator Elektroden; (2) eine superfusion Stift; (3) ein Glasboden Gericht mit der asbesthaltiger; und (4) eingetaucht Platin elektrischen Stimulator Elektroden. (D) dieser Bereich zeigt die Mikroskop-Set-up für die konfokale Bildgebung: (1) die confocal Mikroskop; (2) eine superfusion Stift; (3) ein superfusion Puffer Reservoir; (4) eine superfusion Durchflussregler; (5) ein Superfusion Modul Heizung; (6) ein Computer-Arbeitsplatz; und (7) einer elektrischen Stimulator. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: maßgeschneiderte Ausrüstung. (A) dieses Panel zeigt die manipulierten 15 G Kanüle mit einem Luer-Lock. Die Pfeile zeigen zwei Vertiefungen für die Kanülierung Knoten. (B) sind die Kanülierung Knoten, zwei doppelte Overhand Knoten für schnelle Straffung übereinander gelegt. Die Pfeile zeigen an, wo und in welcher Reihenfolge der Knoten muss gestrafft werden. (C) dieses Panel zeigt den montierten druckführenden Gerätes. Eine Schmetterling Nadel 21 G ist in eine Stativschelle eingehängt. Der Schlauch wird auf der gleichen Höhe wie die Nadel gehalten. Der Schraubverschluss ist geöffnet. Die Höhe des Schlauches Schmetterling kann verändert werden, wie durch die Pfeile angedeutet, um den Intraluminal Druck des linken Vorhofs zu ändern. (D) der linken Atrium ist mit der Druck-Steuergerät punktiert. Dieses Bild zeigt einen im Idealfall aufgeblasenen linken Vorhof. Die Ellipse markiert die Platzierung der Überhandknoten. (E) der linken Atrium ist mit der Druck-Steuergerät punktiert. Dieses Bild zeigt eine aufgeblasene linken Vorhof, was zu niedrigeren Renditen von lebensfähigen asbesthaltiger führt. Die Ellipse markiert die Platzierung der Überhandknoten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Representative Results
21 Wochen alt können 60 – 90 % der lebensfähigen ACMs (geschätzt wie in Schritt 6.1 beschrieben), nach der Kalzium-Re-Anpassung (Schritt 5.4 – 5,7), von fettleibigen Ratten ZSF-1 mit dieser Methode (Abb. 4A) isoliert werden. Bei Ratten zeichnen sich durch eine andere und mehr heterogene Phänotyp im Vergleich zu VCMs24,25ACMs. Abbildung 4 b zeigt eine einzelne ACM mit erhaltenen Membranen und sarkomers Struktur, beide starken Indikatoren für eine funktionell integrierte Zelle.
Die erworbenen asbesthaltiger können in verschiedener Weise verarbeitet werden. Wie in Abbildung 5veranschaulicht, können die Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen zur Untersuchung der Morphologie und/oder Funktion geladen werden. Zum Beispiel wurde di-8-ANEPPS verwendet, um das Röhrensystem in ein Vorhofflimmern Ratte-Zelle (Abb. 5A) abzugrenzen. In einer anderen Reihe von Experimenten beschäftigt Mitochondrien-Färbung weit rot-Fluoreszenz-Farbstoff (z.B. Mitotracker Red FM) cytosolische Mitochondrien (Abb. 5 b) Vorhofflimmern umgestalten zu erkennen. Wie in Abbildung 5gezeigt, asbesthaltige isoliert mit diesem Protokoll eignen sich auch für das Leben-Zelle Ca2 + Imaging und zeigen intakt Erregung-Kontraktion Kupplung mit 1 Hz Feld-Stimulation. Alle Bilder können zur weiteren Analyse unter Verwendung verschiedener Algorithmen zur Verfügung, um die Forscher6,7 (Abbildung 5) verwendet werden.
Abbildung 4: jeweiligen Ausbeute an lebensfähigen, einzellige AM. (A) dieses Panel zeigt der Ausbeute an eine Isolation nach der erneute Anpassung des ACMs bis 1 mM Ca2 + in NT. (B) dieses Panel zeigt eine isolierte, einzellige Vorhofflimmern Cardiomyocyte. Sarkomers Struktur, Zellmembran und Kern sind deutlich sichtbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Färbung der Ratte asbesthaltiger mit Fluoreszenzfarbstoffen. (A) dieses Panel zeigt die Färbung einer Zellmembran und röhrenförmigen Netz mit dem fluoreszierenden Farbstoff Di8ANNEPS. (B) dieses Panel zeigt die Färbung der Mitochondrien mit dem Fluoreszenzfarbstoff Mitotracker-rot-zegit (C) dieser Bereich zeigt die transversale Linie Scan a Ca2 +-Anregung mit fluoreszierenden Farbstoff Fluo4-Uhr über eine einzelne Zelle. Die Pfeile zeigen die elektrische Stimulation, durchgeführt bei 1 Hz. (D) dieses Panel die Longitudenal Ca2 + Transienten Panel Cabgeleitet zeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschrieben wir zunächst ein Protokoll für die Isolierung von einzelligen asbesthaltiger aus einem Rattenmodell der MetS-bezogenen HFpEF, die zeigt Vorhofflimmern umgestaltet22markiert. Das Verfahren ist einzigartig anspruchsvoll, wie übermäßiges Fettgewebe die chirurgische Vorbereitung sowie die Kanülierung der Aorta, immer schwieriger machen kann. Die Anleitung zur Fehlerbehebung gemäß Tabelle 2 Adressen der am häufigsten auftretenden Probleme des Verfahrens isoliert.
| Problem | Mögliche Ursache | Lösung |
| Keine Strömung durch Schmetterling Schlauch | Unsachgemäße Schließung der Aorta mit der Kanülierung Knoten | Fettgewebe zu entfernen, bevor Sie anziehen |
| 3. Kanülierung Knoten mit jeweiligen Einzug hinzufügen | ||
| Ziehen Sie Knoten mit Hand für erhöhte Kraft | ||
| Blockierte Nadel | Passen Sie die Position in das lumen | |
| Blockierung durch sanftes ziehen mit Spritze | ||
| Rechten Vorhof / Koronarsinus nicht aufgeblasen | Unsachgemäße Schließung der Herz-Basis | Blockablauf mit zusätzlichen Knoten |
| Rechten Vorhof beschädigt während der Zubereitung | Leckage mit Clips/Knoten in der Nähe | |
| Schlechte Verdauung / Atrium nicht erweichen. | Geringere Enzymaktivität durch falsche Temperatur | Temperatur auf 37 ° C |
| Inaktiv/degradiert Enzym | Ersetzen | |
| Alte/übermäßig fibrotische atrium | Dauer der Verdauung zu erhöhen (in Schritten von + 50 %) | |
| Beschädigte Aortenklappe | Flache Eindringen während Kanülierung | |
| Armen Zellausbeute | Atrium über verdaut | Dauer der Verdauung zu verringern (in Schritten von + 25 %) |
| Intraluminal Druck durch Senkung der Schmetterling-Schlauch zu reduzieren | ||
| Atrium unter verdaut | Dauer der Verdauung (in Schritten von 25 %) zu erhöhen | |
| Erhöhen Sie Intraluminal Druck, durch die Erhöhung der Schmetterling-Schlauch | ||
| Zelle Dispersion zu aggressiv | Sein sanfter |
Tabelle 2: Handbuch zur Problembehandlung. Diese Tabelle zeigt die häufigsten Probleme isoliert und ihre jeweiligen Lösungen.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass die ZFS-1 fettleibig Rattenmodell Exponate umfassende Vorhofflimmern Umbau mit einer erhöhten Vorhofflimmern Größe22. Eine Zunahme der linken atrial Größe hat als ein wichtiger prognostischer Marker für diastolische Dysfunktion26 anerkannt worden und führt zu einer Rarefication der mikrovaskuläre Schiffe bezogen auf das Gewebe. Dies führt zu einer verminderten Verteilung des Puffers Verdauung durch die retrograde Perfusion der Aorta bei der Isolierung, Rendern die einzelligen Isolierung in diesem Modell besonders anspruchsvoll. Anderen typischen Merkmale von Vorhofflimmern Umbau, Vorhofflimmern Fibrose und erhöhte Fibrose haben für ZDF Ratten gezeigt – einem Rattenmodell für metabolische Diabetes und ein Elternteil Stamm von der ZFS1 Ratten27. Kollagen-Ablagerungen beeinträchtigen die Wirksamkeit von Verdauungs-Enzymen zu befreien die Herzzellen aus der extrazellulären Matrix und erfordern daher, weitere Anpassungen der Zelle isoliert Verfahren28.
Der Mechanismus, mit dem des Druckgerätes die verbesserte Isolation Ergebnisse in diesem Modell der atrialen Umgestaltung erleichtert, ist am ehesten im Zusammenhang mit einer lokalisierten Dämpfung des koronaren Blutflusses des linken Vorhofs. Ein wichtiger Bestandteil des koronaren Blutflusses ist koronarer Perfusionsdruck, definiert als die Steigung zwischen der koronaren und dem End-diastolischen Druck der jeweiligen Hohlraum29. Während die beschriebene Vorgehensweise führt eine Blockade der Herz-Basis zu einem weltweiten Anstieg der koronaren und Intraluminal Druck im Herzen. Die anschließenden Punktion des linken Vorhofs ermöglicht einen lokalen, gezielte Tropfen Intraluminal Druck in der linken atrial Aussparung. Also nicht nur eine große koronaren Perfusion Druckgefälle entsteht, sondern die Perfusion Volumen steigt auch durch die umgeleiteten aufschlusslösung aus dem überlasteten linken Ventrikel in den linken Vorhof.
Darüber hinaus ist die Wahl der Verdauung Enzyme ist entscheidend für die ACM-Isolierung: gereinigtes Enzym Mischungen von Kollagenase I und II gezeigt haben, dass weniger zielgerichtet und weniger reine Enzyme wie Collagenases30überlegen sein. Dieses Enzym lässt sich nicht nur für eine höhere Ausbeute an morphologisch und funktionell intakt Kardiomyozyten sondern minimiert auch Verklumpung der einzelnen Zellen nach ihrer Isolierung31. Gereinigtes Enzym Mischungen von Collagenases mit einer zusätzlichen hohen Dispase oder mittlere Thermolysin Inhalte werden am häufigsten für Ratte Cardiomyocyte Isolationen. Während VCMs bei höheren Konzentrationen am besten isoliert sind, wurden die besten Ergebnisse von Vorhofflimmern Myozyten erworben mit einer Konzentration von 0.195 Wünsch Einheiten/mL mit diesem Protokoll32.
Da die Prävalenz der MetS-bezogenen HFpEF2 und Vorhofflimmern Kardiomyopathien führen zu Vorhofflimmern Umbau und Vorhofflimmern steigt Vorhofflimmern sind klinisch sehr relevant, Forschung in diesem Bereich ist der zentrale Interesse. Viele neue Tiermodelle für HFpEF33,34 entstehen und Vorhofflimmern Umbau im Einklang mit einer erhöhten Inzidenz von atrialen Rhythmusstörungen sind die typischen Merkmale der Erkrankung. Das beschriebene Verfahren erlaubt es den Forschern, tragfähige einzelnen Herzzellen von Ratte-Modelle mit Vorhofflimmern Umbau für eine weitere Studie mit einer außergewöhnlich hohen Ertrag zu isolieren und mechanische und elektrische Funktion erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch die DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, d.b.), die EKFS (Else-Kröner-Fresenius-Stiftung, f.h.), und durch das BMBF (deutschen Bundesministerium für Bildung und Forschung) sowie Bosnien und Herzegowina-Charité, klinische Wissenschaftler Programm finanziert, von der Charité - Universitätsmedizin Berlin und das Berlin Institute of Health (f.h.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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