Summary
Aqui, descrevemos um procedimento otimizado, Langendorff-baseado para o isolamento de célula única cardiomyocytes atrial de um modelo do rato de metabólica relacionadas com síndrome de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada. Uma regulação manual da pressão intraluminal de cavidades cardíacas é implementada para render funcionalmente intactos miócitos apropriados para estudos de acoplamento excitação-contração.
Abstract
Neste artigo, descrevemos um procedimento otimizado, Langendorff-baseado para o isolamento de célula única cardiomyocytes atrial (ACMs) a partir de um modelo do rato da síndrome metabólica (MetS)-relacionadas com a insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF). A prevalência de HFpEF relacionados com MetS está aumentando, e atrial cardiomiopatias associadas a remodelação atrial e fibrilação atrial são clinicamente altamente relevantes como a remodelação atrial é um preditor independente de mortalidade. Estudos com cardiomyocytes isolado de célula única são frequentemente usados para confirmar e complementar os achados na vivo . Rarefication de vasos circulatórios e fibrose do tecido intersticial representam um fator potencialmente limitante para o isolamento de célula única bem-sucedida do ACMs de modelos animais da doença.
Abordámos esta questão empregando um dispositivo capaz de regular manualmente a pressão intraluminal de cavidades cardíacas durante o procedimento de isolamento, aumentando substancialmente o rendimento do ACMs morfologicamente e funcionalmente intactos. As células adquiridas podem ser usadas em uma variedade de experiências diferentes, tais como cultura de células e imagiologia funcional de cálcio (ou seja, acoplamento excitação-contração).
Nós fornecemos o pesquisador com um protocolo passo a passo, uma lista de soluções otimizadas, completa instruções para preparar o equipamento necessário e um abrangente Guia de solução de problemas. A implementação inicial do processo pode ser bastante difícil, uma adaptação bem sucedida permitirá ao leitor realizar os isolamentos de ACM do estado-da-arte em um modelo do rato de HFpEF relacionados com MetS para um amplo espectro de experiências.
Introduction
MetS descreve um conjunto de fatores de risco para doenças cardiovasculares e diabetes mellitus tipo 2 e inclui uma aumento da pressão arterial, dislipidemia (gerado triglicerídeos e abaixou o colesterol da lipoproteína de alta densidade), aumentou o jejum glicose e obesidade central1. A prevalência mundial de MetS é estimada em 25 – 30% e constantemente crescente2. HFpEF é uma síndrome clínica heterogênea, frequentemente associada com MetS. A remodelação cardíaca durante HFpEF e suas fases anteriores (ou seja, doença cardíaca hipertensiva) também é acompanhada por uma remodelação dos átrios3. Função contrátil reduzida e mudanças estruturais da aurícula esquerda têm sido associadas com aumento da mortalidade, fibrilação atrial e insuficiência cardíaca de início novo4. Remodelamento atrial é caracterizada por alterações em função de canais de íon, homeostase de Ca2 + , estrutura atrial, ativação de fibroblastos e tecido fibrose5. Deixou a remodelação atrial HFpEF MetS-relacionados e seu subjacente mecanismos patológicos são ainda mal compreendidos e exigem uma investigação mais aprofundada. Modelos animais provaram ser uma ferramenta valiosa e levar a muitos avanços no campo de cardiomiopatias atrial6,7,8,9.
Estudos com cardiomyocytes isolado de célula única são frequentemente usados para confirmar e complementar os achados na vivo . Um isolamento e cultura de pilha subsequente potencial, permitem a investigação de sinalização de vias, correntes de canal iônico e acoplamento excitação-contração. Em condições fisiológicas, cardiomyocytes não se proliferam. A fusão entre as sequências reguladoras transcriptional de um fator de natriuretic atrial e um vírus simian 40 grande T antígeno em ratos transgénicos levou à criação das ACMs imortalizados primeiros, denominado AT-110. O desenvolvimento de células de AT-1 deu origem a células HL-1, que só não podem ser passadas em série, mas também espontaneamente contraem11. Eles, no entanto, mostram diferenças estruturais e funcionais, em comparação com células recém isoladas, tais como uma ultraestrutura menos organizada, uma alta ocorrência de desenvolver miofibrilas11e um-o hyperpolarization interno atual12. O isolamento dos cardiomyocytes ventricular (VCM) em ratos e camundongos de uma variedade de modelos é bem estabelecida13,14,15,16,17,18 , 19. geralmente, o coração extirpado é montado um aparato de Langendorff e retrogradely pintado com uma Ca2 +-buffer livre que contém enzimas digestivas, tais como colagenases e proteases. Cálcio é reintroduzido em seguida de forma gradual às condições fisiológicas. No entanto, apesar de protocolos dedicados ao isolamento da ACMs estão disponíveis20,21, devido ao aumento de fibrose e diferenças de pressão-relacionados, sua utilidade em modelos de doenças com remodelação atrial é limitada.
Neste artigo, temos implementado um protocolo para a isolação de atrial cardiomyocytes de célula única de animais que apresentem atrial remodelação (i.e., em especial para o modelo do rato de ZFS1 para HFpEF MetS-relacionados)22. Protocolos de isolamento existentes foram otimizados e complementados por um dispositivo simples, feitos sob medido para controlar e modificar a pressão intraluminal das cavidades cardíacas, levando a rendimentos mais elevados dos cardiomyocytes morfologicamente e funcionalmente intactos. O protocolo seguinte fornece o pesquisador com um guia passo a passo, uma descrição detalhada do equipamento feito sob medido, uma lista de soluções, bem como um abrangente Guia de solução de problemas.
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Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local (TVA T0060/15 e T0003-15) e executados de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório (Instituto Nacional de saúde, U.S.A.).
Nota: Um fluxograma simplificado do processo é mostrado na Figura 1.
1. predisposições
- Prepare os buffers de acordo com a tabela 1.
| Solução | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Reagente (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| Na2HPO4 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurina | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Glicose | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0.01 | 0,125 | 0.25 | 0,5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Mistura de enzima purificada (média Thermolysin) | 0.195 Wünsch unidades/mL | ||||||||
| pH ajustado para | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| pH ajustado em | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH ajustado com | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Tabela 1: lista de Buffers. PB: buffer de perfusão, que pode ser armazenado por 3 dias a 4 ° C (300 mL por animal). CB: buffer de canulação, que pode ser armazenado por 3 dias a 4 ° C (200 mL por animal). DB: buffer de digestão, que tem de ser usado no mesmo dia (40 mL por animal). SB: parando de reserva, que deve ser usado no mesmo dia (2 mL por animal). S1: Buffer de etapa 1, que tem de ser usado no mesmo dia (2 mL por animal). S2: Buffer do passo 2, que tem de ser usado no mesmo dia (2 mL por animal). S3: Buffer do passo 3, que deve ser usado no mesmo dia (2 mL por animal). NT: Tyrode normal, que deve ser usado no mesmo dia (50 mL por animal).
-
Prepare o aparelho de Langendorff (Figura 2A).
- Irrigue o sistema com 100 mL de etanol a 70%, seguido por 2 descargas de 100 mL de água destilada. Encha o sistema com 200 mL de tampão de perfusão (PB).
- Defina a taxa de fluxo da bomba peristáltica de 3 mL/min.
- Calibrar a temperatura do PB deixando o aparelho de Langendorff a 39 ° C.
- Coloque a cânula sob medida [16 G, 25 mm de comprimento, afiada ponta removida (Figura 3A)] em cima do aparelho de Langendorff e iniciar o fluxo. Ligue o módulo de aquecimento e ajuste o valor do módulo de aquecimento para atingir a temperatura desejada do PB na ponta da cânula. A calibração de temperatura é concluída, mova a cânula sob medida para a seringa usada para a canulação (Figura 2B).
- Prepare o dispositivo de controle de pressão (Figura 3) ao lado do sistema de Langendorff. Montar a agulha borboleta ao grampo do tripé e preparar 3 bloqueio knots.
Nota: A atividade de enzima colagenase varia com a temperatura. Um monitoramento da temperatura da aurícula esquerda, bem como um ajuste dinâmico, é necessário mais tarde no processo.
- Configure o equipamento para a excisão de órgão e a canulação de acordo com a Figura 2B. Encher a proveta, seringa e placa de Petri com um buffer de canulação gelada (CB) e preparar os maçaricos de canulação.
-
Heparinize o rato com 500 UI de heparina por 100 gramas de peso do corpo do rato como segue.
- Colocar 2 mL de 100% de isoflurano em uma câmara de indução de anestesia apropriada para roedores. Transferência a 21 semanas ZFS-1 obeso rato da gaiola para a câmara de indução. Permitir que o rato entrar anestesia profunda, indicada por uma desaceleração na respiração a metade da sua frequência inicial.
- Remova o rato da câmara de indução. Injete 500 UI de heparina por 100 gramas de peso do corpo do rato no peritônio utilizando uma seringa de heparina.
- Retornar o rato em sua gaiola e permitir para que ele acorde.
Nota: Não é necessário manter a esterilidade durante a etapa de 1.4. Espere 20 min antes de prosseguir para a próxima etapa. Uma anticoagulação incompleta pode causar sangue coagulação, levando a microinfartos, que podem afetar substancialmente a qualidade e o rendimento dos cardiomyocytes isolado.
2. preparação do coração
- Colocar 2 mL de 100% de isoflurano em uma câmara de indução de anestesia apropriada para roedores. Transferência a 21 semanas ZFS-1 obeso rato da gaiola para a câmara de indução. Permitir que o rato entrar anestesia profunda, indicada por uma desaceleração na respiração a metade da sua frequência inicial.
- Eutanásia do animal por decapitação usando uma guilhotina apropriada para roedores. Se fixam os membros do rato sobre uma superfície de espuma de poliestireno. Levante e retire a pele que cobre o processo xifoide com tesoura cirúrgica. Abrir o peritônio abaixo as gaiolas costela em ambos os lados e expor o diafragma.
- Abra o diafragma, fazendo uma incisão ao longo do arco anterior, usando a tesoura bem. Corte as costelas em ambos os lados ao longo do linea mediaclavicularis ao osso clavicular, usando tesouras cirúrgicas, para expor o mediastino em situ.
- Remova os pulmões nas extremidades distais do Rodrigo com uma tesoura bem. Corte o timo para expor o arco aórtico.
- Aperte a base do coração usando a pinça e puxe suavemente para baixo em direção a cauda do animal. Corte através da aorta, mantendo uma pressão sobre o coração, deixar um segmento de tempo de 5 mm da aorta anexado ao coração. Rapidamente transferi o coração para o CB de 50 mL gelada no copo de 50 ml (Figura 2B).
Nota: Durante as etapas 2.5-3.3, o coração é eficazmente em condições isquêmicas. Evite exceder um total de 3 min para estas etapas na ordem para não danificar o cardiomyocytes.
3. canulação
- Espere cerca de 10 s para o coração arrefecer e aproveitar as contrações. Transferir o coração em uma placa de Petri contendo 50 mL de fresco, CB gelada. Remova cuidadosamente o tecido adiposo em torno da aorta usando fórceps e a tesoura.
- Inserir a cânula sob medida (o mesmo que usou na etapa 1.2.3), que é ligada à seringa de 10ml cheia de CB gelada, 3mm para a aorta. Fixa a aorta para a cânula amarrando dentre os dois nós de canulação (Figura 3B) no entalhe proximal à ponta da cânula.
Nota: Tenha cuidado para não danificar a válvula aórtica por uma penetração com a cânula. - Lave suavemente a aorta com 5 mL de gelado CB utilizando a seringa anexada para a cânula até não mais sangue é visível nas artérias coronárias. Suavemente o átrio esquerdo usando fórceps de massagem e injetar o restante 5 mL de CB, permitindo a qualquer excesso de sangue a ser removido da cavidade para o prato de Petri.
- O segundo nó de canulação (sutura: USP 3/0, seda) no entalhe distal até a ponta da cânula. Desmonte a cânula com o coração anexado da seringa. Monte a cânula com o coração anexado para o Langendorff usando um adaptador apropriado.
Nota: Este protocolo emprega elevada pressão na cavidade ventricular durante a perfusão para o aparelho de Langendorff. O nó de canulação adicional é necessária para manter esta pressão, evitando qualquer vazamento de tampão anterógrada através da aorta.
4. pressão de manipulação e digestão
- Ligue a bomba peristáltica do aparato de Langendorff para iniciar a perfusão do tecido cardíaco com PB. Um duplo nó de overhand (sutura: USP 3/0, seda) em torno da base do coração, excluindo a aorta. Repita este passo até uma inflação do átrio direito e esquerdo, bem como o seio coronário, é notado.
- Perfure o atrium com a agulha da borboleta do dispositivo de controle de pressão (Figura 3D) e permitir o átrio desinflar. Manipule a pressão intraluminal do átrio, ajustando a elevação da mangueira borboleta. Manter o átrio ligeiramente inflado durante todo o resto do procedimento; monitorar e ajustar de acordo.
Nota: Este passo precisa ser executada rapidamente, como uma prolongada inflação do átrio esquerdo resultará em casos de morte. - Medir a temperatura aproximada do átrio esquerdo pelo posicionamento de uma sonda de temperatura entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo. Ajuste a temperatura de Langendorff o módulo de aquecimento em conformidade, visando a uma temperatura aproximada de 37 ° C da aurícula esquerda.
- Perfundir o coração com PB, para um total de 3 min.
- Alterne a perfusão para um buffer de digestão (DB) para aproximadamente 14 – 18 min.
Nota: A digestão é completa quando a estrutura atrial esquerda que cai e o tecido adquire uma textura leitosa. - Beliscar o atrium usando fórceps e promulgar uma ligeira tração. Remover o átrio esquerdo com uma tesoura bem e transferir o átrio em um grande barco de pesagem contendo 2 mL de parando o tampão (SB), submergindo totalmente o tecido.
- Elimine o restante tecido cardíaco, seguindo as orientações do laboratório onde o procedimento é realizado.
5. célula de processamento e readequação de cálcio
- Picar o tecido atrial em pequenos pedaços de aproximadamente 2 x 2 mm com uma tesoura bem.
- Disperse o tecido por uma suave sucção e ejeção dos pedaços de tecido, usando uma pipeta de transferência. Continue este procedimento por aproximadamente 5 min até uma dissociação macroscópica do tecido pode ser observada.
Nota: Evite quaisquer bolhas de ar durante esta etapa, como expor as células de ar resultará em casos de morte. - Transferi as células para um tubo cônico de 15 mL. Permitir que os pedaços de tecido de contentar 30 s. transferência o sobrenadante para outro tubo cônico de 15 mL. Permitir que as células que se contentar em 15 min.
- Remover e descartar o sobrenadante. Adicionar 2 mL de tampão de etapa 1 (ver tabela 1). Permitir que o cardiomyocytes repousar por 10 min.
Nota: O sobrenadante Descartado também inclui fibroblastos e células endoteliais. Consulte outros protocolos se pretende usar essas células para experimentos de14,23. A pelota conterá principalmente cardiomyocytes atrial, que pode ser confirmado por microscopia de luz. As características microscópicas dos cardiomyocytes atrial são discutidas na etapa 6.1. - Remover e descartar o sobrenadante. Adicione 2 mL de tampão de etapa 2. Permitir que o cardiomyocytes repousar por 10 min.
- Remover e descartar o sobrenadante. Adicione 2 mL de tampão de etapa 3. Permitir que o cardiomyocytes repousar por 10 min.
- Remover e descartar o sobrenadante. Adicione 250 µ l de Tyrode normal (NT), contendo 1 mM Ca2 +.
- Transferi 50 µ l do normal Tyrode contendo cardiomyocytes atrial em um prato fundo de vidro, que foi revestido com 25% de laminina (e deixa-se secar previamente). Permitir que o cardiomyocytes repousar por 10 min.
- Encha um prato fundo de vidro com 500 µ l do NT contendo 1 mM CaCl2.
6. funcional avaliação de acoplamento excitação-contração
- Avalie a morfologia da célula e a viabilidade sob um microscópio de luz usando uma ampliação de X 20 (Figura 4A e 4B). Aleatoriamente, selecionar cerca de 100 células e classificá-los como viável ou inviável para estimar a viabilidade do processo de isolamento de célula.
Nota: Células viáveis são caracterizadas pela estrutura do sarcômero simétrico, ausência de bolhas de membrana e uma forma de haste. -
Carregar as células com o Ca2 +-tintura fluorescente sensível dentro de 20 min de completar um passo 5,9.
- Adicionar 10 µM Fluo4-AM a 500 µ l do NT. Retire o sobrenadante do prato fundo de vidro (da etapa 5,9). Adicione o NT contendo Fluo4-AM para o prato de vidro fundo. Incube a mistura por 20 min em temperatura ambiente. Remover e descartar o sobrenadante. Lave a amostra 2 x usando 500 µ l do NT.
-
Visualizar o Ca2 +-excitação com um microscópio confocal como segue.
- O prato de vidro-fundo de transferência de um microscópio confocal e visualizar o Ca2 +-excitação com um microscópio confocal (laser da intensidade em 5,8%, excitação em 488 nm, emissão em 515 nm) usando uma ampliação X 40.
- Perfundir as células com NT aquecido a 37 ° C, utilizando um dispositivo de superfusion apropriado. Alternativamente, aquece as células utilizando uma incubadora de calor montado microscópio.
- Estimule o cardiomyocytes em um campo elétrico com eletrodos estimulador comercialmente disponível, microscópio montado em uma frequência de 1 Hz e uma corrente elétrica de 24 a. esperar 1 min para permitir que as células alcançar um estado estacionário de manipulação de Ca2 + .
- Coloque a linha de varredura paralela ao eixo transversal, a meio caminho entre o núcleo e a borda de um selecionado aleatoriamente, macroscopicamente contratantes célula. Adquira imagens de varredura de linha pela verificação repetitiva.
- Use o software de imagem livremente disponível para estimar a intensidade de sinal imediatamente antes de uma estimulação elétrica (F0) através de toda a célula. Traça a intensidade de sinal através de toda a célula, ao longo do ciclo 1 estimulação (F). Divida (F) por (F0) para obter o respectivo Ca2 + transitória.
Figura 1: fluxograma simplificada do processo de isolamento. O procedimento é altamente sensível ao tempo, até que seja concluída a digestão enzimática dos miócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: preparação do equipamento antes do isolamento. (A), este painel mostra um aparelho de Langendorff self-made: (1) um recipiente de reação encamisadas com PB; (2) um recipiente de reação encamisadas com CB; (3) uma torneira de 3 vias; (4) uma seringa; (5) uma bomba peristáltica; (6) uma imersão de aquecimento; (7) um borbulhador encamisadas; e (8) a cânula e o coração. (B), este painel mostra o set-up para a excisão de canulação e órgão para um fluxo de trabalho otimizado: (1) um copo de 100 mL com 50 mL de CB gelada; (2) uma seringa de 10 mL com CB gelada; (3) uma placa de Petri com CB gelada; (4) uma fonte de luz; (5) a cânula sob medida com uma canulação do nó (ver também Figura 3A e 3B); (6) fórceps fino, curvado; (7) pinça de tecido; pinça fina (8), em ângulo de 45°; (9) tesoura cirúrgica abdominal; (10) tesoura cirúrgica bem; (11) 4 x 30 agulhas G; e (12) uma agulha 15g. (C), este painel mostra o equipamento montado no microscópio para a imagem latente confocal: eletrodos estimulador elétrico (1); (2) uma caneta superfusion; (3) um prato de vidro de fundo com os ACMs; e (4) eletrodos estimulador elétrico platina imerso. (D) este painel mostra a montagem de microscópio para a imagem latente confocal: (1) o microscópio confocal; (2) uma caneta superfusion; (3) um reservatório superfusion de buffer; (4) um regulador de fluxo superfusion; (5) um superfusion aquecimento módulo; (6) uma estação de trabalho do computador; e (7) um estimulador elétrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: equipamentos feitos sob medido. (A), este painel mostra o manipulado 15 G cânula com um conector Luer-lock. As setas indicam dois recuos para os maçaricos de canulação. (B) estes são os nós de canulação, dois nós de overhand dobro colocados uns sobre os outros para o aperto rápido. As setas indicam onde e em que ordem o nó precisa ser apertado. (C), este painel mostra o dispositivo de controle de pressão montado. Uma agulha de borboleta 21G está ligada a uma pinça de tripé. A mangueira deve ser mantida a mesma altura que a agulha. A parte superior do parafuso é aberto. A elevação da mangueira borboleta pode ser alterada conforme indicado pelas setas para mudar a pressão intraluminal do átrio esquerdo. (D) esquerda átrio é perfurado com o dispositivo de controle de pressão. Esta imagem mostra um átrio esquerdo idealmente inflado. A elipse marca a colocação do nó de overhand. (E) esquerda átrio é perfurado com o dispositivo de controle de pressão. Esta imagem mostra uma super inflada da aurícula esquerda, que resultará em um menor rendimento de ACMs viáveis. A elipse marca a colocação do nó de overhand. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Com 21 semanas de idade, 60 – 90% dos ACMs viáveis (estima-se, como descrito no passo 6.1), após a readequação de cálcio (passo 5.4 – 5.7), pode ser isolado de ratos obesos ZSF-1 por esse método (Figura 4A). Em ratos, ACMs são caracterizados por uma diferente e mais fenótipo heterogêneo em relação ao VCMs24,25. Figura 4B mostra um ACM individual com membranas preservadas e estrutura do sarcômero, ambos fortes indicadores de uma célula funcionalmente integral.
As ACMs adquiridas podem ser processadas em uma variedade de maneiras. Como exemplificado na Figura 5, as células podem ser carregadas com corantes fluorescentes usados para estudar a morfologia e/ou função. Por exemplo, di-8-ANEPPS foi usado para delinear o sistema tubular em uma célula de rato atrial (Figura 5A). Em um outro conjunto de experimentos, mitocôndrias de coloração vermelho-fluorescência longe corante (por exemplo, mitotracker-vermelho-FM) é empregado para detectar mitocôndria citosol (Figura 5B) em remodelação atrial. Como mostrado na Figura 5, ACMs isolados com este protocolo também são adequados para viver-pilha Ca2 + imagem e mostram intacto acoplamento com um 1 Hz excitação-contração campo-estimulação. Todas as imagens podem ser usadas para posterior análise utilizando uma variedade de algoritmos disponíveis ao pesquisador6,7 (Figura 5).
Figura 4: respectivo rendimento do am viável, single-cell (A), este painel mostra o rendimento de um isolamento após a readequação das ACMs de 1 mM Ca2 + no NT. (B), este painel mostra um casos atrial isolado, single-cell. A estrutura do sarcômero, núcleo e membrana celular são claramente visíveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: coloração de rato ACMs com corantes fluorescentes. (A) este painel mostra a coloração de uma rede tubular com o corante fluorescente Di8ANNEPS e membrana celular. (B), este painel mostra a coloração das mitocôndrias com o corante fluorescente mitotracker-vermelho-FM (C) este painel mostra a verificação de linha transversal de um Ca2 +-excitação com o corante fluorescente Fluo4-AM ao longo de uma única célula. As setas indicam a estimulação elétrica, realizada de 1 Hz. (D) este painel mostra os longitudenal Ca2 + transientes derivados painel C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, primeiro descrevemos um protocolo para o isolamento de célula única ACMs de um modelo do rato de MetS-relacionados HFpEF que mostra marcada remodelação atrial22. O procedimento é excepcionalmente desafiador como tecido adiposo excessivo pode fazer a preparação cirúrgica, bem como a canulação da aorta, cada vez mais difícil. O guia de solução de problemas fornecidas na tabela 2 endereços os problemas mais comuns do processo de isolamento.
| Problema | Possível causa | Solução |
| Não há fluxo através da mangueira borboleta | Fechamento impróprio da aorta com os maçaricos de canulação | Remover tecido adiposo antes de apertar |
| Adicionar 3 nó de canulação com respectivo recuo | ||
| Puxe o nó com a mão para maior força | ||
| Agulha bloqueada | Reajustar a posição no lúmen | |
| Desbloquear por tração suave com seringa | ||
| Átrio direito / seio coronário não inflado | Fechamento impróprio da base do coração | Fluxo de bloco com nodos adicionais |
| Átrio direito danificado durante a preparação | Feche o escapamento com clipes/nodos | |
| Má digestão / átrio não amolecer. | Atividade enzimática reduzida através de temperatura errada | Ajustar a temperatura de 37 ° C |
| Enzima inativa/degradado | Substitua | |
| Velho/excessivamente fibrótico átrio | Aumentar o tempo de digestão (em passos de + 50%) | |
| Válvula da aorta danificada | Penetração superficial durante a cateterização | |
| Rendimento de célula pobre | Átrio over digerido | Diminuir o tempo de digestão (em passos de + 25%) |
| Reduzir a pressão intraluminal abaixando a mangueira de borboleta | ||
| Átrio sob digerido | Aumentar o tempo de digestão (em passos de 25%) | |
| Aumentar a pressão intraluminal levantando a mangueira de borboleta | ||
| Dispersão de célula muito agressiva | Ser mais gentil |
Tabela 2: guia de solução de problemas. Esta tabela exibe problemas comuns do procedimento de isolamento e suas respectivas soluções.
Em um estudo recente, mostramos que o ZFS-1 modelo de rato obeso apresenta extensa remodelação atrial com um aumento atrial tamanho22. Um aumento no tamanho atrial esquerdo tem sido reconhecido como um importante marcador prognóstico para disfunção diastólica26 e faz com que uma rarefication dos vasos microvasculares em relação ao tecido. Isto leva a uma diminuição da distribuição do buffer digestivo através da perfusão retrógrada da aorta durante o procedimento de isolamento, o isolamento de célula única neste modelo especialmente desafiador de renderização. Outras características de marca do remodelamento atrial, fibrose atrial e aumento da fibrose têm sido mostradas para ratos ZDF — um modelo do rato para diabetes metabólica e uma estirpe do ZFS1 ratos27. Depósitos de colágeno prejudicam a eficácia das enzimas digestivas para libertar o cardiomyocytes da matriz extracelular e, portanto, necessitar de mais ajustes do isolamento celular procedimento28.
O mecanismo pelo qual o dispositivo de pressão facilita os resultados de isolamento melhorada neste modelo de remodelação atrial é provavelmente relacionados a uma atenuação localizada do fluxo sanguíneo coronariano do átrio esquerdo. Um componente importante do fluxo sanguíneo coronário é a pressão de perfusão coronariana, que é definido como o gradiente entre a pressão de artéria coronária e a diastólica final da respectiva cavidade29. Durante o procedimento descrito, um bloqueio da base coração leva a um aumento global de pressão arterial coronariana e pressão intraluminal por todo o coração. A punção posterior do átrio esquerdo facilita uma gota local, seletiva de pressão intraluminal na cavidade atrial esquerda. Assim, não só um gradiente de pressão de perfusão coronariana grande é estabelecido, mas o volume de perfusão é também aumentou a solução de digestão desviadas do ventrículo esquerdo congestionada para o átrio esquerdo.
Além disso, a escolha de enzimas de digestão é crucial para o isolamento de ACM: purificado misturas de enzima de colagenase I e II foram mostrados para ser superior a menos visadas e menos puras enzimas colagenases30. Esta enzima não só permite um maior rendimento de cardiomyocytes morfologicamente e funcionalmente intactos, mas também minimiza qualquer aglutinação de células únicas após seu isolamento31. Enzima purificada misturas de colagenases com um dispase adicional de elevado ou médio thermolysin conteúdo são mais comumente usados para isolamento de casos do rato. Enquanto o VCMs são melhor isolados em altas concentrações, os melhores resultados de myocytes atrial foram adquiridos com uma concentração de 0,195 Wünsch unidades/mL, usando este protocolo32.
Como a prevalência de HFpEF relacionados com MetS está subindo2 e cardiomiopatias atrial atrial e principais à remodelação atrial fibrilação são altamente clinicamente relevantes, investigação neste domínio é de interesse fundamental. Muitos novos modelos animais para HFpEF estão surgindo33,34 e atrial remodelação em consonância com um aumento da incidência de distúrbios do ritmo atrial são características da marca registrada da doença. O método descrito permite que os pesquisadores isolar cardiomyocytes única viável de modelos do rato com remodelamento atrial para um estudo mais aprofundado com um rendimento excepcionalmente elevado e preservada a função mecânica e elétrica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo DZHK (centro alemão de pesquisa Cardiovascular, D.B.), o EKFS (Else-Kröner-Fresenius Stiftung, F.H.) e pelo BMBF (Ministério alemão de educação e pesquisa), bem como a BIH-Charité financiados pelo programa cientista clínico por Charité - Universitätsmedizin Berlim e Berlim Institute of Health (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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